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畜牧人
標題:
實驗室手冊
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作者:
enwen
時間:
2007-11-5 11:25
標題:
實驗室手冊
實驗室手冊
921
實驗室手冊
ＬＡＢＯＲＴＯＲＹ ?。龋粒危模拢希希?br /> （兼作研究生獸醫(yī)免疫學(xué)實驗技術(shù)指導(dǎo)講義）
焦新安 編
江蘇農(nóng)學(xué)院傳染病教研組
一九九三年三月前言
實驗室是進行教學(xué)和科學(xué)研究的重要基地，為適應(yīng)教學(xué)、科研及實驗室建設(shè)和管理的迫切需要，筆者根據(jù)教研室的教學(xué)、科研實踐情況，以力求簡明和實用為宗旨匯編了這本《實驗室手冊》，共分四個部分，其中第一、第二部分適于實驗室管理和研究生等人員的實驗工作基本素質(zhì)和基本技能的訓(xùn)練；第三部分可用作研究生獸醫(yī)免疫學(xué)實驗指導(dǎo)，亦可供有關(guān)教學(xué)人員參考；第四部分是作為家畜傳染病學(xué)實驗課教師參考教材。整個手冊反應(yīng)了近年來家畜傳染病教研室在教學(xué)、科研、教書育人方面的最新成果，可供同類生物學(xué)實驗室交流和參考。
在編寫過程中得到劉秀梵教授和張如寬教授的審閱和大力支持，室內(nèi)其他同志亦提出了許多寶貴意見，特此致謝！由于時間倉促和編寫水平有限，經(jīng)驗不足，錯誤之處誠望讀者不吝指正。
編者
１９９０年６月
１９９０年我們試編的《實驗室手冊》得到了校內(nèi)外讀者的大力支持，并得到了許多寶貴意見，該手冊正在補充修改之中，可望近期脫稿。
為了滿足研究生獸醫(yī)免疫學(xué)實驗技術(shù)和部分家畜傳染病學(xué)實驗技術(shù)的教學(xué)等急需，我們稍作調(diào)整后重印部分手冊。懇請讀者繼續(xù)提出寶貴意見！
編者
１９９３年３月
目錄
第一部分 實驗室工作手冊
第一章 總則７
附：實驗室一般規(guī)則
第二章細則９
第一節(jié) 無菌室工作須知９
第二節(jié) 送洗須知９
第三節(jié) 試劑的保存和使用須知１０
第四節(jié) 菌種、毒種和細胞株保存須知１１
第五節(jié) 超低溫冰箱和液氮罐使用須知１３
第六節(jié) 高值儀器使用須知１４
第七節(jié) 常用小型儀器使用須知
第八節(jié) 實驗記錄須知
第九節(jié) 值日工作人員的職責(zé)須知
第十節(jié) 文獻資料查閱須知
第十一節(jié) 試驗準備須知
第十二節(jié) 其他注意事項
第二部分 常用儀器的操作程序及使用注意事項
第一節(jié)多功能紫外可見分光光度計
第二節(jié)酶聯(lián)免疫閱讀儀
第三節(jié)電子天平
第四節(jié)各類顯微鏡及顯微攝影技術(shù)
第五節(jié)核酸蛋白檢測儀
第六節(jié)各類離心機
第七節(jié)酸度計
第八節(jié)各類冰箱的使用和保養(yǎng)
第九節(jié)電泳裝置
第十節(jié)空調(diào)機、抽濕機、超靜工作臺
第十一節(jié)自動顆粒制冰機
第十二節(jié)其他儀器設(shè)備
第三部分實驗室常規(guī)試驗程序
第一章 組織培養(yǎng)及常用溶液的配制
第一節(jié)雞成纖維細胞（ＣＥＦ）、鴨成纖維細胞（ＤＥＦ）培養(yǎng)
第二節(jié)組織培養(yǎng)溶液配方
第三節(jié)配制溶液注意事項
第二章淋巴細胞雜交瘤技術(shù)及使用溶液的配制
第一節(jié)配合程序
第二節(jié)溶液配方
第三節(jié)單抗制作技術(shù)中的其他方法
第三章組織培養(yǎng)使用物品的準備
第一節(jié)一般原則
第二節(jié)玻璃器皿的準備
第三節(jié)橡皮制或塑料制品的準備
第四節(jié)其他用品的準備
第五節(jié)純水制備程序
第六節(jié)新生犢牛血清的制備
第四章酶聯(lián)免疫吸附試驗（ＥＬＩＳＡ）的程序
第一節(jié)間接ＥＬＩＳＡ試驗
第二節(jié)直接ＥＬＩＳＡ試驗
第三節(jié)夾心ＥＬＩＳＡ試驗
第四節(jié)競爭ＥＬＩＳＡ試驗
第五節(jié)ＤＯＴ－ＥＬＩＳＡ試驗
第六節(jié)酶標組化法
第七節(jié)ＥＬＩＳＡ常用溶液的配方
第八節(jié)酶標抗體的制備
第五章免疫熒光試驗的程序
第一節(jié)脂多糖敏化甲醛化綿羊紅細胞的制備
第二節(jié)蛋白質(zhì)敏化ＳＰＢＣ的制備
第三節(jié)ＰＨＡ試驗程序
第七章免疫膠體金試驗程序
第八章免疫球蛋白亞類測定
第一節(jié)免疫擴散法
第二節(jié)ＥＬＩＳＡ法
第九章免疫血清制備
第一節(jié) 免疫球蛋白提取與純化
第二節(jié) 幾種常見抗原的制備
第三節(jié) 抗血清的制備程序
第十章細菌學(xué)試驗種的幾個常用技術(shù)
第一節(jié)細菌學(xué)總數(shù)估測
第二節(jié)幾種常用培養(yǎng)記得配方
第三節(jié)常用細菌的分離鑒定程序
第十一章細胞免疫學(xué)試驗程序
第一節(jié)玫瑰花環(huán)試驗
第二節(jié)淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗
第十二章動物試驗的一般規(guī)則
第十三張電泳技術(shù)、層析技術(shù)
第十部分家畜傳染病學(xué)試驗指導(dǎo)
家畜傳染病學(xué)試驗規(guī)則、實驗報告內(nèi)容
實驗一炭疽的診斷
實驗二巴氏桿菌的診斷
實驗三結(jié)核桿菌病和布魯氏桿菌的檢疫
實驗四豬瘟的診斷
實驗五雞新城疫的診斷
Ｉ雞新城疫病病毒的雞胚分離
ＩＩ免疫熒光實驗
ＩＩＩ血凝和血凝抑制實驗
實驗六雞馬立克氏病的瓊擴診斷
實驗七沙門氏菌快速檢測技術(shù)
實驗八雞白痢的檢測
第一部分 實驗室工作守則
第一章總則
一、 嚴禁在實驗室內(nèi)吸煙、飲食（辦公室除外）；嚴禁挪用公物。
二、 所有物品用后立即歸回原處。
三、 菌種、毒種嚴禁帶出實驗室。
四、 各種病毒材料在廢棄前應(yīng)做好無害化處理。
五、 愛護儀器設(shè)備，用后做好清潔整理工作。
六、 使用高值儀器前仔細閱讀儀器說明書，嚴格遵守操作規(guī)程進行操作。初次使用應(yīng)在有關(guān)老師或工作人員指導(dǎo)下進行。
七、 損壞器皿和儀器需登記，并及時向有關(guān)負責(zé)老師匯報。
八、 堅持用水、用電安全，使用電爐時不得離開現(xiàn)場，下班時檢查水電，鎖緊門窗。
九、 厲行節(jié)約。在一切工作中樹立節(jié)約精神，培養(yǎng)集和各種溶液用多少配多少，可以回收的東西及時回收。節(jié)約用電，隨手關(guān)燈。
十、 值日人員應(yīng)履行職責(zé)，并督促其他工作人員做好實驗后的整理工作。
十一、 實驗室內(nèi)所有資料閱后放回原處，一般不得帶出實驗室，特殊情況下需借閱，應(yīng)經(jīng)過批準，并登記。
十二、 每進行一個試驗需事先提出實驗設(shè)計，列出所需材料及藥品清單和經(jīng)費預(yù)算（一式二份）。報請批準后付諸實施（交批準任一份）。
十三、 領(lǐng)用或購置藥品和器材需事先列出申請（一式二份），寫明用途并報請批準（交批準人一份）。
十四、 新進入實驗室工作的研究生須經(jīng)過一段時間的工作訓(xùn)練。熟悉實驗室工作守則，掌握各種器材的清洗消毒等準備工作，掌握各種儀器的使用和保養(yǎng)方法。
十五、 每周六下午為教研室例會（學(xué)術(shù)匯報和討論，工作總結(jié)和安排）和室內(nèi)外衛(wèi)生大掃除。
附一、實驗室一般規(guī)則
一、 實驗事是進行教學(xué)和科研的重要基地，是辦好學(xué)校的基本條件之一。實驗室人員應(yīng)忠誠黨的教育事業(yè)，認真貫徹黨的教育方針，為培養(yǎng)四化建設(shè)有用人才盡職盡責(zé)。
二、 實驗室要堅持改革，按照勤儉辦學(xué)的原則，少花錢，多辦事，辦好事，注意提高效益，反對浪費。
三、 實驗室以實驗教學(xué)為主，在保證教學(xué)和科研任務(wù)的前提下，可以充分利用現(xiàn)有的技術(shù)和設(shè)備條件，積極開展技術(shù)服務(wù)工作。
四、 實驗室應(yīng)保持肅靜、文明、整潔的工作環(huán)境和良好的秩序，實驗室嚴禁吸煙，無關(guān)人員不得進入實驗室，院外人員到實驗室參觀學(xué)習(xí)，須經(jīng)主管部門同意或院領(lǐng)導(dǎo)批準。
五、 加強科學(xué)管理，建立健全必要的規(guī)章制度如各類人員的崗位責(zé)任制，儀器設(shè)備和物資材料使用報關(guān)制度等。
六、 加強安全，劇毒物品要嚴格領(lǐng)用。對易燃易爆、有毒放射性等有害物品，單獨存放，并且指定專人保管，嚴禁隨意亂放和擅自挪用。
七、 實驗室人員和學(xué)生在實驗前應(yīng)做好充分準備，熟悉實驗內(nèi)容和操作規(guī)程，精心實驗。
八、 學(xué)生進入實驗室學(xué)習(xí)，實驗室人員應(yīng)向?qū)W生進行勤儉節(jié)約、安全，以及有關(guān)科技保密等方面的教育，精心指導(dǎo)，確保實驗課順利進行。
九、 實驗人員對實驗室儀器要定期清點，維護保養(yǎng)，開展以儀器完好率、安全、衛(wèi)生等評比活動，對成績顯著的個人和集體進行表揚和獎勵。對工作不負責(zé)造成損失者進行批評教育直至經(jīng)濟處罰和行政處分。
第二章細則
第一節(jié)無菌室工作須知
一、 無菌室內(nèi)非請莫入，非本實驗室人員未經(jīng)批準不得在無菌室內(nèi)工作。
二、 所有藥品器材均為無菌室專用，一般不得帶初無菌室，作為其他用處。
三、 所有物品用后立即放回原處。
四、 進入無菌室工作之前需修剪指甲，手清洗后在用１％新潔爾滅溶液洗手消毒，換鞋進入，使用超靜臺需著無菌室專用工作服并用酒精棉球擦手消毒。超靜臺每次使用后都應(yīng)仔細做好清潔整理工作。
五、 衛(wèi)生值日人員要勤打掃。注意保持無菌室的相對無菌條件，經(jīng)常用新潔爾滅溶液擦洗地面、桌面、臺面和試劑廚。經(jīng)常將無菌室工作服送至洗滌室清洗消毒，使用后的鼠尸及鼠籠隨手帶出無菌室。每日為除濕機倒水。注意無菌時使用藥品、物品的消耗，及時通知工人準備，或匯報負責(zé)老師以便補充。
六、 配培養(yǎng)基和其他試劑都應(yīng)有記錄，瓶子上映注明品質(zhì)、濃度、日期及配制人，使用過的培養(yǎng)基及無菌試劑應(yīng)自覺注明使用人姓名，以防止交叉污染。
七、 嚴格控制細胞之間或病原之間的交叉污染，容易發(fā)生交叉污染的細胞或病毒不能在同一超凈臺內(nèi)處理。
八、 扭力天平使用之后應(yīng)休止，在將讀數(shù)盤回零，托盤及天平表面擦洗干凈，藥勺也應(yīng)洗凈擦干。使用后的藥品應(yīng)將蓋擰緊，放回原處。
九、 離心機使用時應(yīng)注意平衡，使用后將離心杯、橡皮套管清洗干凈，倒置晾干。
十、 ＣＯ２孵箱為通氣培養(yǎng)箱，應(yīng)自覺維護箱內(nèi)清潔，定期將托板、托盤換出消毒。如培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基漏出，立即用酒精棉講瓶外表面跡箱內(nèi)污跡擦拭干凈，箱內(nèi)蒸發(fā)用水威無菌蒸餾水，應(yīng)注意補充。四周水箱內(nèi)的水定期補加。ＣＯ２濃度、溫度控制器等零部件請勿動，發(fā)現(xiàn)問題及時報告。
十一、 組織培養(yǎng)用眼科剪刀鑷子使用后應(yīng)洗凈烘干，防止生銹。
十二、 浸泡細胞培養(yǎng)板統(tǒng)一使用７５％酒精（ＣＰ或ＡＲ）或醫(yī)用酒精。
第二節(jié) 送洗須知
一、 送入洗滌室的所有物品均應(yīng)分類置于指定的地方,以便洗滌。
二、 被病原材料污染的器械物品等在送洗之前作無害化處理和面交洗滌室工作人員，并詳細說明處理方法。
三、 送洗的所有玻璃、塑料器皿都應(yīng)沖洗后浸泡于自來水中。使用的金屬濾器應(yīng)仔細沖洗后，完全浸泡于水中。包扎濾器用的牛皮紙和紗布可重復(fù)使用，應(yīng)置于干燥箱內(nèi)烘干。
四、 注意節(jié)約?？梢灾貜?fù)使用的物品如離心管塞、牛皮紙和沙布等不應(yīng)廢棄。
五、 注射器、針頭、剪刀、鑷子、微量吸樣器用塑料滴頭，高速離心機用塑料離心管皆由使用者自己清洗、烘干，并放回原處。
六、 每一實驗若需較大量的物品或一些特殊用品，應(yīng)提前通知洗第室工作人員準備，特殊洗滌要求要當(dāng)面交待。
