歸芪益母湯耐缺氧及抗氧化作用的實(shí)驗(yàn)研究
許小琴1韋旭斌1劉學(xué)忠2李金貴2胡仲明1柳巨雄1王治1張玉國1
（1.解放軍軍需大學(xué) 軍事獸醫(yī)系，吉林 長春 130062；2.揚(yáng)州大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009）
關(guān)鍵詞：歸芪益母湯；中藥復(fù)方；耐缺氧；抗氧化
歸芪益母湯是出自清代的一首用于治療勞役過度所致氣血俱虛及產(chǎn)后血瘀腹痛的方劑，全方由當(dāng)歸、黃芪、益母草3味中藥組成，具有氣血雙補(bǔ)與活血化瘀功效，因藥味組成較少，在臨床上應(yīng)用并不廣泛。然而，我們在對其進(jìn)行中藥藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)，卻意外地發(fā)現(xiàn)該方具有極強(qiáng)的增強(qiáng)機(jī)體耐缺氧能力的作用，為了進(jìn)一步確證其藥效并闡明作用機(jī)理，本試驗(yàn)觀察了該方對小鼠耐缺氧能力的影響及抗氧化作用。
1、材料與方法
1.1 材料
1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級ICR小鼠、雌雄各半，體重19~21g。由白求恩醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心及揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
1.1.2 藥品歸芪益母湯注射液：中藥當(dāng)歸、黃芪、益母草（購自吉林大藥房），經(jīng)15倍去離子水浸泡，煎煮2次（30min/次），過濾，合并兩次濾液濃縮至密度為1.20~1.25，冷至30℃時(shí)緩慢加入乙醇，使醇含量達(dá)70%，充分?jǐn)嚢瑁o置過夜，濾取上清液，水浴回收乙醇至無醇味，用蒸留水調(diào)至1g/ml生藥，以40%氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.0，再3000r/min離心10min，取上清經(jīng)高壓滅菌消毒后備用。鈉石炭：上海五四化學(xué)試劑廠出品；硫代巴比妥酸（TBA）：Sigma公司出品（上海試劑二廠分裝），1，3，3-四乙氧基丙烷（TEP）：Sigma公司出品（上海試劑二廠分裝）；30%雙氧水溶液：上海焱晨實(shí)業(yè)有限公司出品；其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 常壓缺氧實(shí)驗(yàn)[1]
1.2.1.1急性實(shí)驗(yàn)將40只小鼠隨機(jī)分成藥物組和對照組，每組20只，兩組小鼠按每10g體重0.2ml劑量腹腔注射分別給予歸芪益母湯注射液和生理鹽水，于給藥后15min將每只小鼠置于盛有5g鈉石灰的250ml廣口瓶中，加蓋密封，記錄存活時(shí)間（從密封至停止呼吸的時(shí)間）。
1.2.1.2慢性實(shí)驗(yàn)將60只小鼠隨機(jī)分成試藥低劑量組、高劑量組及對照組，每組20只，給藥各組小鼠每天分別給予歸芪益母湯（2g/ml，制法同注射液）0.4ml/10g、0.2ml/10g體重灌胃，對照組給生理鹽水，連續(xù)5天，于末次給藥后30min將小鼠裝瓶，作同上實(shí)驗(yàn)。
1.2.2 減壓缺氧實(shí)驗(yàn)將20只小鼠隨機(jī)分成藥物組和對照組，每組10只按0.2ml/10g體重劑量腹腔注射，分別給予歸芪益母湯注射液和生理鹽水，于給藥后15min將10只小鼠同時(shí)置于盛有50g鈉石灰的2000ml打開蓋的玻璃干燥器中，干燥器蓋的氣閥（關(guān)閉）用橡膠管通過玻璃平衡瓶（20000ml）與抽氣泵相連，抽氣達(dá)26.7kpa（200mmHg）時(shí)，停止抽氣，將干燥器蓋密封后，打開氣閥，待干燥器與平衡瓶內(nèi)氣壓平衡時(shí)關(guān)閉氣閥開始試驗(yàn)，記錄各小鼠存活時(shí)間。
