付本懂1，張繼東2，鐘秀會1，李淑芳2，楊淑亞3，苑方重1 （1. 河北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，河北保定 071001；2. 湛江海洋大學，動物科學系，廣東. 湛江.524005；3.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，河北.保定.071000） | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
關(guān)鍵詞：生物牛黃中間體；天然牛黃；人工牛黃；抗病毒作用；血液流變學 牛黃是一種常用的名貴中藥，味苦、甘，性涼。歸心、肝經(jīng)。具有清心解毒、涼肝息風、豁痰開竅等功效。因天然牛黃藥源緊缺，人們一直進行著牛黃代用品的研究，如人工牛黃、培植牛黃等。但這些代用品與天然牛黃相比都有其一定的局限性。本試驗運用比較藥理學方法對生物牛黃中間體與天然牛黃、人工牛黃在抗病毒及血液流變學方面進行了藥效學比較研究，旨在為生物牛黃中間體進一步應(yīng)用于臨床實踐，提供藥效學基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 試驗材料 1.1.1 試驗動物 SD大鼠：清潔級，200～250g，雌雄兼用，購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心； 大耳白兔：健康，1.5kg左右，雌雄兼用，購自保定市某養(yǎng)兔場； 9日齡雞胚：新城疫病毒、法氏囊病毒、馬立克病毒檢查陰性，由瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司惠贈。 1.1.2?病毒 新城疫Ⅰ系疫苗毒株，由瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司惠贈。 1.1.3?主要試劑 生物牛黃中間體：河北省畜牧獸醫(yī)研究所動物臨床醫(yī)學研究中心制備，紅黃色粉末，味苦； 天然牛黃：購自河北省安國市藥材市場； 人工牛黃：購自河北省安國市藥材市場； 胰蛋白酶(1:250)：Difco公司生產(chǎn),0152-17 ； RPMI Medium 1640：GIBCO公司生產(chǎn),Lot NO.1120708； 胎牛血清(無支原體)：三利生物制品廠生產(chǎn),20021002 。 1.1.4 主要器材 VISCOMETER R80 autowash STEELLEX：北京中勤世帝科學儀器有限公司； Sysmex CA-500 SERIES：北京威士達醫(yī)療有限公司； 96孔細胞培養(yǎng)板：美國 Costar公司生產(chǎn)。 1.2 試驗方法 1.2.1 生物牛黃中間體的抗病毒作用 1.2.1.1 大鼠含藥血清的制備 選擇日齡相同，體重接近的SD大鼠，雌雄兼用，隨機分為6組，每組5只，即生理鹽水組（1ml/kg體重），天然牛黃組（50mg/kg體重），人工牛黃組（50mg/kg體重），生物牛黃Ⅰ組（25mg/kg體重）,生物牛黃Ⅱ組（50mg/kg體重），生物牛黃Ⅲ組（100mg/kg）。每天灌胃2次，連續(xù)給藥3d，最后一次給藥后1~2h內(nèi)，無菌采血，采血后置4℃冰箱內(nèi)過夜。3000rpm，離心15min，取血清，加入雙抗，置4℃冰箱內(nèi)保存。加入96孔培養(yǎng)板前大鼠含藥血清在56℃，30min條件下，進行滅活。 1.2.1.2 半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染試驗（TCID50） 參照殷震(1997)[1]試驗方法，將新城疫Ⅰ系疫苗毒用Hanks液10倍遞增稀釋成10-4~10-12，取96孔細胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)24h的單層雞胚成纖維細胞，每個稀釋度接種8孔，每孔20μl。同時設(shè)空白對照孔。37℃吸附1h，加入用維持液稀釋10倍的大鼠含藥血清200μl，于37℃，5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，逐日觀察細胞病變（CPE）情況至第7d，記錄接種病毒后細胞病變情況，按Reed-Muench二氏法求病毒對雞胚成纖維細胞的TCID50。 1.2.2 生物牛黃中間體對家兔血液流變學指標的影響 1.2.2.1 試驗組的設(shè)定 健康大耳白兔，體重1.5kg左右，雌雄兼用，隨機分為7組，每組5只，即空白對照組、生理鹽水組（5ml/kg體重）、天然牛黃組（50mg/kg體重）、人工牛黃組（50mg/kg體重）、生物牛黃Ⅰ組（25mg/kg體重）、生物牛黃Ⅱ組（50mg/kg體重）、生物牛黃Ⅲ組（100mg/kg體重）。 除空白對照組外，其它各組每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥3d，于給藥的第2d和第3d同時應(yīng)用高分子右旋糖酐（10%高分子右旋糖酐，5ml/kg體重，參照文獻[2]實驗方法制備）耳靜脈注射造模，每天耳靜脈注射2次，于最后一次注射15min后，采血，注入含有抗凝劑的試管中，測定血液流變學指標。 1.2.2.2 血液流變學指標的測定 (1)血液粘度的測定：按VISCOMETER R80血液粘度儀操作手冊測定。 (2)紅細胞沉降率的測定：應(yīng)用Westergren's 法。 (3)紅細胞比容的測定：應(yīng)用Wintrobe法。 (4)纖維蛋白原的測定：應(yīng)用Clauss法，按Sysmex CA-500測定儀操作手冊測定。 