菌酶協(xié)同發(fā)酵改善玉米-豆粕型飼料營養(yǎng)價值的研究

IMCTT 2018-4-26 09:26

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簡介

近年來，隨著飼用抗生素使用的逐步受限，如何保障畜禽健康成為我國畜牧業(yè)的一大挑戰(zhàn)。

　　導讀

　　近年來，隨著飼用抗生素使用的逐步受限，如何保障畜禽健康成為我國畜牧業(yè)的一大挑戰(zhàn)。玉米和豆粕是目前仔豬生產上主要的飼料原料，而豆粕中的抗原蛋白、胰蛋白酶抑制劑及植酸等抗營養(yǎng)因子會阻礙消化道吸收利用營養(yǎng)物質，不利于動物生長和健康。研究表明，生物發(fā)酵能有效降解飼料中的抗營養(yǎng)因子，促進養(yǎng)分的消化吸收，改善動物健康，減少飼用抗生素(促生長)的使用。選取合適的微生物進行飼料的發(fā)酵能有效降解飼料中的抗營養(yǎng)因子，促進養(yǎng)分的消化吸收，分泌的代謝產物如小肽，有機酸等利于改善動物健康。

　　目前乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌被廣泛引用于飼料發(fā)酵。其中，乳酸菌產生的有機酸、細菌素等代謝產物有利于改善飼料的營養(yǎng)品質，酵母菌能降解豆粕中的水蘇糖、棉子糖，而枯草芽孢桿菌對豆粕中抗原蛋白具有較強的降解效果。多菌株混合發(fā)酵理論上可以發(fā)揮不同菌株的發(fā)酵特性，但是不同菌株間存在可能存在拮抗作用，比如，當米曲霉和干酪乳桿菌直接混合發(fā)酵豆粕，會降低米曲霉對豆粕中抗原蛋白的降解效果。而采用菌酶協(xié)同發(fā)酵，可以提高發(fā)酵過程中微生物對飼料中大分子物質利用效率，如纖維素酶水解秸桿生成的單糖能為酵母菌合成菌體蛋白提供能量，進而提高飼料品質。

　　本研究以玉米、豆粕作為主要的發(fā)酵原料，通過單菌固態(tài)發(fā)酵比較不同菌株對飼料成分及營養(yǎng)價值的影響。進一步采用混菌發(fā)酵和菌酶協(xié)同的方式優(yōu)化飼料的發(fā)酵工藝，制備抗營養(yǎng)因子含量低同時乳酸含量高的生物發(fā)酵飼料。隨后通過仔豬飼喂實驗對比生物發(fā)酵復合飼料與并將發(fā)酵飼料飼喂仔豬，檢驗飼料對于仔豬生長性能的影響，為實際生產中的應用提供參考。

　　1材料與方法

　　1.1 實驗材料

　　實驗菌株:枯草芽孢桿菌BS12為本研究室自行分離的菌株，枯草芽孢桿菌CICC20076和枯草芽孢桿菌CICC20070:中國工業(yè)微生物菌株保藏管理中心(CICC);糞腸球菌EF(原始編號NCIMB10415):山東某公司;干酪乳桿菌LC和植物乳桿菌LP為本實驗室自行分離的菌株;釀酒酵母:中國工業(yè)微生物菌株保藏管理中心(CICC);

　　豆粕:浙江某生物發(fā)酵公司。
　　復合酶制劑:廣東某酶制劑公司。

　　主要儀器:Kjeltec8400全自動凱氏定氮儀:德國FOSS公司;L－8900全自動氨基酸分析儀:日本Hitachi公司;SpectraMax M5酶標儀:美國Molecular Devices公司等。

　　1.2 實驗方法

　　1.2.1 發(fā)酵菌株的篩選
　　取9g豆粕、9g玉米粉、2g麩皮于100mL三角瓶中攪拌均勻后配成復合飼料，于105℃滅菌15min，按接種量5%別加入枯草芽孢桿菌CICC20076、枯草芽孢桿菌CICC21076、枯草芽孢桿菌BS12、釀酒酵母CICC1520、糞腸球菌EF、干酪乳酸菌LC和植物乳桿菌LP的種子液，同時加入滅菌水至飼料總含水量為45%，發(fā)酵體系內菌濃度達到1.0×107CFU/g，攪拌均勻后于37℃恒溫培養(yǎng)，進行固態(tài)發(fā)酵。實驗根據(jù)菌的種類不同共設7個組，每組3個重復，其中枯草芽孢桿菌CICC20076組、枯草芽孢桿菌CICC21076組和枯草芽孢桿菌BS12組發(fā)酵24h，釀酒酵母CICC1520組發(fā)酵48h，糞腸球菌EF組、干酪乳酸菌LC組和植物乳桿菌LP組發(fā)酵48h。發(fā)酵結束后，將發(fā)酵飼料于60℃烘干，粉碎過60目篩后，測定發(fā)酵飼料中粗蛋白、豆粕抗原蛋白、中性洗滌纖維、酸溶蛋白以及乳酸含量。