1.2.3化學(xué)物質(zhì)缺氧實(shí)驗(yàn)將30只小鼠隨機(jī)分成藥物組和對照組，每組15只，分別腹腔注射0.2ml/10g體重劑量的藥物和生理鹽水，15min后每鼠再腹腔注射10mg/kg體重劑量的氰化鉀，記錄存活時(shí)間（從氰化鉀注射完畢至停止呼吸的時(shí)間）。
1.2.4紅細(xì)胞和血紅蛋白的測定取32只小鼠斷尾失血造成人工血虛模型，于斷尾時(shí)和失血24小時(shí)后，每鼠眼底采血25μl置于事先放有血細(xì)胞稀釋液的指型管中，用AL818全自動(dòng)血液分析儀（瑞士）進(jìn)行紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白量測定。在證實(shí)失血模型成功后，將小鼠隨機(jī)分為2組，每組16只，分別給予試藥（2g/ml）和生理鹽水，按0.2ml/10g體重灌胃，連續(xù)7天。于末次給藥后30min，再次采血測定。
1.2.5急性缺氧再暴露后丙二醛（MDA）生成試驗(yàn)
取30只小鼠隨機(jī)分成藥物組、生理鹽水對照組和空白對照組，每組10只，前二組分別于缺氧實(shí)驗(yàn)前6h和30min按0.2ml/10g體重腹腔注射藥液和生理鹽水，到時(shí)間后，將二組小鼠置于4000ml干燥器中，加蓋密封30min，再打開密封蓋使小鼠暴露在空氣中2h；空白對照組小鼠不作任何處理，三組小鼠分別采用斷頭采血分離血清，按改良八木國夫法[2]測定MDA。
1.2.6 H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)
小鼠斷頭取血，用生理鹽水洗滌3次，制成5%紅細(xì)胞懸液。試管中分別加入80μl、40μl、20μl藥液及40μl生理鹽水，每組平行8管，再向每管加入5%紅細(xì)胞懸液1ml，然后加入H2O2使其終濃度為2mmol/L，于37℃溫育誘導(dǎo)溶血1h，離心取上清液，用生理鹽水40倍稀釋后，在756紫外可見分光光度計(jì)上測定波長415nm處的OD值。
1.2.7超氧陰離子（O2-）生成試驗(yàn)（鄰苯三酚自氧化法測定）取50mmol/L Tris-HCL緩沖液（pH8.2）3ml于試管中，加入0.1ml藥液（分別含生藥60mg/ml和30mg/ml）或生理鹽水，混勻后加入0.3ml的7mmol/L鄰苯三酚，反應(yīng)4min后加入150μl的10mol/L HCl終止反應(yīng)，每組平行8管于420nm處測OD值。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（
）表示，采用ｔ檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異統(tǒng)計(jì)。2、結(jié)果
2.1常壓缺氧存活時(shí)間
從表1可見歸芪益母湯無論是急性腹腔注射或是慢性灌胃給藥都能提高小鼠耐缺氧能力，分別與對照組間存在顯著差異（P＜0.01），而灌胃給藥高、低劑量組間無顯著差異。
表1歸芪益母湯對小鼠常壓耐缺氧能力的影響（，n=20）
，n=20）組別 | 劑量 （ml/10g） | 給藥 途徑 | 存活時(shí)間 （min） | 增加 率（%） |
急性生理鹽水組 | 0.2 | ip | 37.21±7.76 |  |
急性歸芪益母湯組 | 0.2 | ip | 78.22±14.52* | 110.21 |
慢性生理鹽水組 | 0.2 | ig | 38.29±12.34 | |
慢性高劑量藥物組 | 0.4 | ig | 55.63±16.86△ | 45.29 |
慢性低劑量藥物組 | 0.2 | ig | 56.68±20.33△ | 48.03 |
*急性組內(nèi)P＜0.01，△慢性試驗(yàn)中藥物組與生理鹽水對照組間P＜0.01
2.2 減壓缺氧存活時(shí)間
