付本懂1，張繼東2，鐘秀會(huì)1，李淑芳2，楊淑亞3，苑方重1 （1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定 071001；2. 湛江海洋大學(xué)，動(dòng)物科學(xué)系，廣東. 湛江.524005；3.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，河北.保定.071000） | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
關(guān)鍵詞：生物牛黃中間體；天然牛黃；人工牛黃；抗病毒作用；血液流變學(xué) 牛黃是一種常用的名貴中藥，味苦、甘，性涼。歸心、肝經(jīng)。具有清心解毒、涼肝息風(fēng)、豁痰開(kāi)竅等功效。因天然牛黃藥源緊缺，人們一直進(jìn)行著牛黃代用品的研究，如人工牛黃、培植牛黃等。但這些代用品與天然牛黃相比都有其一定的局限性。本試驗(yàn)運(yùn)用比較藥理學(xué)方法對(duì)生物牛黃中間體與天然牛黃、人工牛黃在抗病毒及血液流變學(xué)方面進(jìn)行了藥效學(xué)比較研究，旨在為生物牛黃中間體進(jìn)一步應(yīng)用于臨床實(shí)踐，提供藥效學(xué)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 試驗(yàn)材料 1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠：清潔級(jí)，200～250g，雌雄兼用，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心； 大耳白兔：健康，1.5kg左右，雌雄兼用，購(gòu)自保定市某養(yǎng)兔場(chǎng)； 9日齡雞胚：新城疫病毒、法氏囊病毒、馬立克病毒檢查陰性，由瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司惠贈(zèng)。 1.1.2?病毒 新城疫Ⅰ系疫苗毒株，由瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司惠贈(zèng)。 1.1.3?主要試劑 生物牛黃中間體：河北省畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物臨床醫(yī)學(xué)研究中心制備，紅黃色粉末，味苦； 天然牛黃：購(gòu)自河北省安國(guó)市藥材市場(chǎng)； 人工牛黃：購(gòu)自河北省安國(guó)市藥材市場(chǎng)； 胰蛋白酶(1:250)：Difco公司生產(chǎn),0152-17 ； RPMI Medium 1640：GIBCO公司生產(chǎn),Lot NO.1120708； 胎牛血清(無(wú)支原體)：三利生物制品廠生產(chǎn),20021002 。 1.1.4 主要器材 VISCOMETER R80 autowash STEELLEX：北京中勤世帝科學(xué)儀器有限公司； Sysmex CA-500 SERIES：北京威士達(dá)醫(yī)療有限公司； 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板：美國(guó) Costar公司生產(chǎn)。 1.2 試驗(yàn)方法 1.2.1 生物牛黃中間體的抗病毒作用 1.2.1.1 大鼠含藥血清的制備 選擇日齡相同，體重接近的SD大鼠，雌雄兼用，隨機(jī)分為6組，每組5只，即生理鹽水組（1ml/kg體重），天然牛黃組（50mg/kg體重），人工牛黃組（50mg/kg體重），生物牛黃Ⅰ組（25mg/kg體重）,生物牛黃Ⅱ組（50mg/kg體重），生物牛黃Ⅲ組（100mg/kg）。每天灌胃2次，連續(xù)給藥3d，最后一次給藥后1~2h內(nèi)，無(wú)菌采血，采血后置4℃冰箱內(nèi)過(guò)夜。3000rpm，離心15min，取血清，加入雙抗，置4℃冰箱內(nèi)保存。加入96孔培養(yǎng)板前大鼠含藥血清在56℃，30min條件下，進(jìn)行滅活。 1.2.1.2 半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染試驗(yàn)（TCID50） 參照殷震(1997)[1]試驗(yàn)方法，將新城疫Ⅰ系疫苗毒用Hanks液10倍遞增稀釋成10-4~10-12，取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)24h的單層雞胚成纖維細(xì)胞，每個(gè)稀釋度接種8孔，每孔20μl。