 腐殖酸鈉是用化學(xué)方法從風(fēng)化煤、褐煤、泥炭中提出的一種有機(jī)弱酸鹽，形狀是棕黑色的輕質(zhì)粉末，易溶于水，呈弱堿性，水溶液呈醬油色膠體溶液，它具有較強(qiáng)的吸附力和絡(luò)合力，釋放初生態(tài)，從而對(duì)某些細(xì)菌的生長(zhǎng)有抑制作用（宦海霞等，２０１０）。眾所周知，大腸桿菌是寄居在人和溫血?jiǎng)游锬c道中的正常菌群之一，少數(shù)具有致病性（韓立新等，２０１２）。大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的一種以敗血癥和劇烈腹瀉為特征的急性傳染病，常呈地方性流行或散發(fā)（姚新玲等，２０１０）。據(jù)新疆阿克蘇地區(qū)畜牧獸醫(yī)站報(bào)道，產(chǎn)前或長(zhǎng)期給母豬飼喂腐殖酸鈉，可使所產(chǎn)仔豬對(duì)腸道已有的大腸桿菌有較強(qiáng)的抵抗力（蔣安文等，２０００）。走訪牧區(qū)蒙古族牧民，發(fā)現(xiàn)牧民在養(yǎng)羊過(guò)程中使用腐殖酸鈉預(yù)防治療羊腹瀉。由于腐殖酸鈉結(jié)構(gòu)復(fù)雜，對(duì)大腸桿菌作用效果不明，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)分離于羊腸道的２株大腸桿菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，并對(duì)其細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察來(lái)研究腐殖酸鈉對(duì)大腸桿菌是否有抑制作用，以期為今后深入探討腐殖酸鈉抑制大腸桿菌的機(jī)制提供理論依據(jù)。 1、材料與方法 1.1 材料 供試菌株大腸桿菌 Ｃ１２５、Ｃ７８４均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院提供。腐殖酸鈉購(gòu)于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，含量大于９９％。 1.2 菌種活化 將供試菌株大腸桿菌 Ｃ１２５、Ｃ７８４分別接種于 ＬＢ斜面培養(yǎng)基上，于３７ ℃下培養(yǎng)２４ｈ進(jìn)行活化傳２代。 1.3 稀釋平板計(jì)數(shù)法 取活化培養(yǎng)好的菌株，用無(wú)菌生理鹽水稀釋接入細(xì)菌計(jì)數(shù)液體培養(yǎng)基，使其終濃度為１０６ ＣＦＵ／ｍＬ。分別添加５％、１０％、１５％腐殖酸鈉（ｍ／Ｖ），等量取出不同添加水平腐殖酸鈉菌液調(diào)節(jié)ｐＨ７．３，３７ ℃靜置培養(yǎng)。依菌株生長(zhǎng)情況，取樣時(shí)間選擇為４、１２、２４、４８ｈ，細(xì)菌計(jì)數(shù)固體培養(yǎng)基（ｐＨ７．０）稀釋平板法計(jì)數(shù)菌落（ＣＦＵ／ｍＬ），以不加腐殖酸鈉的細(xì)菌培養(yǎng)液為空白對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)３次。測(cè)定不同水平腐殖酸鈉及不同水平腐殖酸鈉調(diào)節(jié)ｐＨ 后對(duì)大腸桿菌活菌數(shù)的影響。 1.4 透射電鏡觀察 選擇大腸桿菌 Ｃ７８４菌株，分別接種于添加５％腐殖酸鈉、添加５％腐殖酸鈉調(diào)節(jié)ｐＨ７．３和 空 白 ＬＢ 固 體 培 養(yǎng) 基 中，３７ ℃培 養(yǎng)２４ｈ后收集菌體，按電鏡樣品制備及超薄切片技術(shù)（朱麗霞，１９８３）操作，用移液槍沿管壁緩慢加入３％戊二醛固定液，４℃靜置１５～３０ｍｉｎ；１００００～１３０００ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，棄上 清；用 吸 管 沿 管 壁 緩 慢 加 入３％戊二 醛，再 用 １％ 四 氧 化 鋨 固 定，丙 酮 逐 級(jí) 脫 水，Ｅｐｏｎ８１２樹(shù)脂包埋，超薄切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，Ｈ－７０００型透射電鏡觀察。 1.5 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 ＳＰＳＳ１０．