　　1.2.2 混菌發(fā)酵菌株配比優(yōu)化實驗
　　將篩選出了芽孢桿菌BS12與糞腸球菌EF以不同比例添加入復合飼料，添加比如表1所示，按1.2.1方法先進行24h好氧發(fā)酵，再進行48h厭氧發(fā)酵，選取最優(yōu)的發(fā)酵比例。

　　1.2.3復合酶制劑對纖維降解效果
　　為彌補細菌對纖維降解的不足。本研究中采用復合酶(主成分為:纖維素酶、甘露糖酶、果膠酶)強化飼料纖維的降解。分別以質量比0.3%、0.5%、0.7%和1.0%加入復合飼料中，隨后經過枯草芽孢桿菌BS12和糞腸球菌EF分步發(fā)酵后，測定發(fā)酵飼料中中性洗滌纖維含量。

　　1.2.4 菌酶協(xié)同發(fā)酵對飼料氨基酸體外消化率的影響
　　兩步酶法測定發(fā)酵復合飼料的體外消化率參考Sakamoto等的方法進行。分別取3g發(fā)酵復合飼料和未發(fā)酵復合飼料，裝入150mL三角瓶中。加入30mL 10000U/mL的胃蛋白酶溶液(3000U/mg，Sigma)，用0.05mol/LKCl－HCl緩沖液調整至pH為2.0，隨后在39℃，150r/min條件下振蕩消化4h。隨后用1mol/LNaOH調整溶液pH為7.0，加入150mg胰蛋白酶(250U/mg，Sigma)于39℃，150r/min繼續(xù)消化4h。最后加入5mL20%的磺基水楊酸溶液終止反應，沉淀30min。消化后的溶液在3000r/min條件下離心15min，棄上清。剩余的殘渣在105℃條件下烘干處理4h，獲得殘渣樣本。參照國標《GB/T6432—1994》檢測發(fā)酵前后飼料中的粗蛋白含量，參照國標《GB/T18246—2000》檢測殘渣中粗蛋白和氨基酸的含量。體外消化率按照如下的公式計算:

　　1.3 仔豬飼養(yǎng)實驗

　　1.3.1 發(fā)酵飼料的制備
　　玉米、豆粕和麩皮按45%、45%和10%的比例混合均勻，取200kg的玉米豆粕復合飼料，按5%比例分別接種芽孢桿菌BS12、糞腸球菌EF和5%的復合酶制劑，初始濕度控制在40%左右，室溫條件下(30℃)好氧發(fā)酵24h后;隨后裝入厭氧發(fā)酵袋，室溫條件下厭氧發(fā)酵48h后烘干粉碎待用。

　　1.3.2 動物實驗
　　選取192頭體重在(9.35±0.65)kg的49日齡健康仔豬(Duroc×Largewhite×Yorkshire)，隨機分配至兩個處理組，每個處理6個重復，每個重復16頭。處理組1飼喂玉米豆粕基礎日糧(對照組)，日糧中添加100mg/kg喹乙醇和50mg/kg吉他霉素;處理組2以10%發(fā)酵飼料替代基礎日糧中的玉米和豆粕(發(fā)酵飼料組)，且日糧中不添加抗生素，實驗期為24d。于實驗期1d及24d稱取仔豬初始體重及末重，每日記錄采食量、計算平均日增重。實驗日糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

　　1.4 指標測定及方法

　　飼料中抗原蛋白含量的測定采用龍科方舟試劑盒根據(jù)酶聯(lián)免疫(ELISA)法進行測定;粗蛋白的測定參照《GB/T6432—1994》;粗脂肪的測定參照《GB/T6433—1994》;中性洗滌纖維的測定參照《GB/T20806—2006》;飼料中鈣的測定參照《GB/T6436—2002》;總磷的測定參照《GB/T6437—2002》;酸溶蛋白的測定參照Mahmoudreza等的研究;飼料中乳酸采用羥基聯(lián)苯比色法測定;飼料pH采用pH計直接測定。