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照孔。37℃吸附1h，加入用維持液稀釋10倍的大鼠含藥血清200μl，于37℃，5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變（CPE）情況至第7d，記錄接種病毒后細(xì)胞病變情況，按Reed-Muench二氏法求病毒對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞的TCID50。 1.2.2 生物牛黃中間體對(duì)家兔血液流變學(xué)指標(biāo)的影響 1.2.2.1 試驗(yàn)組的設(shè)定 健康大耳白兔，體重1.5kg左右，雌雄兼用，隨機(jī)分為7組，每組5只，即空白對(duì)照組、生理鹽水組（5ml/kg體重）、天然牛黃組（50mg/kg體重）、人工牛黃組（50mg/kg體重）、生物牛黃Ⅰ組（25mg/kg體重）、生物牛黃Ⅱ組（50mg/kg體重）、生物牛黃Ⅲ組（100mg/kg體重）。 除空白對(duì)照組外，其它各組每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥3d，于給藥的第2d和第3d同時(shí)應(yīng)用高分子右旋糖酐（10%高分子右旋糖酐，5ml/kg體重，參照文獻(xiàn)[2]實(shí)驗(yàn)方法制備）耳靜脈注射造模，每天耳靜脈注射2次，于最后一次注射15min后，采血，注入含有抗凝劑的試管中，測(cè)定血液流變學(xué)指標(biāo)。 1.2.2.2 血液流變學(xué)指標(biāo)的測(cè)定 (1)血液粘度的測(cè)定：按VISCOMETER R80血液粘度儀操作手冊(cè)測(cè)定。 (2)紅細(xì)胞沉降率的測(cè)定：應(yīng)用Westergren's 法。 (3)紅細(xì)胞比容的測(cè)定：應(yīng)用Wintrobe法。 (4)纖維蛋白原的測(cè)定：應(yīng)用Clauss法，按Sysmex CA-500測(cè)定儀操作手冊(cè)測(cè)定。 1.2.3 統(tǒng)計(jì)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析處理。 2結(jié)果 2.1 生物牛黃中間體抗病毒作用 病毒接種細(xì)胞后，于37℃，5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)，逐日觀察至第7d，記錄細(xì)胞病變情況。各組測(cè)定的TCID50分別為：空白對(duì)照組，10.66/0.1ml；生理鹽水組，9.15/0.1m；天然牛黃組，9.11/0.1m；人工牛黃組，11.45/0.1m；生物牛黃Ⅰ組，11.56/0.1m；生物牛黃Ⅱ組，11.42/0.1m；生物牛黃Ⅲ組，11.47/0.1m。 2.2 生物牛黃中間體對(duì)家兔血液流變學(xué)指標(biāo)的影響 生物牛黃中間體對(duì)家兔血液流變學(xué)指標(biāo)的影響見(jiàn)表1。試驗(yàn)結(jié)果表明，生物牛黃25、50、100mg/kg體重劑量灌胃給藥，可以明顯地降低高分子右旋糖酐所致“血瘀”家兔的血沉值、血沉方程K值和紅細(xì)胞聚集指數(shù)。天然牛黃50mg/kg體重劑量組對(duì)血沉值和血沉方程K值具有顯著降低作用。人工牛黃50mg/kg體重劑量組對(duì)血沉值具有顯著降低作用。與天然牛黃組、人工牛黃組比較，生物牛黃Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組對(duì)“血瘀”家兔的血沉值和血沉方程K值的抑制作用更加顯著（P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表1。 表1 生物牛黃中間體對(duì)家兔血液流變學(xué)指標(biāo)的影響
（2）a，表示試驗(yàn)組與生理鹽水組比較，差異顯著(P<0.05)；A，表示試驗(yàn)組與生理鹽水組比較，差異極顯著(P<0.01)； （3）b，表示生物牛黃組與天然牛黃組比較，差異顯著(P<0.05)；B，表示生物牛黃組與天然牛黃組比較，差異極顯著(P<0.01)； （4）c,表示生物牛黃組與人工牛黃組比較，差異顯著(P<0.05)；C，表示生物牛黃組與人工牛黃組比較，差異極顯著(P<0.01)。 3討論 3.1 生物牛黃中間體的抗病毒作用 據(jù)報(bào)道對(duì)于中草藥的抗病毒作用，前人運(yùn)用了多種方法進(jìn)行研究，如運(yùn)用中藥提取液或提取成分，在雞胚以及體外培養(yǎng)細(xì)胞上[3-6] 進(jìn)行抗病毒試驗(yàn)。