第三節(jié)試劑的保存與使用須知
一、 化學(xué)試劑在保存與使用過程中往往會因為自身物理化學(xué)特性和環(huán)境條件的變化發(fā)生變質(zhì)?；瘜W(xué)試劑的變質(zhì)分為潮解、霉變、熔化、凝固、變色、聚合、氧化、腐蝕、揮發(fā)、風(fēng)化、升華和失效等。影響化學(xué)試劑變質(zhì)的主要因素為水分、氧氣、光輻射和溫度等。
二、 化學(xué)試劑的保存溫度分為室溫、４℃、冰凍（－２０度）和超低溫（－７０度以下）等。應(yīng)根據(jù)化學(xué)試劑的物理化學(xué)特性和瓶簽要求分別保存于不同溫度條件下。
三、 化學(xué)試劑一般都應(yīng)密閉、干燥保存。有些化學(xué)試劑（如氧化鈣、乙酸鉀、硝酸鈣和氯化鈣）極易從空氣中吸收水分而潮解或分解變質(zhì)。這些化學(xué)試劑要特別注意密閉、干燥。有些生物制劑（如酶和熒光素）不僅需要低溫保存，而且很易吸潮而變質(zhì)失活。這類藥品應(yīng)置于干燥器中冰箱內(nèi)保存，使用這類試劑要注意需待干燥器內(nèi)溫度升高時方可開啟干燥器上蓋，以防在干燥器內(nèi)開成水汽。
四、 根據(jù)試驗要求選用不同純度的化學(xué)試劑。不可超級使用，但也不要降級使用。（見附表）
五、 使用進口藥品和貴重藥品需辦理申請批準手續(xù)。取用時進行登記。
六、 有毒藥品要由專人保管，使用過程中一定要注意個人保護和環(huán)境保護。
七、 所有化學(xué)試劑使用后擰緊瓶蓋，立即回到原保存條件下。
八、 同一種藥品一瓶未用完之前不得開啟或領(lǐng)用新瓶。
九、 每一種藥品使用一個藥勺。注意防止試劑間相互污染。藥勺使用后應(yīng)立即洗凈。
十、 嚴禁將化學(xué)藥品用作食用或作燃料。
附表 我國化學(xué)試劑的等級標志
試劑級別 中文名稱 代號 瓶簽顏色 使用要求
一級品 保證試劑或“優(yōu)級純” Ｇ．Ｒ． 綠色 用作基準物質(zhì)，主要用于精密的科學(xué)研究和分析鑒定
二級品 分析試劑或“分析純” Ａ．Ｒ． 紅色 主要用于一般科學(xué)研究和分析鑒定
三級品 化學(xué)純粹試劑或“化學(xué)純” Ｃ．Ｐ． 藍色 用于要求較高的有機或無機化學(xué)實驗，也常用于要求較低的分析實驗
四級品 實驗試劑 Ｌ．Ｒ． 棕色或藍色或其他顏色 主要用于普通的實驗和科學(xué)研究上，有時也用于要求較高的工業(yè)生產(chǎn)中
第四節(jié) 菌種、毒種和細胞株保存須知
一， 菌種、毒種和細胞嚴禁攜出實驗室。其它實驗室如需引進，須經(jīng)過負責(zé)老師批準，并辦理有關(guān)手續(xù)。
二， 所有菌種、毒種和細胞都應(yīng)專用登記本上按規(guī)定項目詳細登記，請參閱有關(guān)登記本目錄說明。
三， 根據(jù)保存物不同要求保存于不同條件下。一般分為-30，超低溫（-70以下）和液氮保存。
四， 越低溫冰箱內(nèi)按位置分類存放，液氮貯罐分類存放。
五， 菌種、毒種和細胞在接種繼代時應(yīng)嚴格防止交叉污染。
六， 取出時必須在登記本上登記。
第五節(jié) 超低溫冰箱和液氮貯罐使用須知
一， 超低溫冰箱使用須知
1， 超低溫冰箱僅限于存放毒種，菌種，血清抗體、單抗腹水、藥品試劑和某些病料等。
2， 放入箱內(nèi)所有制物品必須按規(guī)定位置分類存放。取放都應(yīng)在登記本上登記。
3， 箱門開啟時應(yīng)盡可能短暫，關(guān)門后鎖緊扣好。嚴禁在停電時開啟箱門。
4， 及時清理、剔除無保存價值的物品。
二，液氮罐使用須知1，液氮容器分為二類。一類為貯存容器，這類容器保存液氮時間長，主要用于靜置貯存液氮，存放時應(yīng)保持垂直，切不可充裝液氮后傾倒?？梢钥蛰d運輸，但不可在充滿液氮下作長或短途運輸。另一類為運輸容器，這類容器耐沖擊震動，可充裝液氮后作長短途運輸。
2，只能使用配套瓶封閉頸口，不可用其它不合格物代替。否則會因液氮持續(xù)蒸發(fā)，形成壓縮氣壓，導(dǎo)致致容器的損壞或爆炸。
3，容器首次充滿液氮以及停用后重裝，因內(nèi)膽是常溫，開始充裝時切勿太快，以免液氮劇烈沸騰，向外飛濺。
1、
2、 容器首次充滿液氮以及停用后重新充裝，因內(nèi)膽是常溫，開始充裝時切勿太快，以免液氮劇烈沸騰，向外飛濺。
3、 加注液氮時不要將液氮沖在頸管上（應(yīng)使用漏斗加注液氮），液氮不宜充裝過滿，切勿使液面高到與玻璃鋼頸管接觸。
4、 取放冰存物時應(yīng)細心謹慎操作，要注意盡量縮短頸口開放時間，避免吸入空氣中水份影響貯存效果。
5、 如發(fā)現(xiàn)液氮蒸損量突然增多或外殼上部的金屬表面突然結(jié)霜，說明容器已經(jīng)損壞，應(yīng)立即停止使用。
6、 存放細胞需使用統(tǒng)一規(guī)格的布袋，引繩要牢靠。
7、 存放細胞后登記，并統(tǒng)一編號。取出細胞后也在登記薄上登記，禁止取存細胞不登記不現(xiàn)象。
8、 保持液氮罐的線頭齊整，經(jīng)常清理棄去無保存價值的細胞。
第六節(jié) 高值儀器使用須知
一、 使用高值儀器前需仔細閱讀儀器說明書。初次使用時應(yīng)在有關(guān)人員指導(dǎo)下進行。
二、使用過程中如發(fā)現(xiàn)故障，應(yīng)立即報告有關(guān)人員。
三、使用高值儀器必須登記，使用后做好清理工作，加蓋防塵罩。
四、高值儀器由專人負責(zé)。負責(zé)同志做好儀器的調(diào)試保養(yǎng)和監(jiān)督使用工作。
五、非本室工作人員使用高值儀器需經(jīng)批準。并需由本室工作人員都督使用。
第七節(jié) 常用小型儀器使用注意事項
一、 電子交流穩(wěn)妥壓器
1 連續(xù)工作時間一般不要超過6小時。
2、關(guān)機后需待5分鐘方可重新開啟電源開關(guān)。
二真空泵
1使用前查看沒油位。以停泵時注油標中心為宜。
2、泵進氣口連續(xù)通暢大氣運轉(zhuǎn)不得超過1分鐘。
三、電動吸引器
使用前觀察潤滑油是否正常（油面應(yīng)在油鏡中央）。若油面偏聽偏低，應(yīng)隨時加注。
四、小型臺式離心機
1、電機要三個月加注潤滑油一次。
2、碳刷磨損小于10mm時應(yīng)調(diào)換新碳刷。
3、試管、試管套都應(yīng)對稱平衡。嚴禁在重量非相等時使用。
五、手提式高壓蒸氣消毒鍋
1、每次使用前應(yīng)檢查器內(nèi)水量是否保持3立升左右。
2、對溶液消毒，應(yīng)灌注于耐熱玻璃內(nèi)，以不超過3/4瓶為妥。
3、消毒物品放置時互之間應(yīng)留有空隙，有得于蒸汽穿透，提高消毒效果。
4 每次消毒開始時應(yīng)將放氣閥打開，待器內(nèi)空氣逸出，有較急蒸汽噴出時，關(guān)閉放氣閥進行消毒（也可開始時先關(guān)閉放氣閥待加熱至5磅/平方英寸放氣）
1、 對器械、器皿消毒后，可立即打開安全閥，使蒸汽迅速排去。對瓶裝溶液消毒終了后， 切勿立即放蒸汽，否則，瓶內(nèi)溶液可因壓力聚變而劇烈沸騰、溢出，甚至瓶子爆破。
2、 剛消毒后的瓶裝溶液不能直接置于水泥臺面，否則因驟冷易 發(fā)生爆炸。
3、 消毒鍋蓋上裝有工作壓力1.4千克/平方厘米的安全閥，應(yīng)經(jīng)常將此閥開放數(shù)次，使之處于靈活狀態(tài)。
六、電熱干燥箱
1、內(nèi)室底板不宜放消毒物品，以免影響散熱或被烤焦。
2、消毒時需開啟鼓風(fēng)機并適當(dāng)旋開排氣孔。
3、在加熱過程中將加熱開關(guān)旋至“2”（二組加熱器工作）。達到恒溫后可關(guān)閉一組加熱器（旋至“1”），以免功率過大，影響恒溫靈敏度。
4、加熱或恒溫時如欲觀察工作室試品，可開啟箱門，在玻璃門外觀察。在溫度高于100（度）時不得開啟玻璃門，以防玻璃器皿驟冷炸裂。
第八節(jié) 實驗記錄須知
一、 實驗記錄統(tǒng)一用碳素水書寫，要求字跡正規(guī)、條理清晰。
二、實驗記錄應(yīng)注明年月日。
三、記錄應(yīng)詳細。每次實驗所用的材料及所采用的方法都應(yīng)詳細記錄，以備查證。對觀察的結(jié)果應(yīng)作如實詳盡的描述，必要時進行簡單的歸納和說明。發(fā)現(xiàn)與預(yù)料結(jié)果不符的現(xiàn)象應(yīng)分析原因。試驗過程中發(fā)現(xiàn)的對試驗結(jié)果有影響的意外情況諸如停電、污染等也應(yīng)在記錄本上注明。
四、實驗記錄應(yīng)與實驗同步進行，不要做回憶性記錄。
五、試驗進行一個階段后應(yīng)及時對所得的實驗結(jié)果進行分析綜合。提出下一階段工作重點（實驗項目及所采取的技術(shù)路線等）。
六、實驗記錄為本實驗室擁有，一般情況下不得帶出實驗室。如需借用應(yīng)經(jīng)過批準。
七、課題結(jié)束后，記錄應(yīng)及時整理歸檔。
第九節(jié) 值日工作人員的職責(zé)須知
一、 完善值日制度，設(shè)專人管理。
二、值日人員應(yīng)做好每天的清潔衛(wèi)生工作，整理臺面，檢查儀器運行情況，并監(jiān)督其他工作人員做好實驗后的清潔整理工作。
三、注意安全工作，防盜放火防水。下班時檢查水電，關(guān)好門窗。
四、無菌室值日人員的職責(zé)參見第一節(jié)，注意督促大家執(zhí)行。
五、及時向負責(zé)老師匯報用完或缺少的試劑、物品等，以便補充。損壞的儀器設(shè)備，應(yīng)即使報告，以免影響研究工作。
第十節(jié) 文獻資料借閱、復(fù)印須知
一、 實驗室所有的圖書、期刊、文獻資料等閱后放回原處，一般不得帶出實驗室，特殊情況下（包括外組工作人員）需借閱應(yīng)經(jīng)批準，并登記。
二、復(fù)印資料，需經(jīng)負責(zé)老師批準，復(fù)印后做好登記工作，避免重復(fù)復(fù)印同一份資料。
三、課題結(jié)束后，應(yīng)及時整理裝訂好所有文獻資料，交給管理人員妥為保管。
四、借閱原始記錄需經(jīng)有關(guān)老師同意，注意防止遺失。
五、有關(guān)文獻檢索的方法，請查閱有關(guān)工具書。
第十一節(jié) 實驗準備須知
一、 首先借閱文獻，寫出實驗設(shè)計，并經(jīng)行可行性論證。
二、提交所需材料藥品清單和經(jīng)費預(yù)算，力求節(jié)約。
三、交負責(zé)老師批準后，方可付諸實施。
四、需要特殊材料（包括實驗動物）和藥品等，應(yīng)提早訂購。
五、新進入實驗室工作的研究生須先經(jīng)過一段時間的工作訓(xùn)練。在經(jīng)行論文工作之前，必須提交開題報告。
六、階段實驗結(jié)束后，及時小結(jié)，提出下階段的工作重點。
第十二節(jié) 其它注意事項
一、 配制一切試劑都應(yīng)注明品名、濃度、日期和配制人。
二、操作揮發(fā)性濃酸（如冰乙酸）和揮發(fā)性有機溶液劑等應(yīng)在通風(fēng)有毒氣體和有臭蟲味氣體均應(yīng)在通風(fēng)進行。凡是發(fā)生煙霧、有毒氣體和有臭蟲味氣體均應(yīng)在通風(fēng)處進行。
三、強酸強堿等廢液不能直接倒在水槽中。
四、不能用凡士林封閉層析柱下口玻璃活塞。
五、臺平用后擦凈，二個托盤重合以保護刀口。
六、實驗臺用后立即做好清潔工作。藥品、試劑和器材放回原處，需要洗滌的物品送至洗滌室。
七、經(jīng)常清理，剔除存放于冰箱，試劑櫥內(nèi)無保存價值的物品。
八、非本室工作人員借用儀器，藥品 和器材需經(jīng)過批準，并辦理借用手續(xù)。
九、工作人員之間要發(fā)揚合作精神，提倡導(dǎo)互相幫助。
第二部分 常用儀器 的操作程序及使用注意事項
第一節(jié) 多功能紫外可見光度計
M750—A型多功能紫外可見光光度計
在開啟儀器 電源之前，請檢查：“光源選擇鈕位于”關(guān)“；”量程選擇”鈕位于“零”；“100%T”鈕位于“零”。
1、 依據(jù)待測樣品選擇波長。
2、 根據(jù)波長選擇開啟H燈（200.0—360.0nm）或W燈(360.0—750.0nm),儀器預(yù)熱5分鐘.
3、 “量程選擇”位于”校零”位置 ,用”調(diào)零”鈕調(diào)零點.
4、 空白樣液置于光路中,蓋好樣品室蓋,”量程選擇”置于”X1”檔調(diào)節(jié)”100%T”,使表頭指針為”100%”.
5、 重復(fù)調(diào)零和調(diào)100%步驟至儀器 完全穩(wěn)定.
6、 拉出手柄使待測樣品于光路中, 讀取A值.如樣液濃度較高時可使用”X0.1”檔,此時A值的讀數(shù)為表頭讀數(shù)加1.0.
7、 “量程選擇”鈕位于”校零”位置,打開樣品室蓋取出比色皿.
