其他性別鑒定的方法如 H Y 抗原已證實(shí)可應(yīng)用在牛、綿羊和豬等家畜，使用此項(xiàng)技術(shù)在胚胎性別鑒定的準(zhǔn)確率分別為 77 88% 和 82 89%，正確性相當(dāng)高。此項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用在牛胚胎或單胎動(dòng)物胚胎上有其實(shí)質(zhì)上的經(jīng)濟(jì)效果，但如應(yīng)用在豬胚胎，因其性別準(zhǔn)確率不如單胎動(dòng)物，所以其經(jīng)濟(jì)效益上無法與單胎動(dòng)物相抗衡。
在性別控制技術(shù)上另一種方法是精子中具有 X 和 Y 染色體的分離。在人類和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物方面已有相當(dāng)程度的成功率，但是利用這些技術(shù)應(yīng)用在家畜的精子分離，則因參與的動(dòng)物頭數(shù)不多或未能重復(fù)試驗(yàn)致使缺乏說服力。近幾年來使用精子來控制性別比較有理論根據(jù)的學(xué)者有美國(guó)農(nóng)業(yè)部的 Dr. Johnson 等人，( 1989；1991 )。他們以測(cè)定脫氧核甘酸 ( DNA ) 含量多寡的方法來判定其性別。其過程為將精子置入流動(dòng)測(cè)定儀 ( Folw Cytometer ) 分離含有 X 染色體和 Y 染色體的精子。并已將分離的兔和豬精子經(jīng)由輸卵管授精法獲得生產(chǎn)特定性別之動(dòng)物，此方法也是迄今為止分離精子性別比較精準(zhǔn)的方法。
二、胚胎性別鑒定方法
(1)細(xì)胞學(xué)鑒定方法
此方法為抽取胚胎內(nèi)的細(xì)胞經(jīng)過適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)後在辨別 X 或 Y 染色體。因此方法抽取胚胎內(nèi)的細(xì)胞時(shí)有損及胚胎之存活，致使經(jīng)移置後其成功率很低。
因人類 X 和 Y 精子的大小和比重上有差異，所以經(jīng)此方法可以分離試驗(yàn)動(dòng)物和人類 X 和 Y 精子。1982 年 Beernnink and Ericsson 曾經(jīng)使用此技術(shù)成功地分離人 X 和 Y 精子。但是利用此技術(shù)分離牛的 X 和 Y 精子，并將分離之精子給予授精、分娩，出生之仔畜性別則無明顯的差異。
(2)免疫方法
利用雄性動(dòng)物細(xì)胞表面持有特別之蛋白質(zhì) ( H Y 抗原 )。并以免疫之方法生產(chǎn) H Y 抗體血清，在配合螢光染色技術(shù)可以辨別 X 和 Y 精子。利用此技術(shù)分離鼠和兔子 X 和 Y 精子則可獲得相當(dāng)程度的性別改變 ( 母鼠 54.6%；母兔 63% )。
(3) Flow Cytometric 儀分離方法
利用 Flow Cytometric 儀測(cè)定哺乳動(dòng)物精子 DNA 含量已有報(bào)告 ( Garner et al., 1983 ; Johnson et al., 1985 ; Johnson et al., 1987 )。而且 Pinkel et al., 1982 年亦曾發(fā)現(xiàn) X 精子 DNA 含量多過 Y 精子 4%。
在早期使用 Flow Cytometric 儀分離 X 和 Y 精子前必須將精子的尾巴細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜棄掉，所以分離出來的 X 和 Y 精子是死的，以致無法作為授精之用。但是近兩年來美國(guó)農(nóng)業(yè)部生理專家強(qiáng)生博士等研究人員已可將已經(jīng)分離而且有活力的活精子使用輸卵管授精法給予授精母兔和母豬，并成功生產(chǎn)活的仔畜 ( 表 1、2 )。
表 1 兔子預(yù)選 X 和 Y 精子以及經(jīng)由輸卵管授精仔兔之性比例
精 子 處 理 別
頭 數(shù)
出 生 仔 兔 頭 數(shù) 和 百 分 率
授 精 數(shù)
分 娩 數(shù)
預(yù) 選
生 產(chǎn)
公 (%)
母 (%)
公 (%)
母 (%)
Y 精子 X 精子
混合 X 和 Y 精子<--mstheme-->
16 14
17
5 3
5
81 14
50
19 86
50
17 (81) 1 (6)
6 (43)
4 (19) 15 (94)
8 (57)
合 計(jì)
47
13
---
---
24 (47)
27 (53)
資料來源：Johnson et al., 1989. Biology of Reproduction 41：199-203 * ：每邊輸卵管注入 3×105 之精子
表 2 預(yù)選豬 X 和 Y 精子以及經(jīng)由輸卵管授精後仔豬之性比例