從表2可見歸芪益母湯注射液腹腔注射能顯著地延長小鼠在減壓缺氧的存活時(shí)間，且藥物組與生理鹽水對照組比P＜0.01異顯著（P＜0.01）。
表2歸芪益母湯對小鼠減壓耐缺氧能力的影響（，n=10）
，n=10）組別 | 劑量 （ml/10g） | 給藥 途徑 | 存活時(shí)間 （min） | 增加 率（%） |
生理鹽水對照組 | 0.2 | ip | 14.67±3.65 | |
歸芪益母湯組 | 0.2 | ip | 25.89±4.67* | 76.48 |
* P＜0.01
2.3 化學(xué)物質(zhì)所致缺氧存活時(shí)間從表3可見，歸芪益母湯腹腔注射具有拮抗氰化鉀抑制呼吸酶的作用，從而明顯地延長氰化鉀所致缺氧小鼠的存活時(shí)間，與生理鹽水對照組比較具有極顯著性差異（P＜0.01）。
表3歸芪益母湯對小鼠耐氰化鉀所致缺氧能力影響（，n=15）
，n=15）組別 | 存活時(shí)間（min） | 增加率（%） |
生理鹽水組 | 2.52±0.45 | |
歸芪益母湯組 | 8.59±2.71* | 240.87 |
* P＜0.001
2.4 對血虛小鼠紅細(xì)胞及血紅蛋白的影響由表4可見，血虛模型小鼠的紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白與首日失血前的正常值間存在顯著差異（P＜0.01），說明所建血虛模型成功。血虛小鼠給予歸芪益母湯1周后，其紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白的恢復(fù)率明顯高于生理鹽水對照組（P＜0.01），說明歸芪益母湯具有促進(jìn)血虛動(dòng)物紅細(xì)胞和血紅蛋白增生的作用。
表4歸芪益母湯對小鼠紅細(xì)胞及血紅蛋白的影響（，n=16）
，n=16）組別 | 紅細(xì)胞數(shù) （1×1012/L） | 紅細(xì)胞恢復(fù)率（%） | 血紅蛋白（g/L） | H恢復(fù)率（%） |
正常組 | 8.12±0.76 | | 140.83±12.53 | |
血虛模型組 | 6.01±0.53* | | 114.46±11.22* | |
歸芪益母湯組 | 7.81±0.48△ | 96.18 | 137.83±13.22 | 97.87 |
生理鹽水組 | 7.04±0.38 | 86.69 | 125.01±11.15 | 88.77 |
*血虛模型組與正常組比較P＜0.001，△歸芪益母湯組與生理鹽水組比較P＜0.01
2.5 對小鼠急性缺氧再暴露后MDA生成的影響從表5可見，空白對照組與生理鹽水組相比，MDA的生成有顯著性差異（P＜0.01），說明小鼠急性缺氧再暴露后，體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的形成明顯增加。而歸芪益母湯組與生理鹽組相比，MDA的形成顯著減少，且有顯著性差異（P＜0.01），但與空白對照組相比則無明顯差異（P＞0.05）。說明歸芪益母湯能夠抑制小鼠因急性缺氧再暴露誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)的作用。
表5對小鼠急性缺氧再暴露后MDA生成的影響（，n=10）
，n=10）組別 | MDA(nmol/ml) | 增生率（%） |
空白對照組 | 13.87±3.70 | |
生理鹽水組 | 29.57±1.76△ | 113.19 |
歸芪益母湯組 | 15.93±1.37*○ | 14.85 |
2.6 對H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞溶血的影響
從表6可見，歸芪益母湯對H2O2氧化紅細(xì)胞膜誘導(dǎo)的溶血有顯著的抑制作，且有明顯的劑量依賴性，IC50為32.1mg/ml。
表6歸芪益母湯對H2O2誘導(dǎo)小鼠紅細(xì)胞溶血的影響（）
）藥物劑量 | MDA(nMoL/ml) | 增生率（%） | |