　　1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

　　采用SPSS19.0對實驗結果進行分析處理，采用ANOVA進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，所有結果均以平均數(shù)±標準差表示。

　　2結果

　　2.1 單菌發(fā)酵對飼料營養(yǎng)成分的影響

　　由表3可知，本實驗中枯草芽孢桿菌對復合飼料中的大豆球蛋白和β－伴球蛋白降解程度較強，其中枯草芽孢桿菌BS12的降解能力最高，對大豆球蛋白降解率為87.40%，β－伴球蛋白為76.60%。除此以外，枯草芽孢桿菌發(fā)酵后，飼料中酸溶蛋白含量高于其他類型的實驗菌株，其中BS12發(fā)酵飼料中酸溶蛋白含量最高，提高了4.8倍。而枯草芽孢桿菌對飼料中纖維的降解程度也高于其他菌株。其中枯草芽孢桿菌BS12對中性洗滌纖維的降解率達到30.20%。相較于枯草芽孢桿菌和酵母菌，三株乳酸菌(糞腸球菌EF、干酪乳桿菌LC和植物乳桿菌LP)的產乳酸能力較強，其中，糞腸球菌EF最強，發(fā)酵48h后飼料中乳酸含量達到110.53mmol/kg。

　　為了實現(xiàn)降低飼料抗營養(yǎng)因子，提高飼料乳酸含量的效果，本研究采用枯草芽孢桿菌BS12與糞腸球菌EF進行混菌發(fā)酵實驗。

　　2.2 混菌發(fā)酵

　　如表4所示，枯草芽孢桿菌BS12的比例提高有利于提高飼料中抗原蛋白的降解率和酸溶蛋白的含量。盡管糞腸球菌EF的含量減小，飼料中乳酸含量差異并不顯著。采用當飼料中總菌量達到1.0×107CFU/g，芽孢桿菌BS12和糞腸球菌比例8∶1時，進行先好氧發(fā)酵24h，再厭氧發(fā)酵48h，飼料中大豆球蛋白含量減少至8.31mg/g，β－伴球蛋白含量降低至6.44mg/g，酸溶蛋白相較發(fā)酵前提高6.16倍，乳酸含量達到116.57mg/g。

　　2.3 菌酶協(xié)同發(fā)酵對飼料營養(yǎng)成分的影

　　由表5可知，添加纖維素酶、甘露糖酶及果膠酶制備的后，發(fā)酵飼料中性洗滌纖維降解程度提高。添加量為0.30%、0.50%、0.70%和1.00%時，相較于未發(fā)酵飼料，中性洗滌纖維降解率分別為35.41%、39.36%、40.32%和40.61%。但是抗原蛋白降解程度及乳酸含量變化并不顯著。

　　2.4 菌酶協(xié)同發(fā)酵對飼料氨基酸消化率的影響

　　由圖1可見，經過發(fā)酵后，飼料中粗蛋白消化率也得到提高，6種必需氨基酸和5種非必須氨基酸體外消化率得到顯著提高。其中，蛋氨酸、苯丙氨酸分別提高15.15%和17.60%，丙氨酸，半胱氨酸，色氨酸分別提高了10.11%、10.05%和9.89%，粗蛋白消化率整體提高6.94%。

　　2.5 仔豬飼喂效果

　　由表6可知，相較于添加抗生素的對照組，飼料中添加10%的發(fā)酵飼料有利于提高采食量和日增重。較于對照組，發(fā)酵飼料組仔豬料肉比和腹瀉率相差異并不顯著。

　　3討論

　　通過生物發(fā)酵降低飼料中抗營養(yǎng)因子的含量，從而提高動物對飼料養(yǎng)分的消化利用率，已成為飼料工業(yè)發(fā)展的重要方向。目前研究多為發(fā)酵單一原料，如發(fā)酵豆粕、發(fā)酵菜粕和發(fā)酵DDGS。但是對于混合原料發(fā)酵的研究并不充分。本研究以玉米、豆粕和麩皮配制成混合原料，采用枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、糞腸球菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌進行發(fā)酵實驗，通過比較不同菌株對飼料中抗原蛋白降解程度、纖維降解程度及發(fā)酵后飼料中乳酸含量的影響，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌對飼料原料中蛋白和纖維的降解程度更高，乳酸菌產乳酸能力更強。Chi等也發(fā)現(xiàn)相較于酵母菌和乳酸菌，解淀粉芽孢桿菌對豆粕蛋白的降解程度更高。這可能是由于芽孢桿菌能分泌大量蛋白酶和纖維素酶，對大分子蛋白和纖維降解能力較強。乳酸菌雖然可以發(fā)酵產生乳酸，但是在固態(tài)發(fā)酵中對飼料中抗原蛋白的降解能力不強。

