中藥添加劑對高溫中豬血清抗氧化功能的影響
宋小珍 毛帥 劉鳳華 王恬
（1.南京農(nóng)業(yè)大學動物科學院 南京210095 2.江西農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院 南昌330045
（1.南京農(nóng)業(yè)大學動物科學院 南京210095 2.江西農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院 南昌330045
3.北京農(nóng)學院動物科技系 北京102206）
隨著全球氣候的逐步變暖，夏季高溫高濕氣候給規(guī)?；B(yǎng)豬生產(chǎn)帶來的負面影響相當嚴重。熱應(yīng)激是畜禽在外界高溫環(huán)境刺激下所出現(xiàn)的全身性非特異反應(yīng)。在熱應(yīng)激狀態(tài)下，豬體內(nèi)自由基大量產(chǎn)生，細胞膜流動性下降，膜功能受損，對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收轉(zhuǎn)運能力下降(Gerald Karp,2005)。目前國內(nèi)外關(guān)于應(yīng)激的調(diào)控，大都使用化學添加劑如電解質(zhì)、鎮(zhèn)靜劑、抗生素、維生素、微量元素等，多數(shù)是治標不治本，且容易出現(xiàn)毒副作用和藥殘（李英哲等，2001；徐荷等，1997）。中藥添加劑是以中醫(yī)藥理論為指導， “以調(diào)為本，以平為期”，在組方時注重從平衡陰陽、全面調(diào)節(jié)畜禽機體免疫力入手；且其具有獨特的天然性，毒副作用小，在調(diào)控畜禽熱應(yīng)激綜合癥上應(yīng)用前景廣闊。但目前有關(guān)中藥添加劑抗應(yīng)激的研究大多集中在對畜禽生產(chǎn)性能的影響上，有關(guān)中藥添加劑對熱應(yīng)激中機體抗氧化能力的調(diào)控作用鮮見報道。
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)是機體的兩大抗氧化酶系統(tǒng)，對清除體內(nèi)過量的自由基，維持氧自由基代謝的平衡起著重要的作用；丙二醛（malondialdehyde,MDA）是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)鏈式終止階段產(chǎn)生的小分子產(chǎn)物，其含量可以間接反映自由基的產(chǎn)生情況和機體組織細胞的脂質(zhì)過氧化程度（李繼紅等，2003）。本試驗試圖通過觀察高溫下添加抗應(yīng)激中藥飼料添加劑，對高溫環(huán)境下豬血液中SOD、GSH-Px、MDA等一些與自由基有關(guān)的生化指標的動態(tài)影響，研究并探討中藥添加劑對豬的抗應(yīng)激效果及機理。
1．材料與方法1.1試驗材料
1.1.1實驗地點：中國農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所動物營養(yǎng)重點實驗室人工氣候室。
1.1.2實驗動物：64只35日齡、體重6.50±1.05Kg的中國試驗用小型豬（CEMP，農(nóng)大I系）, 常規(guī)免疫。購自中國農(nóng)業(yè)大學昌平試驗豬場。
1.1.3中藥添加劑： 方1：由石膏、藿香、蒼術(shù)、黃柏按等比例組成。方2：由石膏、藿香、蒼術(shù)、黃柏按0.5：1：1：1比例組成。
1.1.4試驗基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。
表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平