8、 關(guān)機：“量程選擇”置于“校零”，“100%T”逆時針旋至“零點”，“光源選擇”置于“關(guān)”，撥下主機電源插頭。
9、 將儀器用罩子罩好。
10、 在使用登記本上登記。
注意事項：
1、“量程選擇”鈕位于“X1”或“X0.1”時不得打開樣品室上蓋;
2、在測量過程式中不讀數(shù)，“量程選擇”鈕應(yīng)置于“校零”位置，以延長光電管使用壽命；
3、使用權(quán)用微量池或半微量池時，應(yīng)用微量進樣器進液，注液時不得溢出池外，也不得碰傷上端的石英窗。
4、H燈關(guān)后間隔10分鐘才可再開啟。
5、比色皿用后應(yīng)用去離子水充分淋洗，倒置于吸水紙上，使其干燥。
第二節(jié) 酶聯(lián)免疫閱讀儀
DG—3022型 酶聯(lián)免疫檢測儀使用注意事項：
1、 第一次使用該機的工作人員，使用前請務(wù)必仔細閱讀使用說明書；了解并掌握操作方法： 開機 —調(diào)零—工作選擇（包括統(tǒng)計處理及其它功能）—賦值—測量必要時可在有關(guān)負責(zé)人員的指導(dǎo)下熟悉該
2、 關(guān)機后5秒內(nèi)不要立即開機，儀器正在工作時，其交流電壓不允許閃動。
3、 儀器工作時，操作人員不要離開。
4、 儀器運行中出現(xiàn)失常，應(yīng)即時排除故障或匯報老師處理。
5、 裁下一部份打印紙帶時，應(yīng)使用剪刀剪的方法。
6、 儀器須注意防塵防潮，加外罩。
7、 更換濾光片前必須關(guān)閉電源。
第一節(jié) 電子天平
Mettler AE240電子天平
操作步驟：
1、 輕按控制盤，幾秒鐘后顯示盤顯示“0,0000”或”0.00000”(“0.0000”表示量稱范圍0.1mg—200g,0.00000表示量稱范圍0.01mg—40g)。
2、 如盤上顯示的量程與要求的一致，則直接進入第三步，如不一致，則按如下方法改變量程范圍：
（1） 輕按信控制盤，待rag200/40顯示后松開。
（2） 再輕按控制盤一下，從顯示 盤上可風(fēng)量程轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N。
（3） 幾秒鐘后顯示 器顯示0。
3、 在稱量盤上加一塊稱量紙，待顯示盤上讀數(shù)穩(wěn)定之后，輕按控制盤以去皮。
4、 待顯示0后，加所需稱量物品。
5、 穩(wěn)定性檢測 點消失之后，顯示 盤上的數(shù)據(jù)即為物品的重量。
6、 向上輕掀控制盤以關(guān)閉顯示 器，取下稱量物品和稱量紙。
7、 用專用毛刷將稱量盤和天平內(nèi)室掃干凈。
8、 關(guān)閉天平玻璃門，罩上防塵罩，不要拔下電源插頭。
9、 在使用用登記本上登記。
注意事項：
1、 電子天平在開啟使用之前需將電源插頭接到220V電源（無需穩(wěn)壓器）上至少30分鐘，校準天平時則需按在電源上1小時。
2、 電子天平在使用之后不要拔下電源插頭。
3、 AE240電子天平有2種稱量精確度，即0.1mg和0.01mg。沒有必要時不要選用0.01mg檔。
4、 灑落在天平稱盤和天平室上的藥品務(wù)必在稱量后用毛刷拭去。
5、 非保養(yǎng)儀器 人員不要擅自對天平進行校準，不合格的校準操作很容易 使天平損壞。
第三節(jié) 各類顯微鏡及顯微鏡攝影技術(shù)
顯微鏡系列使用注意事項：
1、 顯微鏡應(yīng)置于干燥、陰涼、空氣流通的地方，避免受潮受熱。
2、 經(jīng)常注意光學(xué)零件清潔，目鏡有灰塵可用吹風(fēng)球或軟羊毛管將灰塵吹去或掃去，油浸物鏡使用權(quán)用后要及時用抹鏡紙醮少許二甲苯抹凈油脂。
3、 保持機械部份的靈活，經(jīng)常上些潤滑油。
4、 調(diào)試好的各類顯微鏡，使用時請勿輕易調(diào)動，發(fā)現(xiàn)故障時，請及時報告負責(zé)制人員，及時排除。
5、 熒光顯微鏡關(guān)閉后，必須間隔15分鐘以上才能重新開啟，用后要登記。
6、 對所用顯微鏡（普通、倒置、相差、熒光）和顯微鏡攝影裝置，若不熟悉，請事先詳細閱讀說明書，或在保管人員的指導(dǎo)下使用。
7、 顯微鏡攝影裝置務(wù)必在負責(zé)人員協(xié)助下進行。攝影材料應(yīng)精選，注意代表性，厲行節(jié)約。
第四節(jié) 核酸蛋白檢測儀
ZW2080—A紫外測儀操作步驟
1、 開機前，首先將電源、檢測 器和記錄三部分 電路連接，通上電源。
2、 把波長旋鈕旋到所需波長刻度上。
3、 把主機量程開頭拔到期100%T檔。
4、 按通記錄儀電源開關(guān)，按下“調(diào)零”記錄儀指針應(yīng)在“0”位置，如不在，則調(diào)至“0”位。彈出“調(diào)零”按鈕。按下“10mv”琴鍵開關(guān)。
5、 打開主機電源開關(guān)。
6、 順時針旋轉(zhuǎn)“光量”旋 鈕，使用權(quán)指針停留在50—60%T處。
7、 預(yù)熱1小時以上。
8、 將進樣器與層析柱連接，使用權(quán)層析柱中的洗脫液流經(jīng)檢測 器。
9、 當(dāng)記錄儀基線穩(wěn)定之后，把檢測 器上的“光量”旋鈕逆時針旋轉(zhuǎn)到底，此時由于狹縫完全關(guān)閉，記錄儀指針應(yīng)移動到左邊“0”位置。
10、 順時針方向打開“光量”鈕，使記錄儀指針移到90%T位置。若做透光率T測試，就可進樣。
11、 若用光密度A測試，把量程鈕拔到所需A檔，此時記錄儀指針回到0.05附近,用”A調(diào)零”和”光量”鈕,將指針精確調(diào)在0.05位置。
12、 至此，儀器調(diào)試完畢?？梢赃M行測試。測試過程是，“光量”、“A調(diào)零”均不能再變動。
13、 測試完畢，先關(guān)記錄儀開關(guān)，再關(guān)主機開關(guān)。將“光量”鈕逆時針旋轉(zhuǎn)到底。
14、 用蒸餾水清洗樣品池和要道。
15、 使用情況登記。
注意事項
1、 在工作前檢查各連接 線是否正確。
2、 儀器不常工作時，有出現(xiàn)燈源不亮，常見原因是：（1）環(huán)境影響，因氣溫低或受潮；（2）久不使用等。解決辦法是開通電源后，過一會兒再關(guān)掉，再開幾次，或用電吹風(fēng)對準燈源窗口加熱。
3在連接 層析柱時，避免有氣泡進入樣品池，當(dāng)氣泡進入時，應(yīng)把氣泡趕走，不然，基線產(chǎn)生波動對實驗不利。
4光電倍增管為要用手指觸摸發(fā)光區(qū)。
5、 儀器應(yīng)保持清潔、干燥。
6、 層析柱使用后，柱內(nèi)凝膠應(yīng)及時復(fù)生。
第五節(jié) 各類離心機
GL20A高速離心機操作程序：
1、 主電源開關(guān)扳至“ON”位置。
2、 溫度預(yù)選鈕左旋至“-20度”使離心室預(yù)冷。
3、 已裝好樣品的預(yù)冷的轉(zhuǎn)子正確安放在轉(zhuǎn)子床上。
4、 關(guān)閉離心室門蓋。
5、 將溫度預(yù)選鈕旋至“+4度”位置。
6、 將速度預(yù)選鈕調(diào)到所需的速度值。
7、 時間預(yù)選鈕調(diào)到所需的時間值。
8、 按亮“BRAKE”開關(guān)。
9、 待離心室溫度恒定后，按啟動開關(guān)，啟動指示燈亮，轉(zhuǎn)子開始運轉(zhuǎn)。
10、 當(dāng)預(yù)選的時間終止時，轉(zhuǎn)子自動減速。蜂鳴器叫后或速度 降至“0”時，可以開啟離心室門蓋。取出轉(zhuǎn)子。
11、 將溫度預(yù)選鈕右旋至40度，加熱化霜。
12、 將速度 預(yù)選取鈕加零，關(guān)閉“BRAKE”開關(guān)。
13、 主電源開關(guān)扳至“OFF“位置。
14、 擦干離心室水汽，擦干轉(zhuǎn)子水汽。
15、 加防塵罩；進行使用登記。
16、
Heraeus離心機：根據(jù)實驗要求選定一定的程序，設(shè)置轉(zhuǎn)速、加速度、溫度等數(shù)值。詳細操作程序參見使用說明書。
IEC離心機、Mico持uge E離心機使用亦請參閱說明書，不再贅述。
附 614—E11 10KVA電子交流穩(wěn)壓器使用注意事項。
1、 插上電源，開啟電源開關(guān)，待遇高壓指示燈亮后（需30秒至5分鐘），電壓表應(yīng)指示220V。
2、 稍許后，接上負荷。
3、 關(guān)機后，需間隔5分釧才能重新開機。
4、 如開機后發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)“電壓調(diào)節(jié)”鈕仍不能達到220V，應(yīng)立即關(guān)機進行檢查。
5、 本機使用權(quán)用過程中有較長時間間隔，應(yīng)關(guān)機。
第七節(jié) 酸度計
PHS—20酸度計使用及注意事項
1、 使用前請閱讀說明書，掌握電極安裝—PH校正—樣品溶液PH值或電極電位的測量 程序。
2、 一般情況下，一天進行一次PH 校正己能懣足常規(guī)PH測量的精確度要求。
3、 玻璃電極球泡很薄，操作中防止其破碎。不要用手去摸索電極球泡，以免玻璃膜 沾有油脂，影響測量精度。
4、 儀器在按下“讀數(shù)”開關(guān)時發(fā)現(xiàn)指針打出刻度時，應(yīng)放開“讀數(shù)”開關(guān)，檢查分檔開關(guān)位置及其它調(diào)節(jié)器是否適當(dāng)。
5、 當(dāng)按下讀數(shù)開關(guān)，調(diào)節(jié)“定位”旋鈕達不到標準綬沖溶液 的PH什時，即說明書電極的不稱電位很大，或被測綬 沖液PH什不正確，應(yīng)調(diào)換電極或溶液試之。
6、 調(diào)節(jié)“溫度”旋鈕時勿用力過大，以防止移動緊固螺絲的位置，影響PH準確度。
第八節(jié) 各類冰箱的使用與保養(yǎng)
1、 根據(jù)物品的保存要求，選擇適當(dāng) 的冰箱貯藏。
2、 依據(jù)分類存放的原則，定箱定點放置物品。
3、 冰箱內(nèi)存放的物品 要經(jīng)常 整理，沒有保存 價值的物品 及時廢棄清理。
4、 冰箱要經(jīng)常除霜，以保證正常、高效的運行。每天上下班，請留心冰箱工作狀況，特別是低溫冰箱。
5、 冰箱內(nèi)嚴禁放置食品。
6、 高溫季節(jié)注意冰箱的散熱情況，減少開門次數(shù)和縮短開門時間。
7、 經(jīng)常 擦拭冰箱，保持 冰箱清潔工。
8、 詳細低溫冷藏的注意到事項參見有關(guān)章節(jié)。
第九節(jié) 電泳裝置
一、電泳系列操作注意事項
1、 進行各類電泳，如瓊 脂糖電泳、PAGE、SDS—PAGE、IEF、WB等時，務(wù)必事先詳細 設(shè)計好程序。
2、 根據(jù)不同類型的電泳要求，參見有關(guān)說明書設(shè)置電泳儀的各項控制鈕。
3、 依據(jù) 分離物質(zhì)的性質(zhì)不同，選定合適的電泳種類、凝膠濃度及特殊用試劑。
4、 電泳過程中，仔細 觀察工作情況，切勿電泳過頭或分離不足。
5、 發(fā)現(xiàn)故障及時報告并排除。
6、 有關(guān)詳細操作程序邏輯參見有關(guān)章節(jié)及專業(yè)書籍。
二、凝膠真空干燥操作步驟
1、 打開溫度定時開關(guān)，預(yù)熱加熱板。
2、 放兩層Whatmann3號濾紙（或新華3號濾紙）在多孔篩板上。
3、 將需要干燥的凝膠片放在一張浸濕的厚濾紙上，隨后放到多孔篩板的干濾紙上。
4、 用一張薄的塑料膜鮮紙（或玻璃紙）復(fù)蓋在凝膠表面。用手指小心抹干，以除去氣泡
5、 將多孔篩板及凝膠放在干燥器的鋁合金表面上放正。
6、 蓋上硅橡膠板，接通真空泵，重調(diào)定時開關(guān)。
7、 待凝膠干好后，關(guān)掉真空 泵，揭開硅橡膠，取出凝膠（己固定在濾紙上）
附：透明膠片制作方法
下層：半透膜（可用透析袋代）
中層：凝膠片
上層：塑料膜鮮紙（或玻璃紙）
注意事項：
1、 一般凝膠干燥可用法80度.但為了作放射自顯影或熒光攝影時應(yīng)用60度烘干.
2、 對于高膠連的聚丙烯酰胺凝膠,厚度較厚的凝膠或梯隊度膠,要防止凝膠斷裂,此時 應(yīng)以60度烘干為好.
3、 一般凝膠在用較好的真空泵抽氣時,干燥時間約為40------60分鐘,在凝膠未宗全干燥之前不能打開硅橡膠板,否則引起凝膠斷裂.
4、 用于硝酸纖維膜的干燥,不能用加勢檔,僅用真空泵抽干即可,否則能引起事故.
第十節(jié) 空調(diào)機、抽濕機、微波爐
一、 抽濕機使用注意事項
9、 經(jīng)常傾云積水槽內(nèi)的水，當(dāng)其內(nèi)的水量達到1。85公斤時，抽濕機即自動停止工作。
濾塵網(wǎng)至少每兩星期即要清洗一次；機身用干布或沾有洗滌劑的濕布來抹拭槽櫥及機身，切不可用其它化學(xué)藥品洗滌。
4、不要用化學(xué)藥品如汽油、揮發(fā)性油洗滌該機，或用水沖洗之。
5、厲行節(jié)約，不需要開空調(diào)機就不要使用。人離開前，切記關(guān)機。
三、 RP-63OD微波爐使用注意事項
1、 微波爐內(nèi)空載時，請勿使用。
2、 微波爐門未關(guān)前或門關(guān)閉不良，請勿打開開關(guān)。
3、 金屬容器或物品切忌不要放入微波爐內(nèi)，以防發(fā)生電火花損壞微波爐和容器。
4、 不要用紙、布、毛制品包物品放入微波爐，以免損壞或引起意外事故。
5、 微波爐使用后，可放入一杯水，以吸收余熱。
6、 保持微波爐內(nèi)外壁、門、托盤的清潔，但切記在操作后，馬上用涼水沖洗，以防破裂；微波爐使用后，應(yīng)抹干內(nèi)壁的水汽。
7、 微波爐有故障時，切勿使用，應(yīng)送專職人員檢修。
8、 功能選擇：
Power level Percentage/Output
High 100%/650w
M.High 70%/450w
Medium 50%/320w
Defrost 30%/200w
Low 15%/90w
第十節(jié) KZBZ-40自動顆粒制冰機
1、 該機由電子部分、制冰部分和顆粒冰推進部分組成，按程序工作。每小時可制冰5公斤，蓄冰量可達20公斤，24小時連續(xù)制冰，
2、 本機為水冷散熱型機組，要求通風(fēng)良好，離墻和其他物之間距離應(yīng)大于30厘米。
3、 開機前切記檢查水源是否接通，機器背面左下側(cè)的進口用橡膠管套緊并接自來水，接好扎牢后方可打開水源（注意：進水壓應(yīng)在1.4-4.0kg/cm2）。
4、 開啟水源后，吸需打開正面的電源開關(guān)，機器就會按程序工作。若水源停止供水時，應(yīng)關(guān)閉機器。
5、 在制冰過程中應(yīng)關(guān)閉蓄冰室門，整機在開機15分鐘后方可出冰；1小時后取冰，這時的冰溫度最低（-8），硬度最強。
6、 機器背面右側(cè)面有個放水口，接上一根30cm長的橡膠管引致一只存水盆收集制冷過程中的水滴和融化的冰水。
7、 當(dāng)蓄冰室冰滿后通過電子控制自動停機，當(dāng)驅(qū)除部分冰后，機器又自動工作制冰。
8、 整機應(yīng)保持干凈，機器上面不應(yīng)放雜物，嚴禁通電時搬動。
9、 關(guān)機后，應(yīng)關(guān)閉水源。當(dāng)較長時間不使用時，應(yīng)清理蓄冰室等部件。
第十一節(jié) 其它儀器設(shè)備
一、 LRH-150B型生化培養(yǎng)箱使用說明書和注意事項
1、 電源開關(guān)撥至“開”位置，電源指示燈亮，機器開始工作。
2、 溫度調(diào)整：
（1） 將溫度顯示開關(guān)撥至“開”，數(shù)顯表電源接通。
（2） 將“整定”、“測量”共用開關(guān)撥至“整定”位置，然后旋轉(zhuǎn)溫度刻度盤，直到數(shù)顯表顯示出所需要的溫度值為止。
3、 將共用開關(guān)撥至“測量”檔，
此時數(shù)顯表顯示溫度僅僅是箱內(nèi)實際溫度，但此時的溫度將隨機器的工作狀態(tài)而改變，當(dāng)機器達到平衡狀態(tài)，即既不加熱，也不制冷時，則數(shù)顯表所顯示數(shù)值即為所需溫度值。
電源接通后，調(diào)節(jié)好所需的溫度，這時不能隨便將控溫旋鈕來回多次旋轉(zhuǎn)，以免壓縮機啟動頻繁，造成壓縮機出現(xiàn)過載現(xiàn)象，影響壓縮機壽命。
4、若開機后，經(jīng)過一段時間，加熱、制冷指示燈均不亮，則表示箱內(nèi)溫度達到
平衡，等于所需溫度-補償，故加熱指示燈出現(xiàn)閃爍現(xiàn)象是正常情況，但要防止兩燈同時亮，否則表明機器出現(xiàn)故障，須即使檢查、理。
4、 當(dāng)使用溫度較低時，應(yīng)定期倒掉位箱內(nèi)底部接水盤內(nèi)的積水。
5、 箱內(nèi)無需照明時，應(yīng)將面板車上的照明開關(guān)置于“關(guān)”位置。
6、 嚴禁用手或其它硬件碰撞、拉動箱內(nèi)的控溫探頭，以免造成失控制。
7、 若機器運轉(zhuǎn)出現(xiàn)故障如控溫失靈，不加熱或不制冷，須先切斷電源，分別檢查保險絲是否完好，再檢查相應(yīng)部分。
二、 YXQ.G01.280手提式高壓蒸汽消毒使用說明
1、 首次使用必須了解消毒器內(nèi)物品如何包扎——堆放——（加水）——密封——加熱—— 消毒——干燥——冷卻的方法，最好是在有關(guān)
人員指導(dǎo)下進行操作。
2 、始終應(yīng)保持消毒器內(nèi)有足夠的水量（約2.5公斤）
3 、在消毒開始時一定要將汽閥開放，使消毒桶內(nèi)的空氣逸去，否則 會得不到良好的消毒效果。
4 、溶液應(yīng)灌裝在硬質(zhì)耐熱的玻璃容器內(nèi)，不要灌裝得太滿，一般灌至容器的1/2~3/4容積。
5 、不允許將不同類型不同消毒要求的物品放在一起消毒。
6 、每周將安全閥開放數(shù)次，這樣可以保證安全閥處于良好的靈活狀態(tài)。
7 、壓力表使用日久后會使讀不準確，應(yīng)檢修或換上新表。
8 、平時注意消毒器的清潔干燥，可以延長使用年限。
9 、消毒過程中操作者最好不要離開現(xiàn)場，若要離開，一定要交待他人代為看管。
10 、不同物品消毒所需時間、溫度與壓力：
消毒物類 消毒所需保溫 蒸汽壓力 表 壓 飽和蒸汽相
時間（分鐘） （公斤/厘米）（碳/英寸） 對溫度（ ）
??????????????????????????????????????????????????????????????????????‘
橡膠類 15 1.05 ?1.1 15?16 121
敷料類 30?45 1.05?1.4 15?20 121?126
器皿類 15 1.05?1.4 15?20 121?126
器械類 10 1.05?1.4 15?20 121?126
瓶裝溶液類 20?40 1.00?1.4 15?20 121?126
????????????????????????????????????????????????????????????????????