　　為綜合芽孢桿菌對豆粕抗原蛋白的降解特性與乳酸菌的產乳酸特性，本研究選取了枯草芽孢桿菌中對蛋白和纖維降解性較能強的BS12和乳酸菌中產酸能力較強的糞腸球菌EF進行混菌發(fā)酵實驗。但是，枯草芽孢桿菌為好氧細菌，而糞腸球菌為兼性厭氧細菌，完全進行好氧發(fā)酵或厭氧發(fā)酵會抑制其中一種菌的生長。Chen等采用分步發(fā)酵的方法用米曲霉先降低豆粕中的抗原蛋白，再用干酪乳桿菌發(fā)酵提高乳酸含量，降低豆粕pH。曲露等采用先好氧再厭氧的分步發(fā)酵方式，先降低菜籽粕中的硫甙和植酸，并提高粗蛋白及小肽含量，再通過厭氧發(fā)酵增加有機酸提高風味。本研究采用同步加菌，先好氧發(fā)酵24h，再厭氧發(fā)酵48h的工藝。分步發(fā)酵降低了飼料中的抗原蛋白，且抗原蛋白降解程度和BS12單菌發(fā)酵相似，而乳酸含量也與EF單菌發(fā)酵結果相當。這說明，分步發(fā)酵工藝同樣適用于玉米－豆粕型復合飼料的發(fā)酵。

　　飼料原料中含有大量的植物纖維。其中中性洗滌纖維過高會增加食糜黏度，阻礙其在仔豬腸道內的正常推進，增強飽腹感，降低采食量。非淀粉多糖酶有助于分解細胞壁，釋放營養(yǎng)成分，提高干物質、有機物及粗蛋白的消化利用率。本研究采用通過添加復合酶對發(fā)酵飼料進一步優(yōu)化。結果顯示，發(fā)酵過程添加非淀粉多糖復合酶(纖維素酶、甘露糖酶和果膠酶)，進一步降低了飼料中的中性洗滌纖維含量。發(fā)酵后，粗蛋白、蛋氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸，半胱氨酸和色氨酸的體外消化率提高明顯。其中，蛋氨酸、丙苯氨酸和色氨酸是豬日糧中的必需氨基酸，而半胱氨酸是半必需氨基酸。倪良振等研究發(fā)現(xiàn)，在含5.8%酸性洗滌纖維的日糧中添加纖維素酶極顯著提高煙臺黑豬對蛋氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸的回腸表觀消化率。因此，采用非淀粉多糖酶和枯草芽孢桿菌、糞腸球菌協(xié)同發(fā)酵降解飼料中的大分子蛋白和纖維，產生小分子肽和游離氨基酸，更有利于仔豬對氨基酸的消化利用。

　　仔豬飼喂實驗進一步證明，相較于添加了抗生素的對照組，采用10%的菌酶協(xié)同發(fā)酵復合飼料有利于提高仔豬生長性能，且料肉比和腹瀉率并未發(fā)生顯著變化。

　　4結論

　　本研究通過發(fā)酵實驗篩選了1株高效降解豆粕抗原蛋白的枯草芽孢桿菌BS12和1株產乳酸能力較強的糞腸球菌EF，用于玉米豆粕型復合飼料的發(fā)酵。結果顯示，將BS12與EF按總菌量1.0×107CFU/g，菌量比8∶1接種于復合飼料，同時接入0.5%的復合酶，發(fā)酵72h，可降解飼料中80%的大豆抗原蛋白，且乳酸含量達到122.18mmol/kg。所得發(fā)酵復合飼料提高了仔豬采食量和日增重，有利于提高仔豬生長性能，減少飼用抗生素使用。

　　注：本文由生物飼料開發(fā)國家工程研究中心（BFC）小編整理發(fā)布，如有任何建議或意見及投稿等，請您加小編微信（13260429991）交流互動。
　　參考文獻略
　　責編：馬維軍；審閱：于繼英博士
　　來源：中國糧油學報；作者：張煜，石常友，王成等等

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