０統(tǒng)計(jì)軟件中 Ｏｎｅ－ＷａｙＡＮＯＶＡ 程序進(jìn)行方差分析和 ＬＳＤ法進(jìn)行顯著性差異分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以Ｐ＜０．０５為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。 2、結(jié)果與分析 2.1 添加不同水平腐殖酸鈉對(duì)大腸桿菌活菌數(shù)的影響 由表１可知，大腸桿菌 Ｃ１２５、Ｃ７８４活菌數(shù)均隨腐殖酸鈉添加量的增加，抑菌效果逐漸增強(qiáng)。其中大腸桿菌 Ｃ１２５在４和１２ｈ時(shí)，各濃度間大腸桿菌活菌數(shù)差異顯著（Ｐ＜０．０５）；２４和４８ｈ時(shí)，添 加５％、１０％、１５％腐殖酸鈉組大腸桿菌活菌數(shù)與對(duì)照組相比差異顯著（Ｐ＜０．０５），且添加１０％、１５％腐殖酸鈉組與添 加５％腐 殖 酸 鈉 組 相 比 差 異 顯 著（Ｐ＜０．０５）。大 腸 桿 菌 Ｃ７８４在４ｈ時(shí) 的 活 菌 數(shù) 僅 添 加１５％腐 殖 酸 鈉 組 與 對(duì) 照 組 相 比 差 異 顯 著 （Ｐ ＜０．０５），其他組間差異均不顯著（Ｐ＞０．０５）；１２ｈ時(shí)，添加１０％、１５％腐殖酸鈉組大腸桿菌活菌數(shù)與對(duì)照組相比差異顯著（Ｐ＜０．０５），而添加５％腐殖酸鈉組與對(duì)照組相 比 差 異 不 顯 著（Ｐ＞０．０５）；當(dāng) 時(shí) 間 延 長(zhǎng)到２４和４８ｈ時(shí)，各處理組大腸桿菌活菌數(shù)與對(duì)照組相比均差異顯著（Ｐ＜０．０５）。 2.2 添加不同水平腐殖酸鈉調(diào)節(jié)ｐＨ后對(duì)大腸桿菌活菌數(shù)的影響 由表２可知，調(diào)節(jié)ｐＨ后，大腸桿菌 Ｃ１２５、Ｃ７８４活菌數(shù)均隨腐殖酸鈉添加量的增高而降低。其中大腸桿菌 Ｃ１２５在４、１２和２４ｈ時(shí)，各處理組大腸桿菌活菌數(shù)與對(duì)照組相比均差異顯著（Ｐ＜０．０５）；４８ｈ時(shí)，添加１０％、１５％腐殖酸鈉組與對(duì)照組相比均差異顯著（Ｐ＜０．０５），而添加５％腐殖酸鈉組大腸桿菌活菌數(shù)與對(duì)照組相比差異不顯著（Ｐ＞０．０５）。大腸桿菌 Ｃ７８４在４ｈ時(shí)，各處理組大腸桿菌活菌數(shù)與對(duì)照組相比差異均不顯著 （Ｐ＞０．０５），時(shí)間延長(zhǎng)到１２、２４和４８ｈ時(shí)，各處理組大腸桿菌活菌數(shù) 與 對(duì) 照 組 相 比 均 差 異 顯 著（Ｐ＜０．０５），且各處理 組 間 差 異 顯 著（Ｐ＜０．０５）。調(diào) 節(jié) ｐＨ 后，腐殖酸鈉對(duì)２株大腸桿菌依然有抑制作用，對(duì)于不同菌株抑制作用有差異。 2.3 透射電鏡觀察結(jié)果 經(jīng)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，添加５％腐殖酸鈉組的大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)固縮，出 現(xiàn) 空斑，細(xì)胞質(zhì)解體形成小空泡，并連接成大空泡成為空腔（圖１Ａ、１Ｂ、１Ｃ）；而添加５％腐殖酸鈉調(diào)節(jié)ｐＨ 組的大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量空泡，且空泡多集中在細(xì)胞膜周?chē)▓D１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ）；對(duì)照組大腸桿菌菌體呈棒狀，細(xì)胞壁完整、邊緣清晰、平整，無(wú)缺陷，無(wú)裂痕，無(wú)質(zhì)壁分離現(xiàn)象，細(xì)胞質(zhì)、核致密均勻（圖１Ｇ、１Ｈ、１Ｉ）。   ３、討論 隨著腐殖酸鈉本身化學(xué)結(jié)構(gòu)、分離提純技術(shù)方面研究的不斷深化，其藥用價(jià)值逐漸體現(xiàn)，而腐殖酸鈉對(duì)有害菌抑制作用方面的研究較少。現(xiàn)階段研究表明，腐殖酸鈉不僅內(nèi)服、外用均無(wú)不良反應(yīng)，且靜脈注射亦未見(jiàn)到中毒發(fā)生和任何副作用。