Vero E6細(xì)胞來自ECACC，保存在DMEM中，添加10%熱滅活犢牛血清、2m ML谷氨酰胺和非必需氨基酸（均來自Gibco公司），細(xì)胞保存在37℃、5%二氧化碳濃度、>90%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。如前所述，ASFV-Ba71V分離物通過在Vero細(xì)胞上的菌斑試驗(yàn)進(jìn)行繁殖和滴定。
2.2 病毒感染和藥物治療
采用DMEM培養(yǎng)基將亞融合Vero細(xì)胞在6孔板上培養(yǎng)至每cm2約5萬個(gè)細(xì)胞，并以0.1倍（MOI=0.1）的倍數(shù)感染ASFV-Ba71V。病毒吸附1小時(shí)后，取出接種物，用DMEM洗滌細(xì)胞2次。感染4小時(shí)后，ASFV感染的Vero細(xì)胞從第一代至第四代暴露于30個(gè)喹喏酮類藥物，分別是：萘啶酸，氟甲喹，環(huán)丙沙星，依諾沙星，氟羅沙星，洛美沙星，那氟沙星，氧氟沙星，諾氟沙星，巴洛沙星，格雷沙星，左氧氟沙星，帕珠沙星，司帕沙星，托氟沙星，貝西沙星，克林沙星，加雷沙星，吉米沙星，莫西沙星，加替沙星，西他沙星，達(dá)氟沙星，二氟沙星，恩諾沙星，馬波沙星，奧比沙星，普多沙星，沙氟沙星和新生霉素，分別是以下濃度500、400、300、200、100、75、50、25、10、5和1 ug/ml。所有藥物均購自Sigma公司和安徽五礦開發(fā)有限公司，以1 mg/ml (0.1 M PBS/NaOH)的原液配制。培養(yǎng)7天，每24小時(shí)更換含抗生素培養(yǎng)基。每天用藥物原液稀釋(10 mg/ml, 0.1 M PBS/NaOH稀釋)，制備工作溶液。除了感染細(xì)胞外，還包括使用暴露于最高濃度氫氧化鈉稀釋劑的感染細(xì)胞的作為對照。預(yù)防試驗(yàn)在ASFV感染前2小時(shí)添加抗生素，7天內(nèi)每24小時(shí)補(bǔ)充一次。
2.3 PCR檢測非洲豬瘟病毒（ASFV）DNA
使用通過本課題組前期所述的A238L編碼區(qū)的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測病毒DNA (Gilet al., 2003)，病毒DNA從感染的Vero細(xì)胞中提取，該Vero細(xì)胞未經(jīng)過氟喹諾酮類藥物商業(yè)試劑盒治療處理，提取步驟完成后，將1 ul DNA轉(zhuǎn)移到含有2.5 ul Taq緩沖液(10×)、1 ul MgCl2 (25 uM)、0.5 ul dNTP’s (10 uM)、15.3 ul ddH2O、0.2 ul Taq、0.25 ul各引物(100 uM)、正向(5’- GGCCGTACTTCAAATGTGCT-3’)和反向(5’- CCAGTCCCAAGCAGTAAAGC -3’)的PCR 混合液中，共25 ul。PCR反應(yīng)如下：94℃2分鐘，95℃變性30秒，42℃退火30秒，72℃擴(kuò)展1分鐘，最后72℃擴(kuò)展10分鐘。以2%的溴化乙錠瓊脂糖凝膠為載體，在紫外光下觀察擴(kuò)增產(chǎn)物(預(yù)測720bp)。7天后，用培養(yǎng)上清液感染新的Vero細(xì)胞培養(yǎng)，重復(fù)上述步驟。
2.4 脈沖式凝膠電泳（PFGE）
Ba71V分離物分別以MOI為0.1、1和5感染Vero細(xì)胞，并在感染16小時(shí)后收集，經(jīng)胰蛋白酶處理之后，將4×105個(gè)細(xì)胞包埋在低熔點(diǎn)瓊脂糖塞子中，并且在固定之后，將來自每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的塞子轉(zhuǎn)移到含有2ml裂解緩沖液（125 mM EDTA, pH 8.0,1.2% SDS和蛋白酶K）的試管中50℃24小時(shí)，然后在24小時(shí)內(nèi)用Tris-EDTA緩沖液(10mM Tris-HCl, pH 7.6和50mM EDTA, pH 8.0)對塞子進(jìn)行清洗，將總DNA包埋在塞子中，在1%瓊脂糖凝膠、0.5 ×Tris-Borate-EDTA緩沖液(45 mM Tris-HCl, 45 mM 硼酸, 1mM EDTA)中凝膠電泳。分離在CHEF DR II設(shè)備上進(jìn)行，120度場角，8-30 s開關(guān)時(shí)間，6 V/cm, 14 ℃ 24小時(shí)，緩沖溫度是用冰浴進(jìn)行維持，采用低量程DNA階梯作為大小標(biāo)記（PFG Marker）。電泳后，用溴化乙錠染色4小時(shí)，在紫外線透照器下拍照。