生理鹽水組 | 0.936±0.030 | ||
歸 芪 益 母 湯 | 40mg/ml | 0.293±0.044* | 68.70 |
20mg/ml | 0.593±0.026* | 36.65 | |
10mg/ml | 0.706±0.048* | 24.59 | |
*各藥物組與生理鹽水組比較P＜0.01
2.7 對超氧陰離子（O2-）生成的影響從表7可見，歸芪益母湯在體外對超氧陰離子的生成具有顯著的抑制作用，并呈現(xiàn)明顯劑量效應(yīng)，60mg/ml劑量組與30mg/ml劑量組之間亦存在顯著性差異（P＜0.01）。
表7歸芪益母湯對O2-生成的影響（）
）藥物劑量 | OD值（420nm） | 抑制率（%） | |
生理鹽水組 | 0.231±0.005 | | |
歸 芪 益 母 湯 | 30mg/ml | 0.151±0.003* | 34.63 |
60mg/ml | 0.095±0.008*△ | 58.87 | |
* 歸芪益母湯組與生理鹽水組比較P＜0.01
△60mg/ml組與30mg/ml組比較P＜0.01
3、討論3.1 歸芪益母湯是以大補(bǔ)脾肺之氣的黃芪為主，以當(dāng)歸養(yǎng)血補(bǔ)血，益母草活血祛瘀，是臨床治療勞役過度所致的氣血俱虛及產(chǎn)后血虛、瘀滯腹痛等癥的常用方劑。本次實(shí)驗(yàn)研究表明，歸芪益母湯對小鼠的常壓缺氧、減壓缺氧、氰化鉀所致組織缺氧等都有顯著地延長存活時(shí)間的功能，與對照組相比都具有顯著性差異。其中，效果是以腹腔注射給藥法最理想，如常壓注射組、氰化鉀缺氧實(shí)驗(yàn)中分別提高耐受率達(dá)110.21%和240.87%。有關(guān)黃芪、當(dāng)歸[3-6]具有提高小鼠耐氧能的報(bào)道較多，但提高能力僅在25%~45%之間。說明歸芪益母在提高小鼠耐缺氧能力方面和組方的合理性方面有獨(dú)特之處。
3.2 正常動(dòng)物體在有氧代謝過程中，氧化還原反應(yīng)伴有超氧陰離子自由基（O2-）、羥自由基（OH? ）乃至H2O2等自由基的生成。體內(nèi)又存在酶及非酶類清除自由基的完整體系，能夠直接清除自由基及其毒性。然而當(dāng)動(dòng)物體缺血缺氧時(shí)能引起組織呼吸受阻，能量代謝障礙等一系列變化，當(dāng)豐富的血氧再供給時(shí)，可造成缺血、缺氧組織大量自由基的瞬時(shí)產(chǎn)生，從而遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過機(jī)體清除自由基的能力，致使產(chǎn)生多量自由基而引起組織損傷及病理改變[2-8]。自由基可直接破壞細(xì)胞膜的成分，引起脂質(zhì)過氧化瀑布效應(yīng)，損傷膜結(jié)構(gòu)及其功能。另一方面，可引發(fā)一系列自由基反應(yīng)，形成的產(chǎn)物直接破壞蛋白質(zhì)和DNA，使蛋白質(zhì)和DNA交聯(lián)而喪失活性功能，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[9]。本文體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，歸芪益母湯對O2-的產(chǎn)生有顯著抑制作用，對H2O2氧化細(xì)胞膜所誘發(fā)的溶血亦具有明顯的抑制作用；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，歸芪益母湯對小鼠缺氧后再暴露所引起的過氧化脂質(zhì)代謝產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生具有極顯著的抑制作用，這說明歸芪益母湯在體內(nèi)能抑制自由基的產(chǎn)生，減少因自由基及其產(chǎn)物所引起的各種損傷，從而保證組織正?；盍?，這可能亦是其提高小鼠耐缺氧能力的分子機(jī)理之一，但作用的確切分子機(jī)理還需作進(jìn)一步的研究探討。