原料（Ingredients） 組成/%（Comp osition） | 營養(yǎng)成分（Nutrient levels） 含量(Content) |
| 玉米（Corn ） 52.0 | 消化能DE/(MJ·kg-1) 13.89 |
| 豆粕（Soybean meal） 13.0 | 粗蛋白CP/% 20.00 |
| 魚粉（Fish meal） 6.0 | 鈣Calcium/% 0.95 |
| 乳清粉（Whey） 6.0 | 總磷(Total Phosphorus)/% 0.70 |
| 膨化大豆（Expanded soybean）16.0 | 有效磷(Available Phosphorus)/% 0.49 |
| 小麥麩（Wheat bran） 3.0 | 賴氨酸(L-L ys)/% 1.35 |
| 預混料（Premix） 4.0 | 蛋+胱氨酸(Met + Cys)/% 0.66 |
注：4% 預混料為每千克全價料提供Cu 200mg、Fe 120mg、Zn 120mg、Mn 50mg、Co 2.0mg、Se 0.3mg、I 0.45mg、維生素A 800IU、維生素D31 800IU、維生素E 30IU、維生素B11.8mg、維生素B2 6mg、維生素B12 0.024mg、葉酸0.3mg、生物素0.44mg、煙酸3.2mg、膽堿800mg。
1.1.5主要試劑、實驗儀器：SOD、GSH-Px、MDA測試試劑盒，南京建成有限公司。紫外－可見分光光度計UV-2000。
1.2 試驗動物分組
本試驗采用農(nóng)大小型實驗豬64頭，按窩別、體重相近原則分成4組，分別為常溫對照組（簡稱對照組）、高溫應(yīng)激組（簡稱應(yīng)激組）、中藥添加劑1組（簡稱方1組）和中藥添加劑2組（簡稱方2組）。每組4個重復，每重復4頭豬。
1.3 飼養(yǎng)管理
預飼期，各處理組豬的飼養(yǎng)水平、環(huán)境完全相同，試豬自由采食和飲水。正式試驗期間，各組實驗豬均飼養(yǎng)于人工氣候室中（對照組的飼養(yǎng)環(huán)境溫度設(shè)為23℃恒溫，應(yīng)激組和兩個中藥方劑組的飼養(yǎng)環(huán)境溫度根據(jù)前期試驗得出的熱應(yīng)激模型設(shè)溫為26℃~40℃循環(huán)變溫，見圖1），各處理組的環(huán)境濕度、設(shè)置完全一致（詳見表2試驗設(shè)計）。各處理基礎(chǔ)日糧完全相同，自由飲水。其中，中藥添加劑1組和2組在基礎(chǔ)日糧上按0.5%添加中藥添加劑方1和方2。
表2 試驗設(shè)計
處理(treat) | 日糧(diet) | 環(huán)境溫度（environmental temperature） |
| 對照組(NTC) | 基礎(chǔ)日糧(basal diet) | 溫度(T)：23℃；濕度(H)：60%；光照度(L)：100LX |
| 應(yīng)激組(HTS) | 基礎(chǔ)日糧(basal diet) | 溫度(T)：26~40℃；濕度(H)：60%；光照度(L)：100LX |
| 方1組 (CMAΙ) | 基礎(chǔ)日糧(basal diet)+0.5％中藥添加劑1(Chinese medicine additives Ι) | 溫度(T)：26~40℃；濕度(H)：60%；光照度(L)：100LX |
| 方2組 (CMAⅡ) | 基礎(chǔ)日糧(basal diet)+0.5％中藥添加劑2(Chinese medicine additivesⅡ) | 溫度(T)：26~40℃；濕度(H)：60%；光照度(L)：100LX |
人工氣候艙溫度曲線如圖1：
圖1 人工氣候室溫度曲線
（X軸為時間0：00－22：00，Y軸為溫度0－45℃）
（X軸為時間0：00－22：00，Y軸為溫度0－45℃）
1.4 樣品采集與制備
在熱應(yīng)激正式試驗第1、2、4、6、10天從每重復中選1只小豬（每組4只），頸靜脈采血10ml，靜置（離心）析出血清，于-20℃箱中保存?zhèn)溆谩?br /> 1.5測試指標與方法