夏學(xué)鵬等（２００９）用含３０％腐殖酸鈉的水溶液對(duì)１４窩１１２頭初生仔豬白痢病進(jìn)行治療試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，仔豬按體重服藥（２．５ｋｇ體 重 每 次５ｍＬ／頭，２．５ｋｇ以 上 體重每次１０ｍＬ／頭），２次／ｄ，對(duì)仔豬白痢病具有良好的治療效果，治療中除３頭仔豬未愈外，其余１０９頭仔豬均在服藥后３ｄ內(nèi)治愈，治愈率達(dá)９６％，表明腐殖酸鈉對(duì)治療仔豬白痢病具有見(jiàn)效快、成本低、復(fù)發(fā)率低的優(yōu)勢(shì)。腐殖酸鈉之所以對(duì)動(dòng)物拉稀、痢疾療效較好，主要是它為高分子絡(luò)合物，并含生物堿，故對(duì)于腸道炎性物和有毒物質(zhì)有較強(qiáng)的吸附力，同時(shí)對(duì)腸道黏膜具有收斂作用，由于腐殖酸鈉結(jié)構(gòu)中含有各種活性基團(tuán)，從而能收縮血管，降低毛細(xì)血管滲透性，起到消炎止血作用，因此具有增強(qiáng)機(jī)體免疫的能力。目前腐殖酸鈉對(duì)細(xì)菌的體外抑菌試驗(yàn)文獻(xiàn)報(bào)道極少，本試 驗(yàn) 在 這 方 面 進(jìn) 行 了 初 步 嘗 試，結(jié) 果 表明，初始不同腐殖酸鈉添加水平對(duì)大腸桿菌 Ｃ１２５均有抑制作用，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用趨于一致；而對(duì)于大腸桿菌 Ｃ７８４，初始只有腐殖酸鈉添加量足夠高才會(huì)對(duì)其起到抑制作用，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，組間差異越來(lái)越顯著。不同水平腐殖酸鈉添加水平作用于大腸桿菌 Ｃ１２５和 Ｃ７８４，在２４ｈ時(shí)，活 菌 數(shù) 與 對(duì) 照組相比顯 著 降 低。在 添 加 不 同 水 平 腐 殖 酸 鈉 調(diào) 節(jié)ｐＨ 試驗(yàn)中，大腸桿菌不同菌株活菌數(shù)的改變基本一致。腐殖酸鈉作 用 于２株 大 腸 桿 菌，調(diào) 節(jié) ｐＨ 與否在１２ｈ后均能達(dá)到抑制大腸桿菌的目的。透 射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，腐殖酸鈉可使大腸桿菌細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，使細(xì)胞異常生長(zhǎng)，抑制對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分裂，使細(xì)胞質(zhì)稀薄，細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)空泡，表明腐殖酸鈉可有效抑制大腸桿菌生長(zhǎng)。腐殖酸鈉對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制作用主要原因有：①腐殖酸鈉改變了菌液ｐＨ 使菌處于過(guò)堿環(huán) 境，從 而 使 大 腸 桿 菌 的生長(zhǎng)繁殖受到抑制；②腐殖酸鈉形成柔性的兩性空間構(gòu)象后與細(xì)胞內(nèi)膜作用，擾亂了膜脂分子的排列，改變了細(xì)胞膜的通透性，影響細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，在細(xì)胞膜上形成了許多孔道，致使細(xì)胞內(nèi)的原生質(zhì)擴(kuò)散并從孔道向胞外滲漏，造成紫外吸收值升高，影響了細(xì)菌的代謝系統(tǒng)，隨著細(xì)菌細(xì)胞膜破損，最終引起細(xì)胞完全解體，從而起到抑菌、殺菌作用（宮霞等，２００７）。 4、結(jié)論 本試驗(yàn)結(jié) 果 表 明，添 加５％、１０％、１５％腐 殖 酸鈉可使大腸桿菌活菌數(shù)明顯降低；同一菌株隨腐殖酸鈉添加量增加，抑制效果越顯著；不同菌株在相同處理?xiàng)l件下，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用越明顯。 作者：娜仁高娃 來(lái)源：預(yù)混料家園 |
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