畜牧人

標(biāo)題: 內(nèi)切木聚糖酶的檢測(cè)方法 [打印本頁]

作者: 玫香 時(shí)間: 2007-7-13 14:36
標(biāo)題: 內(nèi)切木聚糖酶的檢測(cè)方法
最近,看了一些木聚糖酶的資料,關(guān)于內(nèi)切和外切不同的廠家說法不一,附件中為一家公司化驗(yàn)方法,可能由于來源\底物和化驗(yàn)方法的不同,檢測(cè)結(jié)果差異很大,困惑中.......

作者: fjcwr 時(shí)間: 2007-7-14 23:29
木聚糖酶的測(cè)定方法
1 原理
內(nèi)切-(1,4)-b-D-木聚糖酶將藍(lán)銅礦膠連染色的小麥阿拉伯木聚糖底物分解，產(chǎn)生水溶性染色片斷。這些片斷的釋放速率（590nm條件下的吸光度值的增加）可以直接反應(yīng)木聚糖酶的活性。
2 試劑
2.1 Xylazyme AX藥片（Megazyme，澳大利亞）
2.2 飼料標(biāo)準(zhǔn)木聚糖酶
通過FFI DNS方法進(jìn)行測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)木聚糖酶儲(chǔ)備液
2.3 0.2mol/l的醋酸緩沖液，pH 4.2
將12g的冰醋酸加到900ml的蒸餾水中，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至4.2，用蒸餾水定容至1L。
2.4 2%的Trizma溶液（2％）
將20g的Trizma（Sigma，T-1503）溶解至900ml的蒸餾水中，然后用蒸餾水定容至1L，此溶液不需要調(diào)整pH值。
2.5 標(biāo)準(zhǔn)木聚糖酶工作液
將標(biāo)準(zhǔn)木聚糖酶儲(chǔ)備液（2.2）加入蒸餾水稀釋，直至最后溶液中木聚糖酶的活性大約在50U/ml。這種溶液不很穩(wěn)定，因此需要在分析前進(jìn)行配制。
3 分析方法
3.1 酶的提取
已知添加量的方法
3.1.1 取5只試管，其中4只試管中添加1g左右的飼料樣品（樣品的粉碎粒度應(yīng)小于1mm），另外一只試管中加入已知活性的酶樣品溶液。另外要進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
3.1.2 按照以下濃度的標(biāo)準(zhǔn)木聚糖酶工作液（2.5）加入到飼料樣品中：
a) 空白（沒有添加）
b) 1U/g
c) 2U/g
d) 3U/g
3.1.3 將一定數(shù)量的醋酸緩沖液（2.3）加入到飼料樣品中，使其總體積達(dá)到10ml，在室溫的條件下?lián)u動(dòng)試管10min。
3.1.4 在3500 rpm條件下離心10min。
標(biāo)準(zhǔn)曲線方法
在這種方法中，標(biāo)準(zhǔn)曲線在1周之內(nèi)可以使用。但是如果樣品中含有干擾成分，則測(cè)定的方法受到影響。
3.1.1b 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過在1g不含有酶制劑的“控制日糧”中添加已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)木聚糖酶工作液。這種方法應(yīng)該采用不同的日糧進(jìn)行重復(fù)。
3.1.2b 稱取1g飼料和1g參照飼料到離心管中，樣品的粉碎粒度應(yīng)小于1mm。另外要進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
3.1.3b將10ml的醋酸緩沖液（2.3）加入到飼料樣品中，在室溫的條件下?lián)u動(dòng)試管10min。
3.1.4 在3500 rpm條件下離心10min。
3.2 分析方法
3.2.1 吸取0.1ml的上清液加入到試管中，試管中含有0.4ml的醋酸緩沖液（2.3），混勻。另外一個(gè)試管中加入0.5ml的醋酸緩沖液作為對(duì)照組。
3.2.2 在每個(gè)試管中加入一個(gè)Xylazyme AX藥片（2.1），在50℃條件下反應(yīng)1h，反應(yīng)期間不需要攪動(dòng)。
3.2.3 加入5ml的Trizma溶液（2.4）停止反應(yīng)，在渦旋振蕩器上振蕩。
3.2.4在室溫下放置5min，然后振蕩一次。
3.2.5 在4500的條件下離心5min。
3.2.6用空白溶液作為空白，在590nm的條件下測(cè)定溶液的吸光度值。
4 結(jié)果計(jì)算
4.1a 已知添加量方法
計(jì)算所有重復(fù)的平均吸光度值。每個(gè)飼料樣品可以根據(jù)4個(gè)吸光度值計(jì)算出一個(gè)回歸曲線，Y軸為溶液的吸光度值，X軸為酶的活性，直線的斜率“S”和在Y軸上的截距“I”也可以計(jì)算求出。
飼料樣品中的木聚糖酶的活性可以根據(jù)以下的公式計(jì)算出來：
木聚糖酶的活性（U/kg）＝I/S×1000
4.1b 標(biāo)準(zhǔn)曲線方法
計(jì)算所有重復(fù)的平均吸光度值。每個(gè)飼料樣品可以根據(jù)4個(gè)吸光度值計(jì)算出一個(gè)回歸曲線，X軸為吸光度值，Y軸為溶液中酶的活性。
直線的斜率“S”和在Y軸上的截距“I”也可以計(jì)算求出。
計(jì)算樣品的平均吸光度值，木聚糖酶的活性按照以下的公式計(jì)算：
木聚糖酶活性（U/kg）＝（A×S＋I(xiàn)）/W×1000
A：樣品的平均吸光度值
S：標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率
I：標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距
W：樣品的重量

作者: 江湖2004 時(shí)間: 2007-10-27 11:30
現(xiàn)在酶制劑的使用存在很多問題，底物的針對(duì)興更重要

作者: 微塵 時(shí)間: 2007-10-27 15:54
沒有統(tǒng)一的化驗(yàn)方法，只能各說各的理

作者: qinqin0226 時(shí)間: 2008-1-23 21:23
好東西啊，我正需要，萬分感謝樓主。:hehe: :hehe:

作者: qinqin0226 時(shí)間: 2008-1-23 21:24
樓主啊，我?guī)挪粔蛳虏幌聛戆?，好可憐啊

作者: yyt 時(shí)間: 2008-6-4 13:11
沒有多少意義，關(guān)鍵是要進(jìn)行養(yǎng)殖試驗(yàn)

作者: yzlingyz 時(shí)間: 2008-7-17 14:50
同意樓上所說！關(guān)健要看生產(chǎn)試驗(yàn)。

作者: wdyxsx38 時(shí)間: 2008-7-17 14:54
:guzhang: :g實(shí)踐出真理

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