SOD : 羥胺法；GSH-PX：DTNB 直接法； MDA: TBA(硫代巴比妥酸)法。采用分光光度計檢測。
1.6 統(tǒng)計分析
采用SAS軟件分析平均數(shù)、標準差，多重比較方差分析。
表3中藥添加劑對熱應(yīng)激豬血清SOD活性的影響 單位：活力單位/毫升（U/ ml）
天數(shù)（d） 處理(treat) | 1 | 2 | 4 | 6 | 10 |
| 對照組(NTC) | 50.91±0.98b | 51.51±8.19 | 52.88±5.51 | 50.48±5.18 | 50.06±5.19 |
| 應(yīng)激組(HST) | 65.06±4.57a | 44.14±3.13 | 48.98±4.58 | 53.06±2.61 | 53.83±8.07 |
| 方1組(CMAΙ) | 56.35±13.48ab | 44.82±5.04 | 49.46±3.62 | 44.78±5.08 | 54.79±6.95 |
| 方2組(CMAⅡ) | 62.76±2.96a | 51.17±5.88 | 51.69±4.41 | 50.31±4.41 | 51.74±4.67 |
由表3可知，各組試豬血清中SOD活性變化主要表現(xiàn)在應(yīng)激后第1天。與對照組相比，應(yīng)激組在第1天顯著升高，而后逐漸下降，到第10天又有所回升，但不出現(xiàn)顯著差異（p>0.05）。方1組的SOD活性與對照組和應(yīng)激組間均無顯著差異（p>0.05）。方2組的SOD活性顯著高于對照組（p<0.05），與應(yīng)激組之間無顯著差異（p>0.05）。
2.2中藥添加劑對熱應(yīng)激豬血清MDA含量的影響
表4? 中藥添加劑對熱應(yīng)激豬血清MDA含量的影響
單位： n mol/ ml
天數(shù)（d） 處理(treat) | 1 | 2 | 4 | 6 | 10 |
| 對照組(NTC) | 3.18±0.95 | 2.99±0.83 | 2.59±1.01 | 3.62±0.07b | 3.58±0.33b |
| 應(yīng)激組(HST) | 3.15±1.41 | 3.55±1.02 | 3.42±0.25 | 4.85±1.29a | 5.19±1.15a |
| 方1組(CMAΙ) | 3.33±0.97 | 2.19±1.18 | 3.09±0.87 | 4.92±0.37a | 4.28±0.41b |
| 方2組(CMAⅡ) | 2.93±0.66 | 3.46±0.48 | 3.15±0.95 | 4.13±0.10ab | 4.10±1.16b |
2.3中藥添加劑對熱應(yīng)激豬血清GSH-PX活性的影響
表5? 中藥添加劑對熱應(yīng)激豬血清GSH-PX活性的影響
單位：酶活力單位/毫升（U/ ml）
天數(shù)（d） 處理(treat) | 1 | 2 | 4 | 6 | 10 |
| 對照組(NTC) | 1259±46 | 1271±156b | 1283±411 | 1195±238b | 1151±314b |
| 應(yīng)激組(HST) | 1262±129 | 1239±96b | 1221±100 | 1681±183a | 1559±268a |
| 方1組(CMAΙ) | 1282±154 | 1616±187ab | 1406±190 | 1565±28a | 1572±255a |
| 方2組(CMAⅡ) | 1225±232 | 1799±381a | 1306±221 | 1480±177ab | 1402±82ab |
3. 討論3.1 高溫應(yīng)激對豬血清中SOD、GSH-PX活力及MDA含量的影響
