取4豫多聚甲醛固定的空腸組織樣品，用Moxvry(AB-PAS)染色法，對杯狀細胞進行染色。具體方法參考操作步驟簡述如下:切片脫蠟至水后，用3%醋酸液、阿利新蘭液和3%醋酸液處理后，蒸餾水洗，再用0.5%過碘酸氧化后水洗，經(jīng)schiff液染色后水洗，脫水、二甲苯透明、樹脂膠封片。在400倍的視野下隨機選10個視野，用Image Plus 5.0圖像分析軟件統(tǒng)計光密度值(I0D)，將10個視野I0D值的平均值作為該張切片的統(tǒng)計結(jié)果。
1.5.6 空腸黏膜緊密連接蛋白基因相對表達量
使用總RNA試劑盒（Takara)RNAiso試劑盒(Takara,中國大連）。cDNA的合成采用primeScript RT試劑盒（Takara,中國大連），real-time PCR采用SYBR Premix ExTaq(Takara，中國大連)。采用Applied Biosystems 7900 HT Real Time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，CA)進行PCR擴增反應，具體反應條件參考試劑盒說明書。基因表達水平的計算參考K.J.Livak和T.D.Schmittgen文獻中的方法。采用384孔板，每個樣品測定3個平行?；蛳鄬Ρ磉_量采用2-△△CT法分析，內(nèi)參基因選用GADPH。以6mm的小麥粉碎粒度為對照組，引物設計使用primer3.0軟件，測定肉雞空腸黏月旲緊密連接基因：Occludin 、ZO-1、Claudinl mRNA的相對表達豐度?；蛞镄蛄腥绫?所示。
空腸是營養(yǎng)物質(zhì)吸收的重要部位，其發(fā)育狀況直接影響營養(yǎng)代謝和生長性能。本試驗結(jié)果表明，小麥粉碎粒度對肉雞空腸腸道形態(tài)存在顯著的影響。21 d 時，隨著小麥粉碎粒度的增加，絨毛高度、黏膜厚度和絨隱比(V/C)顯著增加，且呈顯著的線性相關;42 d 時，10 mm組絨毛高度顯著增加，而6mm組隱窩深度顯著降低，6 mm組絨隱比顯著高于10 mm組。張春蘭等在蛋雞上的研究發(fā)現(xiàn)，十二指腸絨毛高度、V/C 值和腸黏膜厚度隨玉米粒度的增加而增加，隱窩深度降低。田玉民等發(fā)現(xiàn)，飼喂粗粉碎粒度的肉雞空腸絨毛顯著較高。這與本試驗結(jié)果一致?？赡苁怯捎诹６却蟮娘暭Z在消化道中流通時間較長，對腸絨毛及腸腺的刺激作用導致的。也可能與腸道微生物的變化有關，有研究表明，日糧的粉碎粒度對胃腸道微生物的發(fā)酵有影響，D.G.Valencia等研究發(fā)現(xiàn)，飼料粉碎越細，與消化道內(nèi)微生物的接觸面積越大，對有害微生物的生長越有利 。在肉仔雞上的研究也發(fā)現(xiàn)，飼喂粗顆粒粉狀日糧，盲腸和直腸內(nèi)的乳酸菌群數(shù)量增加，而細顆粒時乳酸菌數(shù)量最少。腸道中有害微生物的增加會破壞腸道結(jié)構(gòu)的黏膜層導致腸絨毛受損，進而導致腸道形態(tài)的變化。但也有不一致的報道，I.Rohe等研究發(fā)現(xiàn)，細粉碎組的絨毛均高于粗粉碎;A.M.Amerah等報道，玉米和小麥粉碎粒度對肉雞的十二指腸絨毛高度、隱窩深度及上皮黏膜厚率均無顯著性影響。造成這種不一致的結(jié)果可能與試驗階段、飼糧類型、實際粉碎粒度和消化道部位有關。
腸道四大屏障中，機械屏障是腸黏膜屏障中最重要的一環(huán)。由上皮細胞和它們之間的連接組成，細胞間連接生物在外環(huán)境的穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用，而緊密連接(TJ)是細胞連接最重要的組成成分。緊密連接蛋白的基因表達量是衡量腸上皮屏障功能的重要指標。ZhaoJ. 等發(fā)現(xiàn)Occludin和Claudin能夠通過影響TJ通透性維持來調(diào)節(jié)腸道物理屏障功能。本試驗研究表明，21d肉雞空腸ZO-1、occludin和claudinl mRNA相對表達量均隨小麥粉碎粒度的增大呈線性遞增。42 d ，ZO-1、occludin 和claudinl相對表達量均隨粉碎粒度的增大呈線性遞減。說明在1~21d 增大粉碎粒度有利于維持空腸黏膜機械屏障的完整性，利于腸道健康，但不是越大越好。關于飼料粉碎粒度對腸道緊密連接蛋白基因表達的研究未見報道。有研究表明，腸道上皮細胞緊密連接蛋白的基因表達量與腸道細菌的代謝產(chǎn)物有關。有害微生物黏附于腸道上皮細胞，會引起腸黏膜功能紊亂，TJ屏障被破壞。飼料粉碎粒度可能通過影響腸道微生物進而影響腸道黏膜緊密連接蛋白的基因表達，但其具體作用機理還需進一步研究。至于21 d 和42 d 緊密連接mRNA相對表達量隨小麥粉碎粒度的增大呈現(xiàn)不同的變化趨勢的原因也有待進一步研究。