氟喹諾酮類藥物的殺菌機(jī)理是促進(jìn)藥物-拓?fù)洚悩?gòu)酶-DNA裂解復(fù)合物的形成（Fa`bregaet al .,2009)。因此，我們的目標(biāo)是驗(yàn)證這些裂解復(fù)合物在ASFV病毒DNA上的形成。正如預(yù)期的那樣，隨著ASFV MOI(0.1, 1, 5)的增加從受感染的Vero細(xì)胞中獲得DNA塞子，表現(xiàn)為全長病毒基因組的擴(kuò)增數(shù)目(線性帶170kb)，以及不完整的病毒基因組24 hpi(圖3,4-6)。 從先前暴露于恩諾沙星的受感染細(xì)胞中獲得的DNA探針顯示，完整和不完整的病毒基因組明顯減少。(（圖3）當(dāng)最高濃度使用（100 mg/ml）更加顯著（圖3，第12-14道瓊脂）。探針塞來自模擬感染細(xì)胞（0和24hpi）（圖3，泳道1和2 ）未顯示病毒基因組含量。此外，探針從暴露于依托泊苷的ASFV感染細(xì)（MOI=5），一個(gè),特異性宿主細(xì)胞拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ型毒物（1 mM）未顯示碎片基因組的增加物種，提示II型宿主拓?fù)洚悩?gòu)酶不,切割asfv病毒基因組（圖3，泳道3）。未檢測ASFV細(xì)胞基因組碎片在暴露于a氟喹諾酮藥物后（圖3，第7欄 and 11),和11欄），證實(shí)了從MTS獲得的細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果。
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3.4 氟喹諾酮類調(diào)控ASFV蛋白合成
采用Western blot技術(shù)比較分析暴露于氟喹諾酮類和沒有暴露于氟喹諾酮類of viral protein synthesis between ASFV-infected Vero cellsASFV感染Vero細(xì)胞間病毒蛋白合成exposed and non-exposed to fluoroquinolones. Since early。結(jié)果顯示從早期開始phase of infection (6 hpi), the viral protein expression in感染階段（6hpi），氟喹諾酮暴露組的細(xì)胞病毒蛋白表達(dá)fluoroquinolone-exposed cells (Fig. 4A, lanes 3–14) was（圖4a，3-14道）不同于陽性對照組（圖4a，2道）；in exposed-cells, a small viral protein with 17 kDa was在藥物暴露的細(xì)胞中僅僅在兩條道viral proteins (63 kDa and 20 kDa) were only detected僅檢測到病毒蛋白（63kDa和20kDa）。一個(gè)17kDa的小病毒蛋白o(hù)nly clearly identified in the non-treated infected control.僅在未經(jīng)處理的感染控制中明確識別。At late phase of viral infection (32 hpi), viral proteins病毒感染后期（32hpi），病毒蛋白heavier than 50 kDa were only detected in the positive大于50kDa僅在陽性細(xì)胞中檢測到，control (Fig. 4B, lane 2) whereas infected treated cells still對照組（圖4b，第2道），而受感染的治療細(xì)胞仍然displayed high expression levels of 35 kDa viral protein顯示了35kDa高表達(dá)水平病毒蛋白和and low levels of 17 kDa viral protein (Fig. 4B, lanes 3–低水平的17kDa病毒蛋白（圖4b，3- 14）。
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3.5氟喹諾酮類藥物在有效抗病毒濃度下對細(xì)胞毒性較低
在7天的暴露期后，6種fluoroquinolones induced a cellular growth inhibition,氟喹諾酮類藥物誘導(dǎo)細(xì)胞生長抑制，使用100 mg/ml濃度下進(jìn)行MTS分析，MTS assay. The reduction observed ranged from 40% with測定結(jié)果顯示恩諾沙星生長減少15%，巴洛沙星減少40%（圖5）。所有兩種或三種兩種或氟喹諾酮的組合使用中，顯示與單種使用相比，細(xì)胞毒性更低。