本實驗結(jié)果顯示，高溫應(yīng)激后豬血清中MDA含量顯著高于常溫組，這表明高溫應(yīng)激加速了機體組織的脂質(zhì)過氧化過程，產(chǎn)生了較多的有害物質(zhì)丙二醛（MDA）。同時，研究也發(fā)現(xiàn)試豬血清中SOD、GSH-PX活力在應(yīng)激后出現(xiàn)明顯增高，這可能是機體氧自由基大量產(chǎn)生刺激了體內(nèi)的自由基清除系統(tǒng)，一定程度上激活了機體的抗氧化酶系統(tǒng)功能。徐荷等（1997）研究熱應(yīng)激對ＳＤ大鼠 SOD 活性的影響發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激后SOD活性升高，持續(xù)熱應(yīng)激后SOD活性下降。Balázs Borsiczky（2003）報道，受熱初期，隨著機體應(yīng)激反應(yīng)，脂質(zhì)過氧化活動的增強，自由基誘發(fā)了抗氧化酶的表達，SOD活性也隨之升高，這是機體的一種代償保護作用，但持續(xù)受熱后，SOD活性則受到抑制。本試驗也發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激后期血清中SOD活性出現(xiàn)下降趨勢，但差異不顯著。許燕等（2000）也報道，應(yīng)激過程中，機體產(chǎn)生的自由基大量增加，同時機體自由基清除系統(tǒng)的活性也增高，隨著應(yīng)激時間的延長，盡管清除系統(tǒng)活性增加，但仍不足以及時將大量的自由基清除織造成了機體氧化和抗氧化的失平衡，從而使細胞破壞，造成組織損傷。但本研究對血清中SOD和GSH-PX兩種抗氧化酶活性動態(tài)分析發(fā)現(xiàn)，兩種酶的變化規(guī)律并不一致，SOD活性在前期顯著上升，后期下降；但GSH-PX活性卻在應(yīng)激后期出現(xiàn)明顯增高，其原因是否與兩者的作用機制有關(guān)，尚需要進一步研究。
3.2 中藥添加劑對應(yīng)激狀態(tài)下豬血液抗氧化功能的影響
本研究結(jié)果顯示，與應(yīng)激組相比，添加中藥添加劑2后，豬血液中MDA含量出現(xiàn)顯著下降；同時，SOD、GSH-Px活性在應(yīng)激后期有下降趨勢，其活力值介于常溫組和高溫組之間。這說明中藥添加劑2能增強機體清除自由基的能力，調(diào)控機體抗氧化酶系統(tǒng)功能，使其保持正常水平。方1組對以上指標也有一定調(diào)控作用，但效果低于方2。這表明在調(diào)控熱應(yīng)激狀態(tài)下豬血清抗氧化功能上，中藥添加劑2的效果優(yōu)于中藥添加劑1。
本試驗中兩個中藥添加劑組成均為石膏、蒼術(shù)、黃柏和藿香等，其主要功效為清熱瀉火、燥濕健脾，解表和中，主要用于緩解動物在夏季高溫高濕環(huán)境中出現(xiàn)的熱應(yīng)激病癥。中藥藥理研究證明，石膏屬清熱瀉火藥，善清氣分實熱，常用于肺胃大熱，高熱不退等實熱亢盛證。研究表明，生石膏可抑制發(fā)熱中樞而起解熱作用。藿香重在化濕，和中止痛，解暑。蒼術(shù)屬燥濕藥（樸世浩，1996）；黃柏具有清濕熱，瀉火毒，退虛熱的作用，以除下焦?jié)駸嶙罴眩ㄍ鹾馄妫?001）。黃柏對應(yīng)激性胃潰瘍有抑制作用且對水浸捆束小鼠SOD活性的降低有明顯的抑制作用（呂燕寧，2006）。四藥合用可通過促進腸道分泌，抑制有害腸道菌群，清除腸道有害自由基等途徑加強對高溫環(huán)境下機體膜結(jié)構(gòu)和功能的保護。但方1中石膏比例較方2高。石膏的變化主要在于劑量變化導致君藥不同。方1以石膏為君藥，主要針對北方高溫干燥氣候，變化急驟，發(fā)自陽明，重在清氣；方2針對南方濕熱氣候，藿香、蒼術(shù)為主，重在健脾化濕、祛濕。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)方2效果優(yōu)于方1，分析可能人工氣候室各參數(shù)設(shè)置與南方夏季高溫高濕的氣候接近有關(guān)。