三、 其實各類儀器使用前請詳細閱讀使用說明書，這里不在一一介紹。
第三部分 實驗室常規(guī)試驗程序
第一章 組織培養(yǎng)及常用溶液的配制
第一節(jié) 雞胚成纖維細胞（CEF）、鴨胚成纖維細胞(DEF)培養(yǎng)
一、 材料
9?10日齡雞胚 13?14日齡鴨胚 眼科剪、 鑷、外科鑷 、巴氏吸管 、蛋架、滅菌平皿 25ml小三角瓶 Hanks＇液 0.25%胰酶液 Versene液 滅菌紗布、玻璃漏斗、0.1% 結(jié)晶檸檬酸（0.1M）或0.4%臺盼蘭,血球計數(shù)板、60ML培養(yǎng)瓶或60ML培養(yǎng)皿、滅菌蓋玻片、營養(yǎng)液。
二 方法（CEF為例）
雞胚 理：取9?10日齡雞胚直 于蛋架，在氣室部用于5%碘酊棉 消毒，再用灑精棉 脫色，用外科鑷擊破蛋殼用眼科鑷取出胚體放于平皿內(nèi)，去喙瓜眼和內(nèi)臟，用Hank＇s液洗兩次，用彎頭眼科剪剪胚剪成1-2mm的碎塊，加Hank’s液20ml,略加搖振，靜置使組織塊下沉，將混有紅血球及碎片的上懸液吸去，重復(fù)洗2—3次，直至上懸液不混濁為止。
2、 消化：將0.25%胰蛋白酶溶液用5、6%NaHCO2滴定至PH7、6—7、8，加熱至37度，按組織塊量3—5倍加于裝有雞胚碎塊的三角瓶中，每個雞胚約需胰酶5ml，30分鐘取出，靜置1—2分鐘，吸去胰液，再加HanK’s液20ml，輕輕搖動后吸去，如此反復(fù)兩三次，目的是洗去殘余的胰酶。第三次加入營養(yǎng)液，每胚3ml左右，用粗口吸管吹吸數(shù)次，使細胞脫落分散。靜置1—2分鐘，候組織下沉后，細心將細胞懸液吸出，另置一只25ml三角瓶，如此反復(fù)數(shù)次，使細胞盡量自組織塊脫落，將多次取得的懸液合并一處，紗布過濾懸液。必須注意每次吹吸一般6—7次為宜 ，太多則細胞受損，消化時間要靈活掌握，不足細胞不易掊落，太久則細胞破碎。
在消化過程中，搖動時組織不易下沉即立即停止，消化后如組織粘連如涕，證明消化過度。
二、 細胞計數(shù)：
取細胞懸液0.1（100ul）置盛有0.9ml10.4%臺盼藍的試管中混合,用血球計數(shù)板計數(shù)。
計算方法：
4大方格細胞數(shù)
每ml細胞數(shù)=——————————————X10（5）
4
5中格細胞數(shù)
或每ml細胞數(shù)=——————————X10（4）
三：接種
以營養(yǎng)液配成每ml10（6）細胞（最終稀釋度）接種鏈霉素瓶（1ml）、60ml瓶（8—10ml），100mm dish（10ml），60mm dish（4ml），37度孵育48小進后形成單層，接種病毒或作次代培養(yǎng)。
四、CEF單層可供作病毒TCID50\LD50等指數(shù)的測定,空斑計數(shù)\病毒中和試驗等.
第二節(jié) 溶液配方
一、PBS
1、無鈣鎂PBS
50X (Less NaCl)
1000ml 雙蒸水
10g KCl
60g KH2PO4
60g Na2HPO4（Na2PO4.12H2O 151g）
溶后分裝20ml管，-20 保存
20ml PBS base 50X
8g NaCl
0.3ml 0.5%酚紅
980ml 雙蒸水 15P 11分鐘
2、NaCl 8.0g
KCl 0.2g
CaCl2 0.1g
MgCl2 0.1g
Na2HPO4 1.15g(Na2HPO4.12H2O , 2.92g)
KH2PO4 0.2g
雙蒸水至100ml, 過濾除菌，50保存。
3、 分別配制A、B、C原液
A液： NaCl 80.0g
KCl 2.0g
KH2PO4 2.0g
Na2HPO4.2H2O 14.4g(Na2HPO4.12H2O 29.0g)
雙蒸水至800ml
B液：CaCL2 0.5g
雙蒸水 500ml
C液：MgCl2 0.5g
雙蒸水 500ml
以上三液分別 10P10’高壓蒸氣滅菌，冷卻后
A 80V
B 100V
C 100V
H2O 720V
無菌混合
注意：
各化學(xué)藥品的結(jié)晶水重量是否扣除！
二Hank’s Solution
分別配制 A、B原液
A液：NaCL 160.0
KCl 8.0 加入800ml雙蒸水
MgSO4.7H2O
MgCl2.6H2O 2.0
CaCl2 2.8(溶于10ml雙蒸水)
雙蒸水加至 1000ml
B液：Na2HPO4.12H2O 3.04g
KH2PO4.2H2O 1.2g 800ml雙蒸水
Glucose 20.0g
0.4%酚紅液100ml
雙蒸水至1000ml，2ml氯仿防腐，4保存。
A 1V 10P 10min 滅菌
B 1V 10P 10min 滅菌
雙蒸水 18V 10P 10min 滅菌
1---4保存，可用１個月。
用5.6%NaHCO3(10P 10min 滅菌)或3.5%，調(diào)PH至7.2—7.6(加NaHCO3后須立即使用)。
三、0.4%酚紅液.
稱酚紅0.4g→置乳缽滴加0.1N NaOH(總量11.2g/ml)并不斷研磨→所有顆粒全部溶解→100ml量瓶，將已溶后的吸入，用雙蒸水洗缽數(shù)次，倒入→加雙蒸水至100ml搖勻，4℃保存。
四、 Versene液
乙二胺四乙酸二鈉（Versene） 0.2克
NaCL 8.0克
KCL 0.2克
NaH2PO4 1.15克(NaH2PO412H2O=2.9)
KH2PO4 0.2克
雙蒸水至1000ml,10P’,10’滅菌,4℃保存,可用3個月。
五、 胰酶液Tryptase
一般配成0.25%
取0.25克溶于100mlHank’s濾過除菌,分裝小瓶.-20℃保存.用前融化加入青鏈霉素100單位/ml并用5.6%NaHCO3滴定至PH7.4-7.6
注意:
1． 為避免消化細胞成團，可配無鈣胰酶液．
2． 胰酶威無臭無味的白色粉末，應(yīng)密封保存，陰暗處防潮解，可分裝小瓶保存．
3． 胰酶液的濃度隨其活力和消化細胞的來源和種類而定．一般消化配組織用0.1%.
六.碳酸氫鈉液
取NaHCO35.6克溶于100ml雙蒸水中,使完全溶解后,經(jīng)濾紙過濾后,分裝于瓶中(5ml或2ml)10P,10’滅菌.塞緊膠塞,貼上標簽,注明批號日期,4度保存?zhèn)溆?(在4度應(yīng)為透明液,不得有沉淀).每瓶開啟后使用不得超過2次.
七.0.5%乳蛋白水解葉(LAH)
取5克乳蛋白水解物溶于100mlHank’s液中,根據(jù)需要分裝50-100ml瓶,立即10P,20’滅菌,4度保存?zhèn)溆?用前,用5.6% NaHCO3滴定PH7.4-7.5.
注:乳蛋白水解物極易潮解,平時必須將瓶塞緊,最好儲存于干燥器中,乳蛋白水解物含有豐富的營養(yǎng)成分.0.5%乳蛋白水解物溶液加入適量抗生素和血清,即可用于一般的細胞培養(yǎng).
(一).CEF培養(yǎng)
0.5%LAH
CS 5%
Pen 100unit
Str 100ug/ml
5.6% NaHCO3調(diào)PH至7.2-7.4
(二)PK細胞培養(yǎng)
0.5%LAH 89.5%
CS 10%
Pen/Str 100unit/100ug/ml
八.Earle’s液
甲液:NaCL 68g
KCL 4g
NaH2PO4 1.4g
葡萄糖 10g
雙蒸水至500ml,溶解后加氯仿1ml防腐
乙液:CaCL2 2.0g
MgCL2 1.7g
0.4%酚紅50ml
雙蒸水加至500ml,0-4度保存?zhèn)溆?按比例配成Earle’s液.
甲 1V 10P 10’滅菌
乙 1V 10P 10’滅菌
雙蒸水 10V 10P 10’滅菌
4度保存?zhèn)溆?用前用5.6% NaHCO3調(diào)PH至7.4-7.5
九.抗菌素溶液(Pen/Str)
用滅菌雙蒸水配制每毫升含
Pen(青霉素)10,000units
Str(鏈霉素)10,000ug
分裝小瓶,-20度保存.一般培養(yǎng)液加這種Pen/Str%,最終濃度為100unit/ml.
十、199—F10生長液
199 5.49g（4.95g）
F10 4.9g
NaHCO3 1.7g
S.P 1ml(10萬U/ml)
BFS 40ml
DDW 至1000 ml
過濾后分裝備用.
199---F10維持液:BFS僅用10ml,余者同上
第三節(jié) 配制溶液的注意事項
1使用化學(xué)藥品為A.R.級,標簽清楚,最好組織培養(yǎng)專用,防止使用和保存過程中的混淆和污染.
2.配制溶液的用具,需經(jīng)嚴格洗刷和消毒,其配制過程盡量在無菌操作下進行.
3.稱量藥品應(yīng)力求精確.配制溶液應(yīng)有詳細記錄以及消毒，保存,分裝和使用情況.
4.配制的每批溶液,需經(jīng)試用后,方可大量使用.因此需提前配制溶液.溶液保存有一定期限,保存時應(yīng)經(jīng)常檢查,發(fā)現(xiàn)可疑現(xiàn)象和過期,不得使用.
5.注意節(jié)約,計劃用多少就配多少.
第二章 淋巴細胞雜交瘤技術(shù)及使用溶液的配制
第一節(jié) 融合程序
融合方法:
1、 將108 脾細胞與2—5x107 SP2/0細胞混合于1支50ml融合管中，加入30mlDMEM基礎(chǔ)液；
2、 1000r/m離心5分鐘；
3、 吸凈全部培養(yǎng)液；
4、 在手掌上輕擊離心管底部以打碎細胞積塊，置400C水浴中預(yù)熱；
5、 用1ml吸管在45秒內(nèi)加預(yù)熱至370C的50%PEG（PH8.0）1ml，邊加邊攪；
6、 用1ml吸管在90秒內(nèi)加20—30ml
7、20—37℃靜置10分鐘；
7、 1000r/m5分鐘；
8、 棄盡上清，輕擊離心管底以分散細胞積塊，重新懸浮于80—100mlHAT培養(yǎng)基中；
9、 按比例加入107 —2X77 腹腔細胞（約2只小鼠）；
10、 分裝96孔細胞培養(yǎng)板，每孔0.10__0.15ml；24孔板，每孔1.0__1.5ml;
11、 7.5%CO2,37℃孵箱里培養(yǎng);
12、 5天后HAT培養(yǎng)基換出1/2培養(yǎng)液;
13、 7__10天后用HT培養(yǎng)基換出HAT;
14、 經(jīng)常觀察雜交瘤細胞生長情況,待長至孔底面積1/10以上時吸出上清供抗體檢測.
15、 其它詳細資料請參閱劉秀梵教授編<<單克隆抗體及應(yīng)用>>.
第二節(jié) 溶液配方
一、 基礎(chǔ)培養(yǎng)液：
1、老配方 DMEM 13.37g+1000ml雙蒸水使之溶解
丙銅酸鈉 0.11g
碳酸氫鈉 3.6g
pen/str 20萬/2
0． 22u過濾，分裝，4℃保存（不超過1個月）
2、新配方 DMEM基礎(chǔ)液：
四蒸水 980ml NaHCO3 3.7g
DME(Giboo) 13.37g S.P(100X)10ml(本實驗室用1支慶大霉素)
1NHCl調(diào)試PH至7.2_7.4(本實驗室用1NnaOH調(diào)至7.2_7.4),過濾除菌,分裝后4℃保存.
3、 DMEM完全培養(yǎng)基：
30mlDMEM基礎(chǔ)液中加15-20ml BFS，1mlL-G（100X）即為完全培養(yǎng)基。
4、 HT培養(yǎng)基
100mlDMEM完全培養(yǎng)基中加入100X HT 1ml即成，或按下列配方直接配制：
四蒸水 980ml
DME（Giboo） 13.37g L.G(100X) 10ml
HT(100X) 10ml BFS(NCS) 150_200ml
NaHCO3 3.7g S.P(100X) 100ml
用1NHCl調(diào)至7.2_7.4, 過濾除菌,分裝后4℃保存。
二、 100Xaminopterin（4x10（-5）M MW=440.4）
1.76mg A+90ml雙蒸水+0.5ml 1N NaOH助溶，雙蒸水加至100ml+0.5ml 1N HCl中和,0.22um濾膜過濾除菌,分裝2ml小瓶,-20℃保存。
三、 100XHT
Hypoxanthine：MW 136 10（-5）M solution
Thymidine： MW242.2 1.6X10(-1)M solution
H和T可以配在一起，136.1mgH+100ml雙蒸水+1N NaOH至H溶解,加T38.8mg,把PH用醋酸調(diào)至9.5, 0.22um濾膜過濾除菌,-20℃保存。
四、 100Xglutamine 200Mm Solution
2．92g glutamine
100mlDMEM基礎(chǔ)液，,37℃助溶液
0.22um濾膜過濾除菌,分裝2-5ml小瓶，-20℃保存。
五、融合劑配制：PEG（Baker 1000）20-50g于三角瓶中，蓋緊，60-80℃水浴融化，0.6ml分裝于青鏈霉素小瓶中，高壓蒸汽滅菌，-20℃保存?zhèn)溆?。臨用前加熱融化，加等量DMEM基礎(chǔ)液，用少許5.6%NaHCO3調(diào)PH至8.0。
第三節(jié) 單抗制備技術(shù)中的其它方法
一、雜交瘤細胞的克隆化
1、 制備小鼠腹腔細胞；
2、 制備待克隆的雜交瘤細胞懸液；用不著5-20%血清的HT培養(yǎng)基稀釋后使每毫升含2.5、15、50個細胞3種不同的稀釋度。
3、 按每毫升加入5X10（4）-5X10（5）個細胞的比劃，在上述雜交瘤細胞懸液中分別加入腹腔細胞；
4、 每種雜交瘤細胞分裝貨6孔板一塊，每個稀釋度32孔，每孔的量為0.2ml，每孔的雜交瘤細胞分別為0.5、3、10。（或?qū)⑹俊?、4步改為配制15毫升HT培養(yǎng)基中含100個細胞，加入腹腔細胞后分裝96孔1塊）；
5、 37℃，7.5%CO2濕潤培養(yǎng)基7—10天，出現(xiàn)肉眼可見的克隆即可檢測抗體；
6、 在倒置顯微鏡下觀察，標出只有單個克隆生長的孔，取上清作抗體檢測；
7、 取陽性的細胞擴大培養(yǎng)，并凍存。
二、 細胞凍存和復(fù)蘇方法
1、 將對數(shù)生長期的雜交瘤細胞或其它細胞 離心，重新懸浮于預(yù)冷的凍存液中（其中含10—20%小牛血清，10%DMOS的HT培養(yǎng)基），濃度至少5X10（6）/ml。
2、 分裝安瓶，每瓶1ml，置水浴上。
3、 封口后，將發(fā)瓶入入一帶收口繩的小布袋內(nèi)，立即將布袋放入內(nèi)襯石棉的百鐵筒內(nèi)，置—70℃冰箱。
4、 2—4小時后，或過夜后，將布袋移入液氮罐。
注意：在—70℃保存時間不宜過長，一般不超過24小時。
5、 復(fù)蘇細胞時，從液氮中取出安瓶，立即在37℃水浴中融化，待最后一點冰快要融化時，從冰浴中取出，置冰浴上，用5—10mlHT培養(yǎng)基稀釋，離心后，再懸浮于適量培養(yǎng)基中，裝瓶，置37℃含7.5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
6、 如細胞存活率不高，可加腹腔細胞 進行培養(yǎng)。
7、 細胞 存取均應(yīng)為高，可加腹腔細胞進行培養(yǎng)。
8、 細胞存取均應(yīng)做好記錄。
三、 單抗的大量生產(chǎn)
1、 腹腔接種降植烷（Pristane）或液體石臘，每只小鼠（2月齡以上）0.5ml.