精 子 處 理 別
授精頭數(shù)／ 分 娩 頭 數(shù)
仔 豬 生 產(chǎn) 頭 數(shù)
平均每窩 產(chǎn)仔頭數(shù)
預(yù) 選
生 產(chǎn)
公 (%)
母 (%)
公 (%)
母 (%)
Y 精子
X 精子
不分離 染色
不分離 不染色
8／4 10／5
11／5
7／5
37 34
40
46
9.3 6.8
8.0
9.2
77 20
50
50
23 80
50
50
68 26
43
52
32 74
57
48
資料來源：Johnson et al., 1989. Biology of Reproduction 41：199 - 203 *：每邊輸卵管注入 3×105 之精子
近幾年來發(fā)展分離 X 和 Y 精子技術(shù)已近成熟階段尤其利用 Flow Cytometric 儀分離經(jīng)去尾和細(xì)胞膜的 X 和 Y 精子成功以後。迄 1989；1991 年美國(guó)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生理學(xué)家強(qiáng)生博士更利用 Flow Cytometric 儀分離仍有活力的精子，而且將分離仍有活力的 X 和 Y 精子經(jīng)由母體輸卵管授精成功地產(chǎn)下 94% 母仔兔和 81% 公仔兔以及 74% 母仔豬和 68% 公仔豬。
雖然利用 Flow Cytometric 儀可分離 X 和 Y 精子，因在分離之過程中損傷精子程度極高，分離的速度也嫌太慢，尤其對(duì)多胎動(dòng)物需眾多數(shù)目的精子來授精仍嫌不足。所以如何能很迅速地一次分離足夠正常人工授精的精子數(shù)目，而且不損及其精子活力和型態(tài)，更不影響其授精後的生育能力，此為往後分離精子必須改進(jìn)努力的目標(biāo)。
摘要：采用苯甲酸鈉雌二醇(estradiol benzoate, EB)+孕激素(progesterone, P4)+陰道栓方法對(duì)荷斯坦青年牛進(jìn)行人為誘導(dǎo)卵泡波處理，比較不同劑量的P4和不同陰道栓誘導(dǎo)新的卵泡波的發(fā)生，以及對(duì)同期發(fā)情效果和超排效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，海棉栓組PGF2α處理后到奶牛發(fā)情的時(shí)間間隔為48.3h，孕酮緩釋陰道栓組為39h，兩組差異極顯著（P<0.05）；海棉栓組的頭均獲胚數(shù)顯著高于孕酮緩釋陰道栓組（13.2：8.7枚，P<0.05），頭均可用胚數(shù)顯著高于孕酮緩釋陰道栓組(5.7：3.3枚，P<0.05)；外源注射50和100 mgP4都能夠成功地誘導(dǎo)新的卵泡波的發(fā)生，在同期發(fā)情效果和超排效果上沒有顯著差異( P>0.05 )。
關(guān)鍵詞：EB；P4；陰道栓；超數(shù)排卵
引言：
利用奶牛卵泡波的原理，采用物理或化學(xué)方法對(duì)供體奶牛的卵泡波進(jìn)行同期化處理，可以提高奶牛的同期發(fā)情和超數(shù)排卵效果。Lammoglia et al（1998）報(bào)道，使用雌激素+孕激素+陰道栓有效地促進(jìn)新的卵泡波的發(fā)生，提高排卵前的LH峰值，從而提高同期發(fā)情效果和超排效果。Martinez et al.（2000）使用EB+P4+CIDR（新西蘭）取得較好的同期發(fā)情效果和較高的妊娠率；Martinez et al.（2001）使用EB+P4誘導(dǎo)新的卵泡波的發(fā)生，取得較好的同期發(fā)情效果。Gabriel et al (2006) 報(bào)道了使用DIB(阿根廷生產(chǎn)的陰道栓)陰道栓+2.5mgEB+50mgP4進(jìn)行同期發(fā)情處理,使用Folltropin-V 進(jìn)行超排處理，取得較好的超排效果。
目前，國(guó)內(nèi)奶牛的同期發(fā)情和超排處理主要使用海棉陰道栓，由于該陰道栓埋置后容易與陰道發(fā)生黏連，陰道壁的刺激性比國(guó)外生產(chǎn)的CIDR、DIB強(qiáng)一些，容易阻塞陰道分泌物的排出，造成陰道內(nèi)較多的炎性分泌物，引起奶牛超排過程中的損傷，影響超排效果。因此，本研究比較不同的陰道栓和不同的孕激素劑量對(duì)奶牛同期發(fā)情和超數(shù)排卵效果的影響，從而進(jìn)一步提高奶牛的超排效果。
表1 兩種陰道栓的同期發(fā)情效果
table 1 the effect of estrus synchronization between two vaginal-bolt
項(xiàng) 目 the item 組別 group 孕激素劑量 doses of progesterone(P4,mg) 平均值 average
50 100
奶牛頭數(shù) cattle number BI 20 16 —
PRD 19 19 —
發(fā)情率 estrus rate (%) BI 100 100 100