但是直接運(yùn)用中藥提取液或提取成分進(jìn)行抗病毒試驗(yàn)不能很好地體現(xiàn)中藥體內(nèi)和體外效果的一致性。所以，近年來(lái)開(kāi)始應(yīng)用動(dòng)物中藥含藥血清[7,8]進(jìn)行中藥藥理學(xué)研究。為了探討生物牛黃中間體的抗病毒作用，本試驗(yàn)采用大鼠的含藥血清在雞胚成纖維細(xì)胞上對(duì)新城疫Ⅰ系疫苗毒株的作用進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，天然牛黃組與空白對(duì)照組比較，TCID50降低1.5個(gè)滴度左右，顯示天然牛黃組大鼠10倍稀釋血清，滅活后，對(duì)新城疫Ⅰ系疫苗毒株在雞胚成纖維細(xì)胞上有一定的抑制作用。這種抑制作用可能與天然牛黃在體內(nèi)的某種代謝成分與病毒進(jìn)行互相作用有關(guān)。 本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，生物牛黃Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組和人工牛黃組與生理鹽水組比較，加大了新城疫Ⅰ系疫苗毒在雞胚成纖維細(xì)胞上的TCID50，說(shuō)明生物牛黃Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組和人工牛黃組的10倍稀釋大鼠含藥血清，滅活后，加大了新城疫Ⅰ系疫苗毒對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞的毒性。這是否與生物牛黃中間體和人工牛黃在大鼠體內(nèi)某一具體代謝途徑和代謝產(chǎn)物有關(guān)，還有待于進(jìn)一步探討。 3.2 生物牛黃中間體對(duì)家兔血液流變學(xué)指標(biāo)的影響 血液流變學(xué)是研究血液固有的流動(dòng)與變形特性的一門(mén)交叉學(xué)科，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，血液流變學(xué)與心腦血管疾病、糖尿病等顯著相關(guān)[9]。鑒于牛黃具有清心解毒、豁痰開(kāi)竅等功效，其有可能通過(guò)影響機(jī)體的血液流變學(xué)指標(biāo)來(lái)發(fā)揮藥效。所以對(duì)生物牛黃中間體、天然牛黃和人工牛黃進(jìn)行了血液流變學(xué)方面的研究。 紅細(xì)胞聚集是紅細(xì)胞之間的可逆性粘附。紅細(xì)胞聚集性增強(qiáng)是體內(nèi)血栓形成的危險(xiǎn)因素之一,它可引起血流阻力增加,微循環(huán)淤滯,血流速度減慢,而血流速度減慢又有利于紅細(xì)胞的聚集,從而構(gòu)成惡性循環(huán)。右旋糖酐是常用的研究紅細(xì)胞聚集的橋連物質(zhì)。一般認(rèn)為,高分子右旋糖酐是一種中性多糖類(lèi)高分子化合物,它的一端附著在一個(gè)紅細(xì)胞的表面,另一端附著在相鄰的另一個(gè)紅細(xì)胞表面,于是形成橋連,使紅細(xì)胞相互疊連起來(lái)[10]。本試驗(yàn)中, 生物牛黃Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組可以明顯地降低高分子右旋糖酐所致“血瘀”家兔的血沉值、血沉方程K值和紅細(xì)胞聚集指數(shù)。天然牛黃組對(duì)血沉值和血沉方程K值具有顯著降低作用。人工牛黃組對(duì)血沉值也具有顯著降低作用。說(shuō)明生物牛黃中間體、天然牛黃和人工牛黃可以抑制高分子右旋糖酐引起的紅細(xì)胞的聚集。與天然牛黃、人工牛黃相比，生物牛黃中間體作用更加顯著。其機(jī)制一方面可能是它們作為一個(gè)大分子占據(jù)紅細(xì)胞表面大分子結(jié)合位點(diǎn),與橋連大分子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,或者是通過(guò)作為一種空間障礙而阻礙了大分子橋聯(lián)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，另一方面也可能與它們能夠保護(hù)紅細(xì)胞膜本身有關(guān)。故通過(guò)影響機(jī)體的血液流變學(xué)指標(biāo)，有可能是牛黃發(fā)揮藥效的途徑之一。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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