2、7—10天后腹腔接種PBS稀釋的雜交瘤細胞，每只鼠5X10（5）/ml0.2ml。
注意：每只鼠接種細胞 數(shù)不可太多或太少，否則單抗菌素產(chǎn)量不高。
3間隔5天后，每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，如腹部明顯膨起，以手觸摸時，皮膚有緊張感，即可用16號針頭采集腹水，一般可連續(xù)采2—3次，通常每只小鼠可采5—10ml腹水。
5、 離心，去除細胞 成份和其它沉淀物，測定抗體效價，可加防腐劑（0.01%硫柳汞或者說%疊氮鈉）小量分裝,—70℃保存。
第三章組織培養(yǎng)使用物品的準備
1、 器材用后立即浸泡是很重要的事；
2、 分類洗滌、處理是必要的，不妨可分為不與細胞直接接觸的器材和與細胞 直接觸的器材，它的洗刷條例不盡一致；
3、 厲行節(jié)約，可以重復(fù)使用的器材不應(yīng)廢棄；
4、 需要特殊處理的器材，如病原材料污染的器材物品，須協(xié)助洗滌人員作無害化處理；
5、 高壓消毒或高溫干烤器械時，務(wù)必有人在場。
第二節(jié) 玻璃器皿的準備
1、 規(guī)格：組織培養(yǎng)用的玻璃器皿要求嚴格，以中性硬質(zhì)玻璃為適宜，用于培養(yǎng)細胞 的培養(yǎng)瓶更應(yīng)注意選擇，一般常用的細胞 培養(yǎng)瓶有鏈霉素瓶，方形、園形克氏瓶等。蛻2瓶的接種面應(yīng)平坦，瓶口內(nèi)徑力求光滑或正方形，防止瓶塞塞后漏氣。其它培養(yǎng)中彎頭吸管、試管、盛液瓶、平皿、吸管和注射器一般常用即可。
2、 洗滌
用過的玻璃器皿，先用清水沖洗，再以肥皂或中性洗衣粉水洗干凈，浸泡于洗滌液中1—2日，取出后自來水沖洗7次，再用雙蒸水或去離子水三盆，分盆沖洗5次，并在雙蒸水或去離子水中浸泡過夜，晾干或烘干，包裝消毒。新購置的玻璃器皿在25%的濃H2SO4或3%的稀鹽酸中浸泡過夜，再進行以上洗滌、晾干、包裝、消毒。
3、 包裝、消毒
小培養(yǎng)瓶或鏈霉素瓶可放在普通鋁制盒中，吸管在塞上棉塞后放在玻璃或金屬筒中消毒。鹽水瓶用牛皮紙包口后，160℃2小時，干熱滅菌。
第三節(jié) 橡皮朔料制品的準備
1、 規(guī)格：
選用質(zhì)軟能耐高壓，對細胞 毒性小的橡皮塑料制品。
2、 洗滌：
新的橡皮塞和橡皮管首先在1%NaOH中煮沸30分鐘，然后用自來水沖洗5—7次，用雙蒸水沖洗3次，再用雙蒸水浸泡過夜色。用過的橡皮塞洗凈后，以雙蒸水煮沸30分鐘，晾干，包裝消毒。
3、 包裝滅菌：
將洗滌、晾干的橡皮塞放在小鋁盒內(nèi)或培養(yǎng)皿內(nèi)。其它橡皮制品用紙包好，15P20—30分鐘。
第四節(jié) 其它用品的準備
一、 濾過用布：指麻布或娟布，剪成小塊，浸于丙酮中，在室溫經(jīng)48小時，取出洗滌，以雙蒸水洗3次，干燥滅菌備用。
三、 解剖用具：外科剪、鑷等，可用干燥滅菌，160℃2小時或于使用前煮沸消毒
5—10分鐘，每次用完后洗滌擦干。
附1 洗液配方
配方1 重鉻酸鉀 150g
蒸餾水 300ml
濃硫酸 30000Ml
將重鉻酸鉀沸水溶解，然后慢慢加入濃H2SO4，邊加邊攪拌，見發(fā)熱過劇則稍停，冷卻后繼續(xù)加，此為強洗液。
配方2 濃硫酸 50%
蒸餾水 50%
重鉻酸鉀 5%
此為中等強度洗滌液
配方3 重鉻酸鉀 100g
蒸餾水 1000ml
加熱溶解，冷卻后緩慢加入工業(yè)硫酸100ml，此液為弱洗液，為棕紅色，使用此液時，必須預(yù)熱先用肥皂水將玻璃器皿洗凈，經(jīng)自來水沖洗瀝干，然后才能浸入，否則該洗液很快失效。
盛洗滌液的容器要堅固，操作時要穿橡圍裙，長筒膠靴，戴上眼鏡和厚橡膠手套，以保安全。
洗滌一旦變綠，表示鉻酸已經(jīng)還原，失去了氧化能力，不宜再用。如將這樣的洗液加熱，再加適量重鉻酸鉀，可重新使用。
附2、玻璃器皿的硅化處理可以防止細胞粘附或提純物質(zhì)損耗在離心管可吸管上。下述的是溶硅的操作條例。
1、 工作液由1份硅膠加100份水制成。如要硅化大約24個15ml的離心管和200個用后便丟棄的巴氏吸管時，可準備600—800ml的工作液。
2、 在硅化前所有玻璃器材必須清潔和干燥，將溶液倒入離心管，放置至少5分鐘。傾出，水沖洗2—3次。將巴氏吸管放滿一個大燒杯，將硅膠傾倒在它的上面，直至所有吸管都有充滿為止。放置至少5秒鐘，將溶液傾出，用水徹底沖洗吸管。工作液不可再用。
3、 室溫中氣干器皿24小時，放入玻璃器皿干燥箱內(nèi)，時間可較短。
第五節(jié) 純水制備程序
1、 細胞培養(yǎng)用水必須使用三蒸餾或四蒸餾水，而大多數(shù)去離子水和常規(guī)一次蒸餾水一樣不適于作為與細胞接觸之用。
2、 四蒸水的制備，通常用去離子水，在雙重石英蒸餾器中蒸餾2次，以達到純凈的目的。
3、 去離子水通常用一次蒸餾水，經(jīng)離子交換樹脂處理，并檢查水質(zhì)情況：水質(zhì)清亮，一般電阻大約10萬歐姆/cm，最高可達100萬歐姆/cm；5%AgNO3檢不出氯離子，PH8—10。
4、 離子交換柱必須安裝在環(huán)境溫度最高不超過40℃，最低不能低于0℃地方。
5、 新樹脂預(yù)處理方法：
（1） 工業(yè)性生產(chǎn)的離子交換樹脂出廠時難免有一些雜質(zhì)，在使用前應(yīng)先用清水沖洗，洗至水質(zhì)清亮。
（2） 用4%HCL、4%NaOH（濃度不能超過6%）交替處理，在酸堿之間大量水洗，如此反復(fù)處理三次，即：酸一水，堿一水，反復(fù)進行，每次酸堿用量為樹脂體積的2倍。在交換柱中動態(tài)進行，如在容器中處理應(yīng)采取少量多次。
（3） 最后一次，陽性樹脂應(yīng)用酸處理使其成為H 型，所用酸量應(yīng)加倍，水洗手去離子水。陰性樹脂應(yīng)用堿處理使其成為OH型，所用堿量應(yīng)加倍，水洗用去離子水。
6、 經(jīng)常以4—5%HCL再生陽性離子柱，（001X7強酸樹脂）用量為樹脂體積的2—3倍。以
4—5%NaOH再生陰離子柱。（201X7強堿樹脂）。
附：A實驗室用純水質(zhì)量表
精制方法
精制水的電阻率（歐姆.厘米）
純水的理論值
蒸餾水
玻璃容器一次蒸餾
玻璃容器三次蒸餾
石英容器三次蒸餾
石英容器23次蒸餾
復(fù)床式
混合床式
1.83X10（7）
1.0X10（6）
5.0X10（5）
1.0X10（6）
2.0X10（9）
1.6X10（7）
1.0X10（4）
1.8X10（7）
附B實驗室分析用水標準
序號
項目
指標
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13 外觀
PH
蒸發(fā)殘渣（mg/l）
灼燒殘渣（mg/l）
氨及銨鹽（NH4）（ng/l）
碳酸鹽（CO2）（mg/l）
硫酸鹽（SO4）（mg/l）
氯化物（CL）（mg/l）
硝酸鹽（NO2）（mg/l）
硅（mg/l）
鈣+鎂（mg/l）
重金屬（mg/l）
導(dǎo)電率（Ω） 無色透明，無臭無味
5.4—6.6
<5
<1
<0. 05
<0.2
無
無
無
無
<0. 1
無
8X10(-6)—5.8X10(—8)
第六節(jié) 新生犢牛血清的制備
1、 胎?；虺錾?4小時風(fēng)的新生犢牛適用。
2、 將小牛確實保定于手術(shù)臺上，注意頭部的保定；剪去頸部胎毛，充分暴露頸靜脈部位，以碘酒棉球、酒精棉球消毒手術(shù)部位。
3、 沿頸靜脈上緣切開皮膚，鈍性分離其下各種軟組織，暴露頸動脈。
4、 仔細分離頸動脈一側(cè)的迷走神經(jīng)，駁去動脈管上的包膜。
5、 在遠心端和近心端用止血鉗夾住頸動脈管，以手術(shù)刀尖切開動脈管，向心插入導(dǎo)管。
6、 收集血液前，去掉近心端的止血鉗，棄掉起先流出的幾滴血，然后小心插入收集血瓶內(nèi)，注意導(dǎo)管沿瓶壁放血，同時減少搖動收集瓶的次數(shù)。
7、 待血液凝固，血清析出棄分后（但時間不能太長，特別是室溫較高時，以免溶液血），離心分離血清。
8、 以0.22U微孔膜 過濾血清,分裝,標明制備日期,制備人.
9、 于56(度)滅能30分鐘,做法是將血清入水浴箱后,然后將水浴溫度調(diào)至56(度),溫度達到56(度)時,計時30分鐘.。
注意：不要先將水浴 溫度調(diào)至56（度）再滅能血清，這樣時間無法計算。
10、 待血清冷卻后，置于20（度）冰箱保存 備用。
第四章 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）的程序
第一節(jié) 間接ELISA試驗
一用可溶性抗原的ELISA：
1、 純化抗原：用包被液稀釋至1—20ug/ml；
2、 以50—100ul/孔量加入酶標板孔中；
3、 置4（度）過夜或37（度）吸附3h；
4、 PBST洗三次；
5、 每孔200ulPBS/NCS 4（度）過夜封閉或37（度）封閉3h；
6、 PBST洗5次，每次1min（包被板可—20（度）或許（度）保存?zhèn)溆茫?br /> 7、 每孔加50—100ul第一抗體，同時設(shè)陽性、陰性對照。若雜交瘤篩 選，每孔加雜交瘤培養(yǎng)上清；
8、 37（度）孵育2h
9、 PBST洗5次，每次5min
10、 每孔加50—100ul酶標第二抗體；若雜交瘤篩選，每孔加HRP標記的抗小鼠（IgG+IgM）抗體；
11、 37（度）孵育2h
12、 PBST洗5次，每次數(shù)5分鐘；
13、 每孔加OPD 或TMBS底物100ul
14、 37（度）避光作用；（OPD為10—20）分鐘，TMBS為40分鐘）；
15以50ul2MH2SO4終止反應(yīng)，在酶聯(lián)免疫閱讀儀上讀取OD值（OPD底物選用490nm濾光片，TMBS底物選用450nm濾:光片）；
16結(jié)果判定：
（1）P/N≥2.1 為陽性
(2) P≥N+3SD 為陽性
成功范例:NDV單抗檢測，粘附素單抗檢測，H單抗檢測 亞類鑒定和雞白痢檢疫等。
二、用全菌抗原的ELISA法
（一） GA法
1、 新鮮培養(yǎng)的細菌用蒸餾水懸浮，光密度法或比濁法調(diào)整細菌 濃度至1X10（6）個/ml。
注意：沙門氏菌等人畜共患病原體，使用前必須滅活或采用市售的滅活診斷菌液；
2、 酶標板中加200ul/孔，5%戊二醛（GA）溶液（0.1M NaHCO4 95ml+25%DNY戊二醛溶液5ml）;37(度);2小時
3、 蒸餾水洗5次;
4、 加細菌懸浮液,50ul/孔;
5、 37(度)溫箱內(nèi)過液,干燥吸附(20—24h)
6、 加PBS/NCS 220ul/孔37（度）封閉3小時或4（度）過夜封閉；
7、 PBST洗5次（—20（度）或4（度））存放備用；
8、 以下步驟同一。
（二） MA法
1、 細菌懸液（1X10（6））50ul/孔；
2、 室溫或37（度）干燥吸附；用甲醇（MA）固定；室溫10分鐘；
3、 加PBS/NCS封閉，37（度）3小時或4（度）過夜；
4、 PBST洗5次（于—20度或4度保存?zhèn)溆茫?br /> 5、 以下步驟同一
成功范例：H單抗檢測等。
三、用全細胞抗原的ELISA
1、 按常規(guī)方法培養(yǎng)細胞，接種病毒，收獲感染細胞和未感染的細胞 ，進行細胞 計數(shù)，用PBS制成適當(dāng)濃度懸液；
2、 加100ul/孔細胞懸殊浮液于酶標板內(nèi)，使每孔含細胞5X10（）
3、 將板離心1000rpm10分鐘，甩去上清，室溫干燥（可保存在4℃或—20℃?zhèn)溆茫?br /> 4、 PBST冼3次，每次5分鐘；
5、 每孔加100ul第一抗體或雜交瘤 上清，設(shè)立對照；
6、 37℃1—2小時；
7、 PBST洗3 次；
8、 每孔加入100ul酶標第二抗體，37℃1—2小時；
9、 PBST冼5次；
10、 每孔加入100ul底綬沖液，室溫作用30分鐘；
11、 判定結(jié)果。
成功范例：粘附素單抗，O抗原單抗檢測等。
注意：若需要，可滅活細胞內(nèi)源酶，以減少本底反應(yīng)。其它方法參見本章第六節(jié)。
第二節(jié) 直接ELISA
1、可溶性抗原或全菌抗菌素原（用量以方陣試驗確定）包被標板（50—100ul/孔）；
2、PBS/NCS封閉板（保存?zhèn)溆茫?br /> 3、 每孔加50—100ul酶標抗菌素體；設(shè)立陰性、陽性對照；
4、 37℃孵育2h
5、 PBST洗5次，每次5分鐘；
6、 以下同間接ELISA；
成功范例：沙門氏菌檢驗、抗血清效價測定、酶標抗體效價測定 等。
第三節(jié) 夾心ELISA試驗
1、 單一或混合單抗腹水或純化的免疫血清用包被液稀釋后25—100ug/ml；（有人使用蒸餾水直接稀釋腹水作包被）。
2、 以50—100ul/孔量加入酶標板中；
3、 置4℃過夜吸附或37℃吸附3h
4、 PBST 洗3次；
5、 PBS/NCS封閉，200ul/孔，4℃過夜或37℃3h；
6、 PBST洗滌5次，每次1min；（可于—20℃保存?zhèn)溆茫?br /> 7、 每孔加50—100ul待檢抗原，同時設(shè)立陰、陽性對照；
8、 37℃孵育2h；
9、 PBST洗5次，每次5min；
10、 每孔加50—100ul酶標單抗或酶標純化抗體；
11、 37℃孵育2h；
12、 PBST洗5次，每次5分鐘；
13、 37℃孵育2h
14、 PBST洗5次，每次5min；
15、以下步驟同前。
成功范例：雞新城疫病毒，大腸桿菌，沙門氏菌檢測。
第四節(jié) 競爭ELISA試驗
1可溶性抗原以包被液稀釋至1ug/ml（需方陣滴定確定），（全菌抗原包被方法參見前述）；
2、50—100ul/孔，包被酶標扳；
3、4℃過夜吸附；
4、PBST洗3次。每次5分鐘；
5、PBS/NCS封閉200ul/孔，37℃3hr或4℃（保存?zhèn)溆茫?br /> 6、PBST洗3次，每次5分鐘（可—20℃或4℃保存?zhèn)溆茫?br /> 7、 加50—100ul/孔待檢血清樣品，再加入50—100ul/孔單抗，設(shè)立對照；
8、 37℃孵育1—2h；
9、 PBST洗5次，每次5分鐘；
10、 每孔加OPD50—100ul；
11、 37℃避光作用10—20min；
12、 以100ul/孔加2M H2SO4終止反應(yīng)，測定OD490；
13、 判定結(jié)果：
（1） 抑制率（N—P/N）》50%判為陽性；
（2） OD490值《NCX Ⅹ0.3+PCX X 0.7為陽性(PCX為陽性對照的平均值,NCX為陰性對照的平均值)。
成功范例：檢測傷寒、雞白痢抗體等。
第五節(jié) Dot—ELISA
1、 根據(jù)實驗要求不同，選用硝酸纖維膜，混合膜或醋酸膜，并切成條帶，以硬模壓痕跡；
2、 以蒸餾水或TBS浸泡膜條帶，取出晾干后備用；
3、 抗原包被：
（1）、可溶性抗原（ug/ul），每點點加5ul，37℃烘干；