PRD 100 100 100
發(fā)情時(shí)間c estrus time (h) BI 47.9a 48.9a 48.3
PRD 38.2b 39.8b 39.0
注：a ,b 不同表示不同組間差異顯著，P<0.05;c表示PGF2α處理后到奶牛發(fā)情的時(shí)間間隔，BI表示海棉栓組，PRD表示緩釋陰道拴組。note: different letters(a and b) within a row mean a significant difference for animals(P<0.05)；c means intervals from PGF2α treatment to estrus(h) ,BI stands for the group of sponge blot(BI), PRD stands for the group of progestin release device (PRD)
圖1 PG處理后的發(fā)情時(shí)間和發(fā)情率
fig.1 the time and rate of oestrus after PGF2α treatment
注：A，50 mgP4海綿栓組；B，100 mgP4海綿栓組；C，50 mgP4孕酮緩釋陰道栓組；D，100 mgP4孕酮緩釋陰道栓組, a ,b 不同表示不同組間差異顯著，P<0.05。note: A, the sponge blot group of 50 mgP4; B, the sponge blot group of 100 mgP4;
C, the progestin release device group of 50 mgP4; D, the progestin release device group of 100 mgP4
發(fā)情同期性與陰道栓孕酮釋放穩(wěn)定性有關(guān)，穩(wěn)定性越好，發(fā)情同期性越高。對(duì)比兩種不同陰道栓的發(fā)情效果，說明兩種陰道栓的孕酮釋放相對(duì)穩(wěn)定，發(fā)情同期性高。但是，孕酮緩釋陰道栓組比海綿栓組提前發(fā)情10h左右，這可能是由于孕酮緩釋陰道栓釋放孕酮含量低，造成撤拴后孕激素濃度提前降低到基準(zhǔn)水平，卵泡迅速生長(zhǎng)，并比海棉栓組提前達(dá)到排卵卵泡，雌激素濃度迅速上升，從而提前發(fā)情。
Taft et al (1996) 報(bào)道，孕激素在行使功能時(shí)候，通過直接途徑（作用于卵巢，芳香化酶作用）和間接途徑（作用于LH）來實(shí)現(xiàn)。超排期間，應(yīng)用陰道栓來人為提高奶牛血漿中孕激素水平，從而抑制優(yōu)勢(shì)卵泡的發(fā)育，解除優(yōu)勢(shì)卵泡對(duì)從屬卵泡的抑制作用，使更多卵泡發(fā)育為優(yōu)勢(shì)卵泡。但是，處理時(shí)不同的孕激素濃度會(huì)導(dǎo)致不同的同期發(fā)情效果，Richardson et al (2002) 用三種不同的方法進(jìn)行同期發(fā)情（P4+PGF2α組，GnRH+PGF2α組，GnRH+P4+PGF2α組），結(jié)果GnRH+PGF2α組最先發(fā)情，提前12h左右。該試驗(yàn)通過比較發(fā)情前期不同孕激素水平得出，孕激素處理組在撤拴當(dāng)天血漿中的孕激素濃度要高于對(duì)照組，而雌激素濃度要低于對(duì)照組。較小卵泡的奶牛從撤拴到發(fā)情開始的間隔時(shí)間要長(zhǎng)于有較大卵泡的奶牛。卵泡生長(zhǎng)速率與LH峰頻率有關(guān)，當(dāng)孕激素濃度處于低水平時(shí)，LH峰頻率加強(qiáng)，卵泡就有較高的生長(zhǎng)速率。Utt et al (2003) 報(bào)道，第一個(gè)卵泡波卵泡的生長(zhǎng)速率快于第二個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡波，主要是因?yàn)榈谝粋€(gè)卵泡波的孕激素濃度低的原因，第一個(gè)卵泡波處于早期黃體期間，而第二個(gè)卵泡波處于中期黃體期間。本試驗(yàn)中，由于國(guó)產(chǎn)孕酮緩釋裝置釋放孕酮含量低，造成撤拴后孕激素濃度提前降低到基準(zhǔn)水平，卵泡迅速生長(zhǎng)，并比對(duì)照組提前達(dá)到排卵卵泡，雌激素濃度迅速上升，從而提前發(fā)情。
2.2不同陰道栓和不同的P4劑量對(duì)超排效果的影響
表2 兩種陰道栓的超排結(jié)果
table 2 the superovulatory results of the two vaginal-bolt
項(xiàng) 目the item 組別 group 孕激素劑量 doses of progesterone(P4,mg) 平均值 average
50 100
奶牛頭數(shù) cattle number BI 20 15 —
PRD 19 17 —