1.2.3 統(tǒng)計方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS軟件系統(tǒng)進行分析處理。 2結(jié)果 2.1 生物牛黃中間體抗病毒作用 病毒接種細胞后，于37℃，5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)，逐日觀察至第7d，記錄細胞病變情況。各組測定的TCID50分別為：空白對照組，10.66/0.1ml；生理鹽水組，9.15/0.1m；天然牛黃組，9.11/0.1m；人工牛黃組，11.45/0.1m；生物牛黃Ⅰ組，11.56/0.1m；生物牛黃Ⅱ組，11.42/0.1m；生物牛黃Ⅲ組，11.47/0.1m。 2.2 生物牛黃中間體對家兔血液流變學指標的影響 生物牛黃中間體對家兔血液流變學指標的影響見表1。試驗結(jié)果表明，生物牛黃25、50、100mg/kg體重劑量灌胃給藥，可以明顯地降低高分子右旋糖酐所致“血瘀”家兔的血沉值、血沉方程K值和紅細胞聚集指數(shù)。天然牛黃50mg/kg體重劑量組對血沉值和血沉方程K值具有顯著降低作用。人工牛黃50mg/kg體重劑量組對血沉值具有顯著降低作用。與天然牛黃組、人工牛黃組比較，生物牛黃Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組對“血瘀”家兔的血沉值和血沉方程K值的抑制作用更加顯著（P<0.01）。結(jié)果見表1。 表1 生物牛黃中間體對家兔血液流變學指標的影響
（2）a，表示試驗組與生理鹽水組比較，差異顯著(P<0.05)；A，表示試驗組與生理鹽水組比較，差異極顯著(P<0.01)； （3）b，表示生物牛黃組與天然牛黃組比較，差異顯著(P<0.05)；B，表示生物牛黃組與天然牛黃組比較，差異極顯著(P<0.01)； （4）c,表示生物牛黃組與人工牛黃組比較，差異顯著(P<0.05)；C，表示生物牛黃組與人工牛黃組比較，差異極顯著(P<0.01)。 3討論 3.1 生物牛黃中間體的抗病毒作用 據(jù)報道對于中草藥的抗病毒作用，前人運用了多種方法進行研究，如運用中藥提取液或提取成分，在雞胚以及體外培養(yǎng)細胞上[3-6] 進行抗病毒試驗。但是直接運用中藥提取液或提取成分進行抗病毒試驗不能很好地體現(xiàn)中藥體內(nèi)和體外效果的一致性。所以，近年來開始應(yīng)用動物中藥含藥血清[7,8]進行中藥藥理學研究。為了探討生物牛黃中間體的抗病毒作用，本試驗采用大鼠的含藥血清在雞胚成纖維細胞上對新城疫Ⅰ系疫苗毒株的作用進行試驗。結(jié)果表明，天然牛黃組與空白對照組比較，TCID50降低1.5個滴度左右，顯示天然牛黃組大鼠10倍稀釋血清，滅活后，對新城疫Ⅰ系疫苗毒株在雞胚成纖維細胞上有一定的抑制作用。這種抑制作用可能與天然牛黃在體內(nèi)的某種代謝成分與病毒進行互相作用有關(guān)。 本試驗發(fā)現(xiàn)，生物牛黃Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組和人工牛黃組與生理鹽水組比較，加大了新城疫Ⅰ系疫苗毒在雞胚成纖維細胞上的TCID50，說明生物牛黃Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組和人工牛黃組的10倍稀釋大鼠含藥血清，滅活后，加大了新城疫Ⅰ系疫苗毒對雞胚成纖維細胞的毒性。這是否與生物牛黃中間體和人工牛黃在大鼠體內(nèi)某一具體代謝途徑和代謝產(chǎn)物有關(guān)，還有待于進一步探討。 3.2 生物牛黃中間體對家兔血液流變學指標的影響 血液流變學是研究血液固有的流動與變形特性的一門交叉學科，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，血液流變學與心腦血管疾病、糖尿病等顯著相關(guān)[9]。鑒于牛黃具有清心解毒、豁痰開竅等功效，其有可能通過影響機體的血液流變學指標來發(fā)揮藥效。所以對生物牛黃中間體、天然牛黃和人工牛黃進行了血液流變學方面的研究。 紅細胞聚集是紅細胞之間的可逆性粘附。紅細胞聚集性增強是體內(nèi)血栓形成的危險因素之一,它可引起血流阻力增加,微循環(huán)淤滯,血流速度減慢,而血流速度減慢又有利于紅細胞的聚集,從而構(gòu)成惡性循環(huán)。右旋糖酐是常用的研究紅細胞聚集的橋連物質(zhì)。一般認為,高分子右旋糖酐是一種中性多糖類高分子化合物,它的一端附著在一個紅細胞的表面,另一端附著在相鄰的另一個紅細胞表面,于是形成橋連,使紅細胞相互疊連起來[10]。本試驗中, 生物牛黃Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組可以明顯地降低高分子右旋糖酐所致“血瘀”家兔的血沉值、血沉方程K值和紅細胞聚集指數(shù)。天然牛黃組對血沉值和血沉方程K值具有顯著降低作用。人工牛黃組對血沉值也具有顯著降低作用。說明生物牛黃中間體、天然牛黃和人工牛黃可以抑制高分子右旋糖酐引起的紅細胞的聚集。與天然牛黃、人工牛黃相比，生物牛黃中間體作用更加顯著。其機制一方面可能是它們作為一個大分子占據(jù)紅細胞表面大分子結(jié)合位點,與橋連大分子競爭結(jié)合,或者是通過作為一種空間障礙而阻礙了大分子橋聯(lián)來實現(xiàn)的，另一方面也可能與它們能夠保護紅細胞膜本身有關(guān)。故通過影響機體的血液流變學指標，有可能是牛黃發(fā)揮藥效的途徑之一。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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