（2）、全菌抗原（1X10（6）/ml），每點點加5ul；37℃烘干，可先將條帶經(jīng)5%GA處理后，37℃3h或4℃過夜，再加樣烘干。
4、 TBS/NCS或BSA封閉；
5、 漂洗；
6、 將膜轉(zhuǎn)入酶標抗體內(nèi)，37℃0.5-2h;(間接法步驟是:先于第一抗體中浸染漂洗后，轉(zhuǎn)入酶標第二抗體中反應(yīng))。
7、 漂洗；
8、 把膜置入DAB或4—氯—1—萘酚底物中顯色，室溫10—30分鐘；
9、 漂洗；
10、 晾干后，判讀結(jié)果（可以進行掃描分析）。
成功范例：脂多糖抗原檢測，大腸桿菌檢測 ，單克隆抗菌素體篩選等。
第六節(jié) 酶標組化法
1、 抗原準備：
（1） 細胞涂片：
（2） 病變組織觸片或冰凍切片；
（3） 生長細胞的培養(yǎng)孔或玻片；
2、 4℃丙酮固定10分鐘；
3、 滅活內(nèi)源酶：
將待檢玻片浸入內(nèi)源酶滅活液內(nèi)，或于培養(yǎng)孔內(nèi)加入內(nèi)源酶 滅活液，室溫滅活30分鐘，棄去滅活液，以PBS和去離子水充分洗滌10—20分鐘，自然干燥；
4、 以PBS/NCS封閉，37℃2小時或4℃過夜；
5、 酶染：加酶標抗體反應(yīng)（或間接法步驟進行）37℃1—2小時，并設(shè)立對照；
6、 PBS洗15分鐘表；
7、 以DAB顯色，室溫避光30分鐘；
8、 鏡檢：細胞漿呈棕黃色，細胞 核無色，陰性對照無色，判為陽性。（4—氯—1—萘酚 顯色）。
成功范例：豬瘟組化法診斷。
第七節(jié) ELISA常用溶液的配方
一、 包被液
1、 碳酸鹽綬沖液
0.2M Na2CO3: 12g無水Na2CO3+100ml去離子水
0.2M NaHCO3：1.68g NaHCO3+100ml去離子水
取0.2M NaCO3：8ml，0.2M NaHCO3:17ml混合再加75ml去離子水,調(diào)PH至9.6。
2、 Tris—HCL綬沖液（PH6.0,0.02M）
0.1N Tris 100mｌ
0.1N HCL 58.4ml
培養(yǎng)離子水加至1000ml
(Tris MW 121.14)
3、 其它包被方式，如（GA、MA、BSA等方法，請參閱有親章節(jié)和文獻。
二、稀釋和封閉液
1、 EPBA（PH7.2）
NaCL 80g Na2HPO4.12H2O 14.5g
KCL 2g KH2PO4 2g
去離子水10升
2、 EPBS/Tween—20/NCS：
EPBS+0.05%Tween—20+10%NCS or ！%BSA
3、Tris—HCL綬沖液 PH7.0 0.01M
0.1M Tris 50.0ml
0.1N HCL 46.5ml
NaCL 8.5g
BSA 50g
正常山羊血清150ml檬酸:
去離子水1000ml
三、洗滌液
1、 EPBS/Tween—20
EPBS+0.05%Tween—20（或80）
2、 Tris—HCL/Tween PH7.4 0.02M
1.0M Tris 20ml
1.0N HCL 15ml
1.0N HCL 15ml 調(diào)PH至7.4
Tween—2.0 0.5ml
DW 加至于1000ml
四、底物溶液
1、 磷酸鹽—檸檬酸綬沖液（NO.1）
0.1M 檸檬酸:10.5g C6H6O7.H2O+DDW500ml
0.2M Na2HPO4.12H2O+DDW1000ml
取24.3ml0.1M檸檬酸、25、7ml0.2M NaHPO4再加50mlDDW
注:檸檬酸溶液 及配成的底物綬沖液不穩(wěn)定,易形成沉淀,因此一次不宜配制過多。
2、 OPD（鄰苯二胺）底物
NO.1底物綬沖液 10ml
OPD 4mg
3%H2O2 40ul
3、 TMBS（四甲聯(lián)苯胺硫酸鹽）
TMBS貯液：10mg/ml DMSO 4℃避光存放。
TMBS貯液 100ul
NO.1底物綬沖液 10ml
1%H2O2 25ul
4、0.05M PH 7.6 Tris_—HCL緩沖液
0.1M Tris 50ml
0.1N HCL 38.5ml
DW至100ml
5、TBS buffer （NO.2
20 Mm Trisbase
500Mm NacL
adjusted to PH7.5 With HCL
6、 DAB（二氧基苯胺鹽酸）底物
DAB 75mg
NO.2底物綬沖液100ml
避光攪拌3小時,使其溶解,濾紙過濾.臨用前加1%H2O2 0.5ml
7、4—氯—1—萘酚底物（4CN）
(1) 4CN貯液：3mg 4CN溶于是ml甲醇中，4℃保存；
(2) 使用液：2ml 4CN貯液+10mlTS buffer+H2O2至0.01%(V/V)
7、 酶反應(yīng)終止液
2m H2SO4
濃H2SO4 10ml溶于80ml DW
六、內(nèi)源酶滅活液：
0.01%H2O2,NaN,PH7.6 0.05M Tris—HCL綬沖液：
取PH7.5 0.05M Tris—HCL綬沖液98ml，加1%H2O21ml 1% NaN 1ml即成。
第八節(jié) 酶標抗體的制備
一、 1、 試劑
1、 0.1M NaHCO3：0.84gNaHCO3+DDW 100ml
2、 0.1M Na2CO3：1.06g Na2CO3-DDW 100ml
3、 EPBS：同第七節(jié)
4、 10mM NaIO4 204.0mg NaIO4+DDW 100ml
5、 0.1mM NaOH
6、 5mg/ml NaBH4：0.1g NaBH4+0.1mM NaOH 20ml
二、 HRP直接標記腹水中單抗
1、 5mg HRP溶于0.5ml 0.1M NaHCO3
2、 加0.5ml 10mM NaIO4，混勻，蓋緊瓶塞
3、 室溫（20℃）避光作用2h
4、 加0.75ml 0.1M NaCO3，混勻
5、 加0.75ml小鼠腹水，混勻
6、 用少許PBS將交聯(lián)物轉(zhuǎn)移到一支下口具玻璃棉的5ml注射器外筒中
7、 加Sephadex G15或50干粉0.5g，混勻。蓋緊，室溫作用（避光）3h
8、 用少許PBS將交聯(lián)物全部洗出
9、 收集洗出液，加1/20V新鮮配置的5mg/ml NaBH4溶液，混勻，室溫作用30分鐘
10、 再加3/20V NaBH4溶液，混勻，室溫作用1h或4℃過夜
11、 將交聯(lián)物過Sephdex G200或Sepharose 6B（2.5*50cm）層析純化，分管收集第一峰
12、 酶結(jié)合物質(zhì)量鑒定：
（1） 克分子比值測定
酶量（mg/ml）=OD403*0.4
Ig量（mg/ml）=（OD280-OD403*0.3）*0.62
酶結(jié)合物克分子比值（E/P）=酶量*4/IgG量
標記率=OD403/OD280
E/P值為1-2之間合格
（2） 特異性及效價測定：應(yīng)用ELISA同時確定酶結(jié)合物的特異性，酶活力，抗體活性及效價。
將酶結(jié)合物對倍稀釋后平行加于陰性孔及陽性孔，合適底物顯色后記錄各個稀釋度的特異及非特異顯色值，繪制特異及非特異反應(yīng)曲線，比較二條曲線可以確定其特異性，酶活力及抗體活性。特異顯色為1.0時的稀釋倍數(shù)，一般可作為交聯(lián)物的效價。實際使用濃度應(yīng)適當(dāng)升高2-5倍。
13、 酶標記抗體的保存：加等量甘油（A.R）后，-20℃存放。
三、 HRP標記提純抗體制劑：（純化抗體請參見有關(guān)章節(jié)）
（一） HRP 的活化
1、 5mg HRP（RZ>3.0）溶于0.5ml新配制的0.1M NaHCO3試管中；
2、 在上述溶液中加入0.5ml 10mM NaIO4，試管加塞塞緊，20℃暗處放置2h
3、 加0.1ml 0.1M Na2CO3以減慢氧化
（二） 標記
1、 用0.1M Na2CO3（Ph9.2）（1-2ml）配制15mg Ig溶液
2、 將Ig溶液加入HRP溶液（HRP：IgG分子比為1：2）
3、 立即將IgG-HRP混合液移入5ml注射器外筒（下口塞有玻璃棉，并接上橡皮帽），加入混合液重量的1/6 Sephadex G25或50干粉；室溫3h或4℃過夜
（三） 穩(wěn)定化
1、 用少許PBS洗脫酶標記物
加入1/20V的NaBH4酶標記物中；室溫作用30分鐘，加入3/20V的NaBH4，室溫作用1h（可與4℃過夜）
（四） 提純同前。
（五） 酶結(jié)合物質(zhì)量鑒定及保存，同前。
成功范例：酶標記大腸埃希氏菌粘附素單抗，沙門氏菌O、H抗原單抗，NDV單抗，羊抗鼠Ig抗體等。
第五章 免疫熒光試驗程序
第一節(jié) 間接免疫熒光試驗
一、 抗原制備
1、 固定細胞片的制備：
生長在蓋片上的細胞（接種或未接種病毒），可直接收獲蓋片，在PBS中洗滌，用4℃100%丙酮固定2分鐘，空氣干燥，置密封容器于—20℃保存?zhèn)溆?；單元細?懸液可在蓋片上制成涂片，固定方法同上。
2、 單細胞 懸液制備：
用含0.1—1%BSA和0.1%的疊氮鈉的PBS洗2—3次。注意所有各步需在4℃進行！經(jīng)細胞 計數(shù)，調(diào)節(jié)細胞 濃度至10（7）/ml，可供作活細胞 的膜熒光染色。
3、 細菌涂片的制備：
將10ul細菌懸液（1X10（6）個/ml）涂沫7X21mm蓋玻上，自然干燥后，用—20℃丙酮固定10—15分鐘，于—20℃保存?zhèn)溆谩?br /> 4、 病變組織觸片的制備，按常規(guī)方法。
5、 病變組織冰凍切片的制備。
二、抗體染色及結(jié)果觀察
1、 蓋片在去離子水中濕潤后置架上滴加10—20ul雜交瘤上清或其它待檢樣品，設(shè)立陽性、陰性對照。
2、 37℃水浴 孵育0.5—1h。
3、 蓋片在PBS（PH7.4,0.01M）中用磁力攪拌器洗滌15分鐘.
4、 取出蓋片置架上,滴加工作濃度己測定的熒光第二抗體.
5、 37℃孵育0.5—1h。
6、 洗滌15分鐘。
7、 取出蓋片，用延緩熒光猝滅的封載劑封存于干革命凈玻片上。
8、 在熒光顯微鏡下觀察：
陽性結(jié)果：可在細胞 漿，或細菌外周，或細菌粘附素鞭毛等可見特異性熒光（FITC為黃綠色熒光）。
成功范例：粘附素單抗檢驗，O抗原單抗檢驗、NDV單抗檢驗、NDV診斷等。
附一：活細胞的膜熒光染色
1、 在小試管中加入100ul單細胞懸液后，再加100ul第一抗體，并混勻。在冰浴上孵育30—60分鐘。
2、 將細胞 重新懸殊浮1—5ml洗滌劑中，以400g離心5分鐘洗滌，重復(fù)一次。
3、 以100ul洗滌劑懸浮，加工廠100ul熒光抗體，置冰浴30—90分鐘。
4、 洗滌2次
5、 將細胞 重新懸浮于20—30ul含水量10% 甘油，10—100ug苯二胺（）ml的洗液中（PH7.0左右）滴于載玻片上,加蓋玻片封載.
6、 立即在顯微鏡下檢查,細胞亦可在染色后用1%多聚甲醛生理鹽水固定,立即檢查,或至少在4℃可保存一周.
成功范例:NDV單抗膜熒光染色
附二:
1、雙重染色:標本中有兩種不同抗原,可用FITS和RB200,分別標記 兩種抗體,同時或先后反兩種熒光抗體進行染. 2、反襯染色：對于組織標本，為了加強特異性熒光的鮮明性，常需使用反 襯染色。最常用者為伊文氏藍（1：10000—1：100000），它發(fā)射紅色熒光，可反襯出FITC的黃綠色熒光。
附三：
1、 PH7.4 0.1M磷酸緩沖液
Na2HPO4.12H2O 28.94g
KHPO4 2.6g
DW 1000ml
應(yīng)用時取上述貯存液100ml,加入NaCL8.5g,加DW至1000ml,即為PH7.4 0.01M PBS.
2、緩沖甘油
SoL.Ι
甘油(A.R.) 9份
PBS 1份
SoL Ⅱ
甘氨酸 0.42g
NaOH 0.021g
NaCL 0.51g
NaN 0.03g
D.W. 至30ml
加入 70ml
第二節(jié) 直接免疫熒光試驗
1、 抗原制備同前
2、 加染熒光素標記的特異抗體。
3、 37℃溫育30—60分鐘。
4、 洗滌15分鐘。
5、 取出蓋片，完全干燥后，用封片油封于干凈的勒玻片上。
6、 鏡檢
成功范例：沙門氏菌快速檢驗，NDV診斷。
第三節(jié) 熒光抗體的制備
一、 試劑
1、 PH9.3碳酸鹽緩沖液
無水Na2CO3 8.6g
NaHCO3 17.3g
D.D.W 1000ml
2、 PBS（PH7.4，0.01N）同前
3、 二甲基亞砜
二、標定程序
1、 以碳酸鹽緩沖液調(diào)整蛋白濃度至10mg/ml；（腹水單抗可直接用碳酸鹽緩沖液稀釋；提純的抗體IgG，需經(jīng)SephadexG25柱層析或透析方法轉(zhuǎn)換緩沖體系至碳酸鹽緩沖液）。
2、 取代5ml抗體溶液于10ml小燒杯內(nèi)，磁棒輕攪。
3、 稱取1mlFITC溶解于0.2mlDMS中。
4、 待溶解后立即緩慢滴加于抗體液內(nèi)。
5、 20℃閉光作用2h，可不攪拌。
6、 將交聯(lián)反應(yīng)后的溶液經(jīng)SephadexG25或G50柱析層除去游離的熒光素。
7、 收集第一峰為標記的抗體。
三、FITC結(jié)合物質(zhì)量鑒定
1、 測定F/P比值：
OD100-0.35XOD495
[IgG]（mg/ml）=——————
1.4X
F/P=2.87
抗IgG熒光抗體F/P比不宜高于1---2；抗細菌熒光抗體F/P可允許高于2，乃至高標記（F/P10——15）。
2、 特異性及效價測定
以標記抗體染色各種抗原的蓋片，同時測定其特異染色滴度和非特異染色滴定，并觀察抗體活性。
四、標記抗體的保存
標記抗體宜保存于4℃；
或加50%甘油（A.R），-20℃凍存。
成功范例：沙門氏菌O抗原單抗標記，羊抗雞IgG的標記抗體的制備等。
第六章 間接血凝試驗的程序
第一節(jié) 脂多糖敏化甲醛化綿羊紅細胞的制備
一、 甲醛化綿羊紅血球制備：
（一） 醛化血球試劑：
1、PH7.2 PBS
NaHPO4.12H2O 3.5816g
KH2PO4 0.4082g
NaCl 8.014g
D.W. 1000ml
3、 雙倍離子強度的PH7.2PBS
Na2HPO4.12H2O 0.3581g
KH2PO4 40.82g
NaCl 0.814g
D.W. 50ml
4、 抗凝保存液（即Alsever氏液）
枸椽酸鈉 0.8g
枸椽酸辣 0.055g
氯化鈉 0.42g
葡萄糖 2.05g
D.W. 1000ml
5、 甲醛（A.R.或C.P.）:臨用前用雙倍離子強度的PBS作對稀釋,配成20%的甲醛。
6、 飽和硫酸銨溶液：按25℃飽和溶解度配制。
（二）、步驟：
1、 無菌采集綿羊頸靜脈血50ml，用要枸椽酸鈉作抗凝劑；
2、 用5倍于紅細胞壓積的PH7.2PBS充分洗滌5次,每次1500rpm5___10分鐘,直至上清測定無蛋白質(zhì)(用飽和硫酸銨滴定上清,觀察有無白色沉淀),再以相同緩沖液配制成25%SRBC懸液;
3、 25%SRBC與20%甲醛以25:1的比例混勻,37℃水浴作用2小時;每15分鐘振蕩一次,紅細胞顏色由紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樽厣?