獲胚數(shù) embryo number BI 272 189 —
PRD 167 146 —
胚/ 頭 average embryo number BI 13.6a 12.6a 13.2a
PRD 8.8b 8.6b 8.7b
受 精 卵 / 頭average fertilized embryo BI 11.4a 10.1a 10.8a
PRD 4.5b 4.9b 4.7b
可 用 胚 / 頭average useable embryos BI 5.6a 5.9a 5.7a
PRD 3.4b 3.1b 3.3b
注：a ,b 不同表示不同組間差異顯著，P<0.05;BI表示海棉栓組，PRD表示緩釋陰道拴組。note: different letters(a and b) within a row mean a significant difference for animals；BI stands for the group of sponge blot(BI), PRD stands for the group of progestin release device (PRD)
由表2可看出，海綿栓組（50mgP4/100mgP4）和孕酮緩釋陰道栓組（50mgP4/100mgP4）頭均獲胚數(shù)分別為13.6、12.6、8.8和8.6枚，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中不同孕激素水平的頭均獲胚數(shù)沒有顯著差別（P>0.05），兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間的差異極顯著（13.2：8.7枚，P<0.05）。海綿栓組（50mgP4/100mgP4）和孕酮緩釋陰道栓組（50mgP4/100mgP4）頭均受精卵數(shù)分別為11.4、10.1、4.5和4.9枚，每個(gè)試驗(yàn)組中不同孕激素水平的頭均受精卵數(shù)沒有顯著差別（P>0.05），兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間的差異極顯著（10.8：4.7枚，P<0.05）。同樣，海綿栓組（50mgP4/100mgP4）和孕酮緩釋陰道栓組（50mgP4/100mgP4）的頭均可用胚數(shù)分別為5.6、5.9、3.4和3.1枚，每個(gè)試驗(yàn)組中不同孕激素水平的頭均可用胚數(shù)沒有顯著差別（P>0.05），兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間的差異極顯著（5.7：3.3枚，P<0.05）。
應(yīng)用國(guó)產(chǎn)海綿栓組的超排效果明顯高于國(guó)產(chǎn)孕酮緩釋陰道栓組，孕酮緩釋陰道栓組的超排結(jié)果在獲胚數(shù)，頭均受精卵數(shù)和頭均可用胚數(shù)上要顯著低于國(guó)產(chǎn)海綿栓組（P<0.05），這主要與國(guó)產(chǎn)孕酮陰道栓的孕激素釋放量有關(guān)。由于孕酮緩釋陰道栓的孕激素釋放量較小，使得供體奶牛的體內(nèi)孕激素水平較低，不能抑制優(yōu)勢(shì)卵泡的生長(zhǎng)，優(yōu)勢(shì)卵泡的生長(zhǎng)產(chǎn)生大量雌激素，導(dǎo)致奶牛提前發(fā)情；并且，優(yōu)勢(shì)卵泡的生長(zhǎng)抑制了其它從屬卵泡的生長(zhǎng)，使得從屬卵泡不能充分發(fā)育，在發(fā)情后不能排卵，從而減少了頭均獲胚數(shù)和頭均可用胚數(shù)。
Savio et al.(1993)報(bào)道，持久卵泡的出現(xiàn)會(huì)降低受精率，持久卵泡會(huì)導(dǎo)致早期胚胎發(fā)育畸形率提高和無精卵的出現(xiàn)。持久卵泡的出現(xiàn)可以改變卵泡中雌激素水平，使其濃度升高，這樣就改變了卵子的成熟和輸卵管功能，從而降低超排效果。Austin et al (1999) 研究發(fā)現(xiàn)，在撤拴時(shí)雌激素水平高的提前發(fā)情。優(yōu)勢(shì)卵泡持續(xù)期越長(zhǎng)，雌激素水平越高，越容易提前發(fā)情。但是，當(dāng)優(yōu)勢(shì)卵泡持續(xù)期2-4天時(shí)，發(fā)情不同步，不能達(dá)到一個(gè)很好的發(fā)情效果。高水平的外源孕激素可以減少持久卵泡的發(fā)生和降低雌激素的分泌水平。Wehrman et al (1993) 研究表明，持久卵泡的出現(xiàn)可以使青年牛提前發(fā)情10h左右。本試驗(yàn)中，由于國(guó)產(chǎn)孕酮緩釋裝置釋放孕酮含量較低，不能充分抑制優(yōu)勢(shì)卵泡的生長(zhǎng)，產(chǎn)生持久卵泡，使得優(yōu)勢(shì)卵泡分泌大量的雌激素，抑制其它從屬卵泡的生長(zhǎng)，同時(shí)提前發(fā)情，導(dǎo)致其它從屬卵泡的生長(zhǎng)時(shí)間較短，不能達(dá)到排卵卵泡，降低了超排的頭均獲胚數(shù)，頭均受精卵數(shù)和頭均可用胚數(shù)，影響了超排效果。