4、 取出,以PH7.2PBS洗滌4次,每次2000rpm10分鐘,再加同樣的PBS,制成25%SRPB;
5、 重復(fù)第三步醛化一次,同法洗滌;
6、 最后配制相當(dāng)于20%醛化SRBC懸液,并加入侵.3%甲醛(最終濃度)或者0.01%硫柳汞防腐,分裝,4℃保存?zhèn)溆?
二\脂多糖抗原制備___熱酚水法
1、 菌泥懸浮于100ml水中，或20g菌粉懸于350ml水中；
2、 將新配的90%（V/V）苯酚（最好是新蒸的）預(yù)熱至68℃—70℃；
3、 加酚液于菌液中，至酚的最終濃度為45%，68℃水浴作用25分鐘，并充分振蕩；
4、 冷卻至10℃左右，12000rpm30分鐘，離心管內(nèi)分層情況依次是：水層、蛋白質(zhì)層、酚層和沉淀物。
5、 小心吸取上清，（準備透析袋）
6、 余下部分再加水80ml，68—70℃水浴維持30分鐘，冷卻至0℃左右，離心吸水層；
7、 將水層提取物裝入透析袋，流水透析1天，蒸餾水透析2天；
8、 收集粗品LPS，凍存?zhèn)溆谩?br /> 三、蒽酮比色定糖法—測定粗制LPS的多糖含量。
1、 原理：蒽酮可以和游離的或多糖中存在的己糖果，醛戊糖及己糖果醛 酸起反應(yīng)，反應(yīng)后溶液顯藍綠色，于620nm處有最大吸收。
2、 試劑：
（1） 2g/L蒽酮試劑 ：溶解2克蒽 酮于濃硫酸（A.R. d=1.84,95%）,宜當(dāng)日配制使用.
（2） 0.1g/L葡萄糖溶液或0.1g/L糖元溶液.
3、實驗步驟
（1） 標準曲線制備
管號 1 2 3 4 5 6 7 備注
標準葡萄糖液 0.05 0.10 0.20 0.30 0.40 0.60 0.80 置水浴中
蒸餾水 0.95 0.90 0.80 0.70 0.60 0.40 0.20 置水浴中
蒽酮試劑 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
沸水浴 蒽酮 加入后，將試管移入沸水浴 ，煮沸10分鐘，冷卻至室溫
測定OD820值
含糖量 5 10 15 20 25 30 35
繪制標準曲線：以O(shè)D820為縱坐標，糖含量（ug/ml）橫坐標繪制標準曲線。
或以統(tǒng)計方法，求出糖含量與OD820之間的相關(guān)系數(shù)，及直線回歸方程。
（2）樣品含糖量測定：
取1ml稀釋的粗制LPS，加速度。3.00蒽 酮試劑,混勻后迅速置于冰浴 冷卻.然后轉(zhuǎn)入沸水浴 中煮沸10分鐘表（與制備標準曲線同時進行）。冷卻至室溫后，測定OD820，從標準曲線中查找相應(yīng)糖含量，或代入回方法求得糖果含量。
四、脂多糖抗原致敏甲醛化SRBC
1、 取粗制LPS，加0.2M PH8.0 PB液,調(diào)整多糖濃度至120ug/ml,100℃水浴 1小時.
2、 冷卻至少37℃;
3、 配制6%醛化SRBC溶液;
4、 將熱處理LPS與醛化SRBC等量混合,37℃攪拌作用45分鐘;
5、 取出離心2000rpm10分鐘,以0.01M PH7.2PBS洗澡4次;
6、 配制4%致敏血球,分裝,保存于4℃?zhèn)溆?
7、 致敏血球質(zhì)量鑒定:
（1） 自凝性測定：血球制備過程中，洗滌不徹底，或過度化等，都可引起血球的自凝。
（2） 特異性測定：與不同抗體試劑反應(yīng)，確定其反應(yīng)特性。
（3） 工作濃度測定 ：選擇最佳最省的致敏SRBCIPYA。
附0.2MPH8.0PB溶液.
基礎(chǔ)液A 0.2Mna2HPO4
Na2HPO4.2H2O(MW353.22) 35.61g
或 Na2HPO4.12H2O(MW352.22) 71.6g
DW 1000ml
基礎(chǔ)液B 0.2M NaH2PO4
NaH2PO4.H2O(MW138.01) 27.6g
或NaH2PO4.2H2O(MW156.03) 31.21g
DW 1000ml
使用液: A液94.7ml +B液5.3ml
成功范例:沙門氏菌脂多糖抗原敏化SRBC制備,及其在單抗檢測、雞白痢等檢疫中的應(yīng)用。
第二節(jié) 蛋白質(zhì)敏化SRBC的制備
一、 雙醛化紅細胞制備
1、 采綿羊抗凝血；
2、 用10倍于紅細胞 壓積的0.11MPBS(PH7.2)洗4—6遍；
3、 用同一PB配成8%SRBC；
4、 配制醛 化試劑：
丙酮醛 3ml
甲醛 6ml
0.11MPB液(PH7.2) 94ml
5、 將醛化試劑緩慢加入等到量的8%SRBC中；
6、 室溫（20℃）緩慢攪拌17小時；
7、 PB洗三次；
8、 配成20%雙醛化SRBC，加0.1%NaN2防腐,4℃保存?zhèn)溆?
附:醛化紅細胞 的鞣酸處理亦能吸附蛋白,但其敏感性很低;經(jīng)鞣酸化后,紅細胞 吸附蛋白質(zhì)的量顯著增加,但同時加強了紅細胞 的不穩(wěn)定性,(請根據(jù)要求確定是否要鞣 酸化).,容易自凝,但增強了反應(yīng)的敏感度.可用1%正常免疫血清穩(wěn)定之.
1、 將醛化紅細胞 配成2.5%懸液;
2、 加入新鮮配制1:10000稀釋的鞣 酸溶液 ;
3、 混勻后置37℃水浴15分鐘;
4、 洗滌后再配成品2.5%懸液.
二、 抗原致敏
1、 取20%雙醛 人紅細胞 01ml,1500g離心棄上清
2、 ;沉積紅細胞 加0.2M PH4.醋酸—醋酸鈉緩沖液1ml，并加最適濃度（預(yù)先要測定，蛋白抗原為50ug/ml左右）的抗原1ml
3、 混勻，于45℃致敏35分鐘，不時輕輕搖動使紅細胞 不下沉；
4、 離心棄上清，并用20倍紅細胞 壓積的PB 洗4次；
5、 配成1%致敏血球，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br /> 成功范例：粘附素致敏感SRBC。
第三節(jié) PHA試驗程序
1、 V型微量血凝板上每孔加入PH7.2PBS稀釋液25ul(一滴),一個樣品做一排;
2、 加入25ul雜交瘤培養(yǎng)上清液或其它待檢血清,依次作倍比稀釋;同時設(shè)立陰性,陽性對照;
3、 再加入0.5—4%致敏血球1滴；
4、 將血凝板在振蕩器上，振蕩30秒；
5、 置室溫半小時觀察結(jié)果。
第七章 免疫膠體金試驗程序
1、 取樣：銅網(wǎng)沾取細菌懸液（80億/ml）；
2、 漂洗：PH7.4 0.05M TBS,三次,每次5分鐘;
3、 第一抗體(單抗)反應(yīng):與一定稀釋度的抗體應(yīng),37℃半小時;
4、 PH7.4 0.05M TBS漂洗
5、 ;與兔抗鼠IgG37℃作用半小時;
6、 先PH7.4 0.05M TBS漂洗三次,每次分別再用PH8.2 0.02M TBS漂洗三次,每次5分鐘
7、 ;與羊抗兔膠體金(陜西省中醫(yī)藥研究院)（1：10）稀釋液作用，4℃過夜，（或用SPA膠體金，寧軍區(qū)醫(yī)院）；
8、 先用PH8.2 0.02M TBS漂洗三聯(lián)單次,每次5分鐘,再用PH7.4 0.05 TBS 漂洗,每次5分鐘;
9、 晾干后電鏡觀察.
成功范例:大腸埃希氏菌粘附抗原定位,沙門氏菌O抗原、H 抗原定位。
附：
一、負染色：常規(guī)電鏡負染色法，細菌懸液濃度8億/ml，1%PTA染色30秒鐘?；蜚~網(wǎng)經(jīng)0.02%GA室溫處理30分鐘,然后吸干,滴加培養(yǎng)菌液或提取抗原,用1%磷鎢酸染30秒,晾干后電鏡觀察.
二、免疫酶染色：
1、 同前
2、 同前
3、 同前
4、 與羊抗BALB/C小鼠IgG酶標抗體作用，37℃半小時，經(jīng)PH7.4 0.05M TBS漂洗后,與底物溶液作用5—10分鐘，漂洗，晾干后電鏡觀察。
附：1、底物溶液：PH7.6 0.05M Tris—HCL緩沖液
0.125% DAB
0.03% H2O2
3、 1%BSA：以PH7.4 0.05M TBS配制
第八章 免疫球蛋白亞類測定的程序
第一節(jié) 免疫擴散法
單抗類和亞類鑒定的常用方法
一、 試劑
1、0.06M巴比妥鈉—鹽酸緩沖液 PH8.6
（1） 0.06M巴比妥鈉(MW 206.18) 1.237g
D.W 100ml
(2) 0.2N鹽酸溶液
濃鹽酸 1.68ml
DW 至100ml
(3) 0.06M巴比妥鈉—鹽酸緩中液PH8.6 取(1)液化氣100.00ML,用力.2N鹽酸溶液調(diào)節(jié)PH至8.6(大約用4.00ml)
2、1%agarose
agarose（B.R.） 0.8g
0. 06M巴比妥鈉鹽酸緩沖液80.0ml
隔水煮 沸溶化.
5、 羊抗小鼠IgG亞類血清
IgM， IgG，IgG32，IgG24，IgG2
二、 方法
1、 澆瓊脂糖板，每片約3ml；
2、 瓊脂糖板打孔（孔徑為1—2mm，孔間距離3—5mm），挑出孔內(nèi)瓊脂后，補孔；
3、 向中央孔注入抗Ig亞類抗血清，周圍孔加入待測樣品（1：20稀釋腹水樣品，或20倍濃縮的培養(yǎng)上清），每孔2—3ml；
4、 置濕盒內(nèi)室溫下擴散或4℃過夜觀察沉淀線，判定結(jié)果。
附：（1）20倍濃縮的雜交瘤培養(yǎng)上清的制備。最簡單方法是將20ml培養(yǎng)上清倒入一平皿，電扇砍風(fēng)蒸發(fā)濃縮至于ml，或裝過透析袋，用PEG6000或蔗糖吸水；
或以濃縮膠吸收上清中水份。
單克隆濃縮抗體是上清中在的叭一的小鼠Ig，因此，濃縮培養(yǎng)上清是鑒定Ig類和亞類的最好材料。
（2）20倍稀釋的雜交瘤腹水
因為腹水中含有小鼠正常Ig，所以用腹水（或血清）鑒定單抗類和亞類，可能會得到模棱兩可的結(jié)果，在大多數(shù)情況下腹水經(jīng)過1：20稀釋后，其中的正常Ig濃度變得很低，不易被免疫力擴散測出。
第二節(jié) ELIST法
1、 用EPBA稀釋山羊抗菌素小鼠Ig至工作濃度；酶標板每孔加入100ul，37℃孵育2小時。
2、 用PBST洗滌3次。
3、 每孔加200ul 1%BSA EPBS 37℃1小時。
4、 PBST 洗滌2次。
5、 加100ul雜交瘤上清液，37℃2小時，或4℃過夜。設(shè)立陰陽對照。
6、 PBST洗4次
7、 分別加入100UL多種兔抗小鼠Ig亞類特異血清，每種至少重復(fù)（）孔，37℃2小時。
8、 PBST洗4次
9、 加100ul HRP標記的羊抗兔Ig，37℃2小時。
10、 PBST洗4次。
11、 每孔100ul OPD底物顯色，室溫作用15分鐘，2M濃H2SO4終止反應(yīng)。
12、 肉眼觀察結(jié)果，或測OD490值判定結(jié)果。
第九章 免疫血清的制備
第一節(jié) 免疫球蛋白提取與純化
一、 試劑
1、 飽和硫酸銨：500g(NH)2SO4(A.R.)加入500ml D.W.中，加熱至完全溶解，室溫過夜，臨用前用2N NaOH調(diào)pH至7.8。
2、 32%硫酸鈉溶液：72.6g NaSO4.10H2O 溶于60-80ml D.W.中，定容至100ml
3、 16%硫酸鈉溶液：50ml32%硫酸鈉溶液加于50mlD.W.，混勻。
4、 2N NaCl
5、 2N NaOH:16gNaOH+200mlD.W.
6、 0.5NnaOH:20gNaOH+1000mlD.W.
7、 2%NaHCO3(煮透析袋用):8gNaHCO3+400mlD.W.
8、 PBS (10mMNaH2PO4_Na2HPO4,10mMNaCl PH6.8):
Na2HPO4.12H2O 17.55g
NaH2PO4.2H2O 7.96g
NaCl 5.84g
D.W. 10000ml
9、0.5M氯化鋇溶液(檢測SO42-)氏試劑
10、萘氏試劑（Nesslers reagent）：
碘化汞 115g
碘化鉀 80g
D．D．W．（不含氨）500ml 待溶解后，過濾，濾液中加入20%NaOH500ml。
測定時，取樣品3—4ml，加入上述萘氏試劑1—2滴，若有銨離子存在，則出現(xiàn)磚紅色反應(yīng)，甚至可發(fā)生棕色沉淀。
二、 免疫球蛋白（IgG）粗提
所得粗制Ig，可以作為免疫原，可用作標記抗體制備。
(一) 硫酸銨沉淀法
適用于鼠、兔、豬、羊、雞等血清或抗血清和小鼠單搞腹水中Ig的提取。此方法為鹽析法提取Ig的首選方法。
1、 取10ml血清、抗血清或勝地水，10000rpm15分鐘，去除細胞碎片及其它顆 粒物質(zhì)。
2、 將上清轉(zhuǎn)移于小燒杯中，其內(nèi)置磁棒，于磁力攪拌器上輕攪拌。
3、 滴加飽和硫酸銨（PH7.8）5.0ml,加時應(yīng)緩慢,每加一滴后應(yīng)待混勻后再加下一滴.
4、 繼續(xù)輕輕緩慢攪30分鐘,注意避免產(chǎn)生氣泡.
5、 10000rpm15分鐘.
6、 棄去上清液,沉淀物用1/3飽和度硫酸銨懸浮,10000rpm15分鐘
7、 .重復(fù)步驟6二次
8、 .最后一次洗澡后的沉淀溶于1.5mlPBS中.