苯甲酸鈉雌二醇（EB）和孕激素（P4）的聯(lián)合使用可以誘導(dǎo)奶牛新的卵泡波的出現(xiàn)，這在大量研究中都有報(bào)道。Caccia and B6 (1998) 報(bào)道，使用2.5mgEB+50mgP4+CIDR可以在3-4天內(nèi)成功誘導(dǎo)新的卵泡波的發(fā)生， B6 et al (2002) 使用2.5mgEB+50mgP4成功地對(duì)奶牛進(jìn)行超排，超排效果與傳統(tǒng)的8-12天自然發(fā)情后進(jìn)行超排的效果沒有顯著差異。Mapletoft et al. (1999) 使用5mgE-17β+100mgP4對(duì)奶牛進(jìn)行超排并取得理想的超排效果。本試驗(yàn)采用兩種不同孕激素水平（50mg，100mg）來誘導(dǎo)新的卵泡波。本實(shí)驗(yàn)中，兩種孕激素水平對(duì)超排牛的同期發(fā)情效果和超排效果都沒有顯著差異（P<0.05），這說明50mg的孕酮肌肉注射和苯甲酸鈉雌二醇（EB）聯(lián)合使用就可以成功誘導(dǎo)新的卵泡波的發(fā)生，達(dá)到較好的超排效果。
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Effect of EB+P4+Vaginal-bolt on Superovulation of Holstein Heifers
Duan Bao-ning1,2 , Xue Jian-hua3, Zhang Xin-hui3,Wu Sheng-quan3, Sun Feng-jun3, Sang Run-zi1,2
1. Animal Science and Technology College of the Agriculture University of Hebei.2.The Research Centre of Cattle and Sheep Embryonic Technique of Hebei, Baoding of Hebei,071001.3.The embryo department of Beijing Dairy Cattle Center.
Abstract: The Follicular wave of Holstein heifers was induced by estradiol benzoate (EB), progesterone (P4) and vaginal-bolt in order to study the effect of P4 with different doses and different types of vaginal-bolt on inducing of new follicular wave, estrus synchronization and superovulatory results. The results showed that the interval of the sponge blot (BI) group from PGF2α treatment to estrus was 48.3h, and that of the progestin release device (PRD) group was 39h, there were significant differences between the two groups (P>0.05). The average number of obtained embryo for BI group (13.2) was significantly higher than that (8.7) of PRD group (P < 0.05), and the average number of useable embryo of BI group (5.7) was also significantly higher than that (3.3) of PRD group (P < 0.05). The P4 injection dosage of 50 and 100 mg could induce new follicular wave efficiently, and there was no significant difference on estrus synchronization and superovulatory results between the BI and PRD groups (P > 0.05).
Key word: EB; P4; vaginal-bolt; Superovulation作者: sdlthg 時(shí)間: 2008-8-17 16:48
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