9、 于透析袋內(nèi)過夜透析(4℃).其間換液3—5次，直至檢查不到NH4（）和SO4（）。
10、 移出蛋白質(zhì)溶液，1000rpm15分鐘，收存上清液即為粗提免疫球蛋白。
或?qū)⒌鞍踪|(zhì)溶液經(jīng)SephadeX G25 或G50層析過程，均以PBS作平衡液和洗脫液。
11、 收集第一峰，測定蛋白質(zhì)含量（mg/ml）。
[Pr]=（1.45XOD280—OD290X0.74）X稀釋倍數(shù)
OD280
或[Pr]=——————X稀釋倍數(shù)
1.3
或[Pr]=1.5(OD280—0.5XOD290)X稀釋倍數(shù)
12、 小量分裝后，4℃可長期保存，亦可—20℃凍存或凍干保存。
13、 提純的Ig保存要求PH中性，鹽濃度過100—200Um，蛋白質(zhì)1—10mg/ml，加防腐劑。此外，使用或分離Ig的溫度最好是2—4℃。特別是雞、小鼠、大鼠等要比其次動物Ig更不穩(wěn)定，因此，在處理這類Ig時特別當(dāng)心。
（二、）硫酸鈉沉淀法
適用于兔和雞血清中的Ig提取，但該不穩(wěn)定。
1、2、同前
3、滴加速度32%Na2SO4溶液10ml，滴加時應(yīng)慢，每加1滴后待混勻后再加下一滴。
4、繼續(xù)緩慢攪拌30分鐘。
5、 10000rpm15分鐘。
6、 棄去上清液，沉淀物用16%Na2SO4懸浮，10000rpm15分鐘。
7、 重復(fù)步驟6二次。
8、 以下步驟同前。
附一、 不同動物血清球蛋白硫酸銨鹽析濃度參考值
血清來源
硫酸銨飽和度（%）
家兔
山羊
綿羊
小鼠
大鼠
雞
馬
豬
33X3次
30X1，33X2
33X3
33X1，40X2
35X1，40X2
33X3
30X1，45X1
33X3
30X1，45X1
33X3
附二 透析袋處理
1、 透析袋于2%NaHCO3+1Mm EDTA 中煮10分鐘。
2、 用蒸餾水洗透析袋子內(nèi)、外表面。
3、 再用蒸餾水煮10分鐘。
4、 冷至室溫即可使用。如暫時不用則將透析袋浸于0.2MEDTA溶液中，4℃存放。
5、 使用后的透析袋用 DW反復(fù)部洗后，同上法處理，浸于0.2M EDTA溶液，4℃存放。
6、 注意事項：
（1） 透析袋亦可高壓滅菌消毒。
（2） 吸取或裝入透析物時，手指不能直接接觸透析袋，應(yīng)戴一次性手套或使用鑷子。
（3） 透析袋用應(yīng)及時洗滌、 處理，以便重復(fù)使用。注意節(jié)約。
三、 免疫球蛋白的純化
（一） 離子交換柱的制備
1、 20g DEAE---纖維素(whatman DE 32)浸泡于200ml 0.5NHCL,0.5小時，中間攪動兩次。
2、 用蒸餾水反復(fù)抽洗，直至PH接近D.W.的PH值。
3、 用200ML 0.5N NaOH浸泡15分鐘，中間攪動兩次。
4、 抽去液體。
5、 將濕膠再用功200ml 0.5NaOH懸浮，浸泡15分鐘，然后抽去液體。
6、 重復(fù)步驟5
7、 將濕膠再用D.W.反復(fù)抽洗 ，直至抽出液PH值接近D.W.的PH值。
8、 再用起始緩沖液反復(fù)沖洗，直至抽出液的PH值勤和導(dǎo)電值與起始緩沖相同。
9、 在裝柱前，去除微細顆粒。柱底填一些玻璃棉，上面再放置一層Washed sand或glass beads以防cellulose流出柱。
10、 用緩沖液淋洗，使柱床穩(wěn)定（2.0 ×30cm）流速1---3 ml/分鐘或20滴/分鐘。
（二） 純化免疫球蛋白
1、 將脫鹽后的粗蛋白對離子交換柱加樣。注意每克DRAE---纖維素能受的蛋白質(zhì)為了30—50g。
2、 梯度洗脫（0---300M NaCL）,用自動部分收集器分管收集，每管5ml。起始液為PBS(0.01M PB,0.01M NaCL,PH6.8)或(0.01M Tris—HCL PH6.8)。
3、 測定蛋白測量，分裝-20℃凍存
4、 此法提取的主要是IgG ,但可能會混有β-球蛋白。每毫升血清或腹水可提得Ig3-10mg
5、 若需進一步提純，可過Sephacryls-300柱層析
(86-123)缺
（三） 凝膠再生的方法
1、 洗脫出第一蜂后，用2N NaCL淋洗至基線穩(wěn)定，再用起始緩沖液抽洗至洗出液的電導(dǎo)值與緩沖液相同，重新裝柱使用。
2、 如再生膠暫不使用，應(yīng)加防腐劑，置4℃保存，下次裝柱應(yīng)抽洗去除防腐劑。
成功范例：羊抗鼠IgG，各種單抗、豬、雞、小鼠等血清中IgG。
四、 親和層析一步法提純IgG
1、 每5ml濕膠（1.5g干粉）可以經(jīng)合100—125mg IgG。
2、 血清或腹水或雜交瘤培養(yǎng)上清加樣后，以PBS充分洗滌，至記錄儀基線穩(wěn)定。
注意：直接使用腹水，可能會因纖維蛋白而阻斷親和力。
3、 以0.1N甘氨酸—HC L，PH2.5作為洗脫液,注意在PH2.5不穩(wěn)定的抗體,應(yīng)考慮用較高PH 進行洗脫.
4、 迅速以1M Tris—HCL PH8.0中和洗脫的提純Ig(亦可透析中和).柱再生.
5、 以下步驟同前.
成功范例:提純兔抗鼠IgG。
附一、 不同IgG亞類與SPA結(jié)合與洗脫的條件
IgG亞類
來源
結(jié)合
洗脫
IgG1
IgG24
IgG24
IgG9
小鼠
小鼠
小鼠
小鼠 PH>8.0
PH>7.0
PH>7.0
PH>7.0 PH<6.0
PH<4.5
PH<3.5
PH<4.5
附二、SPA與免疫球蛋白的結(jié)合活性
免疫球蛋白
SPA
免疫球蛋白
SPA
小鼠IgG1
IgG24
IgG24
IgG6
IgM
IgA
IgE
兔IgG
雞IgG
+（—）
+
+
—
—
—
—
+
— 山羊IgG1
IgG2
綿羊IgG1
IgG2
豬IgG
貓IgG
豚鼠IgG
—
+（—）
—
+
+
+
+
—
（二） 羊抗鼠Ig交聯(lián)Sepharose 4B以提純小鼠Ig
注意：溴化氰易揮發(fā)，如果吸入或通過皮膚吸收有巨毒，所有接觸CNBr設(shè)備應(yīng)浸在NaOH中，在通風(fēng)櫥里過夜，然后將氰化物洗掉。
1、 以1升水用真空抽濾的方法Sepharose 4B（10ml沉淀體積），去除防腐劑（不要完全抽干），重懸于水中，總體積為18ml，置于50ml的燒杯中。
2、 加入2ml碳酸鹽沖液（0.5M碳酸鈉PH10.5）和磁力攪拌 子,在通風(fēng)櫥中攪拌,將PH 電極置于懸液中,檢查攪拌器和PH計的工作情況.
3、 戴好手套,小心將1.5克CNBr(避免大顆粒)倒入小瓶中。（在通風(fēng)櫥中完成這項工作是安全的，先稱小瓶和瓶蓋子的重量，然后在通風(fēng)櫥中往小瓶中加CNBr，小心蓋緊蓋子，移出通風(fēng)櫥稱重，原來裝CNBr的瓶子的藥勺留在通風(fēng)櫥中）。
4、 緩慢的攪拌Sepharose懸液，監(jiān)測PH并加入固體CNBr（將藥勺和空小瓶置于1M NaOH中），逐滴加入4M的NaOH 以保持PH在0.5—11.0,直至固體CNBr全部溶解以及PH降低的速度減慢(10—15分鐘)。
在此過程中如果PH高于11.5,則棄去Sepharose,重做.
5、 用燒結(jié)玻璃或布氏漏斗過濾混合物，用2升冷檸檬鹽緩沖液（0.1M PH6.5檸檬酸鈉,預(yù)冷卻至4℃）迅速洗滌Sepharose(不要完全干),小心處理過濾器(含CNBr).
6、快速將活化的Sepharose加到IgG溶液（100mg溶于10ml檸檬酸緩沖液中置于
4℃）中，置于轉(zhuǎn)動混勻器上，使之不斷的輕輕混勻，4℃
過夜。如果沒有轉(zhuǎn)動混勻器，則輕輕攪拌混合物1小時，然后靜置過夜）。
7加1ml乙醇銨溶液，繼續(xù)輕輕攪拌1小時，以確保安全去除活性基因。
8讓Sepharose自然沉降，上清用500g離心5分鐘，在280nm測上清液吸光度，計算未偶聯(lián)到Sepharose上的IgG百分率。假設(shè)上清液的總體積為11ml（蛋白溶液+乙醇胺）加5ml（10ml Sepharose的內(nèi)部液體體積）。IgG未偶聯(lián)率小于10%，通常為1—5%。
9、將IgG—Sepharose 裝于合適的柱（可將多孔圓盤放在注射針筒骨來制造一個簡單的柱）中，用PBS洗滌，柱中加入含0.1%疊氮鈉的PBS,4℃
保存.
10分離提純Ig同前述可參閱有關(guān)資料。IgG—Sepharose有時要用同類動物正常Ig封閉之。
成功范例：提純培養(yǎng)上清中的單抗。
第二節(jié) 幾種常用抗原的制備
一、 脂多糖抗原制備
（一） 粗制LPS制備，參見第六章
（二） 精制LPS制備
1、 粗制LPS經(jīng)3倍95%酒精，37℃水浴作用15分鐘；離心后，沉淀物以蒸餾水配成3%溶液。
2、 超速離心100000Xg 4小時。上層為上清液，中間層為沉淀的LPS膠體，下層為粘液樣沉淀物。
3、 吸棄上清，小心取出沉淀物的LPS膠體（中間層）。
4、 將LPS溶解在原體積的1/2蒸餾水中，再離心一次。
5、 沉淀的LPS溶液于少量DW中，凍干保存。
超離后分層情況
（三） 多糖抗原制備：
1、將LPS 200mg溶解在20ml 1%醋酸溶液中，以移入帶塞的試管中。
2、 100℃水浴30分鐘。
3、 5000Xg離心沉淀類脂，吸取上部液體，裝入透析袋中，4 ℃透析48小時。
4、 凍干提取的多糖，產(chǎn)量為LPS的30——、40%。
成功范例：沙門氏菌A—F群LPS提取。
二沙門氏菌鞭毛抗原的制備
1、將半固體培養(yǎng)基篩選活潑動力的單相沙門氏菌血清型接種到10mlM肉湯中，37℃
16小時。
2、 再移種到500ml M肉湯中，37℃16小時。
3、 400ur/m離心30分鐘，收集細菌。
4、 以適量生理鹽水懸浮菌泥，并用1N鹽酸調(diào)至PH7.0,室溫輕度振蕩30分鐘.
5、 1000r/m 30分鐘.上清中含有大量脫落下來的鞭毛素.
6、 以1NnaOH將上清調(diào)至PH7.2.
緩慢加入飽和硫酸銨溶液,邊加邊攪拌,達67%飽和硫酸銨濃度后,4℃過夜.
8次日將上清以15000r/m4℃離心20分鐘。
9、 將沉淀物溶解于2ml蒸餾水中。
10、 過Sephacryl S300層析柱（2.0X50cm）,用Tris—HCL緩沖液洗脫，流速20ml/小時，收集第一峰，測定蛋白質(zhì)濃度，分裝保存。若對提純要求不高，可以省略此步。
11、 提純鞭毛素的質(zhì)量鑒定
（1） SDS—PAGE：在非降解和降解條件下于10%凝膠SDS——PAGE垂直板上電泳（KB—2301電泳儀），恒流，25Ma/板，10℃電泳5小時。
（2） 凝膠用三氯醋酸溶液固定過夜色。用考馬斯亮蘭G—250染色。
（3） 計算蛋白帶分子量：Ha 50000，Hb 53000，Hd46000。
12提純鞭毛素的等電點測定—IEF
（1） 取60ul樣品溶解在9M脲和1%2—巰基乙醇中。
（2） 上樣于含有2%Ampholin（PH3.5—9.5）（LKB Bromma，Sweden）和6M脲的4%聚丙烯酰胺凝膠（用22.2%聚丙烯酰胺和1.4% 雙甲丙叉烯酰胺原液配制）。
（3） 蛋白質(zhì)在LKB 1117—003多功能電泳儀上，恒流4mA待電聚焦至電壓250—300V。
（4） 電泳5小時后，用10%三氯醋酸固定凝膠，經(jīng)40%乙醇洗滌后，用0.1%考馬斯亮蘭G250染色過夜,再用14%醋酸脫色.
（5） 確定PH梯度凝膠，從陽極端切成0.5cm長度,分別裝入小試管內(nèi),加去離子水1小時后,用酸度計或PH試紙測PH值,劃出PH梯度斜線,并確定樣品的等電點.(Ha5.1,Hb5.1 Hd4.9)。
三、 粘附素抗原的制備
（一） K88、K99和K987p的制備
1、 將G—7或E68、C83907和UP001在37℃培養(yǎng)16—20小時。
2、 從克氏瓶中洗下，用0.1M PBS(PH7.0)懸浮。
3、 62℃水浴振蕩20分鐘使粘附素脫落。
4、 8000r/m20分鐘，其上清液用10%乙酸調(diào)PH至4.5，4℃放置過夜，使K88粘附素沉淀（等電點沉淀）。
5、 以8000r/m離心，將沉淀物用0.1M PBS溶解。
6、 經(jīng)Sephadex G200柱層析（2.6X80cm）純化，用0.01M PBS(PH7.0)作為平衡液及洗脫液,流速為1ml/分.
7、 收集第1峰,合并前半峰即為純化K88抗原.。
8、 測定蛋白質(zhì)濃度，小量分裝，—30℃保存?zhèn)溆谩?br /> （二） K99抗原的制備
1、 K994529在Minca培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)18小時。
2、 磷酸鹽尿素緩沖液洗下菌細胞。
3、 60℃加熱孵化20分鐘，離心后去菌體，上清加60%飽和硫銨，4℃攪拌2小時。
4、 離心收集沉淀，懸浮沉淀對上述緩沖液透析16小時。
5、 進一步經(jīng)Sephadex CL—4B柱層析純化，濃縮后再經(jīng)SephadexG—50脫鹽。
（三） 987P抗原的制備
1、 C88710 Slane培養(yǎng)基37℃20小時培養(yǎng)。
2、 生理鹽水洗下菌笞，離心收集菌體。
3、 菌泥中加入400ml含2M尿素0.01M PBS，60——63℃ 1—1.2小時。
4、 60%飽和度硫酸銨沉淀離心上清。
5、 離心后，沉淀物再過Sepharose 4B柱。
6、 收集第一峰前半峰，濃縮后經(jīng)Sephadex G50脫鹽。
（四） F48抗原的制備
1、 C95707、C85919和B41M分別接種Minca培養(yǎng)基上，37℃18小時。
2、 滅菌0.05M PH7.2 PB收集菌體。
3、 62℃水浴加熱處理1小時，并不時振動，離心去菌體。
4、 上清置4℃72小時，等電點4.6沉淀 法使粘附素沉淀 .
5、 離心后,將沉淀于Separose CL—4B純化，以含2M尿素0.05M PH7.2 PBS洗脫,洗脫液濃縮后再脫鹽。
附：各種粘附素等電點。
K88 4.2
K99 9.7
987P 3.7
F41 4.6
四、 全菌抗原的制備
1、 丙酮滅活菌制備參見前述。
2、 甲醛滅活全菌制備：以0.4—0。6%甲醛生理鹽水與新鮮肉湯培養(yǎng)物等體積混滅菌，經(jīng)PBS洗滌后，配成1—10X10（6）/ml，4℃保存?zhèn)溆?。
3、 熱滅活全菌制備：將鮮培養(yǎng)物以DW稀釋至10億/ml細菌，100℃水浴2小時，離心吸取上清（另一種抗菌原），菌泥進一步用PBS洗3次，保存?zhèn)溆?。
4、 酒精滅洗全菌制備。
五、 病毒抗原的制備
（一） 雞新城疫病毒提純—“層析法”
1、 雞紅細胞吸附釋放法。
雞紅細胞 吸附表面有一種糖蛋白受體，在4℃時，病毒被吸附到紅細胞 膜的受體上，但在37℃時病毒的N—乙酰神經(jīng)氨酶破壞受體的糖苷鍵后，病毒又可以從紅細胞 膜 上釋放。操作步驟如下：
（1） 感染病毒的雞胚囊液，在4℃下6000r/m，30分鐘，棄沉淀。
（2） 上清液根據(jù)病毒血凝滴度的高低，加入1—3%的新鮮洗滌的雞紅細胞，在4℃下吸附1—2小時。
（3） 3000r/m0分鐘，棄去上清。
（4） 吸附有病毒的紅細胞重懸浮于1X鈣鹽水中（含4%CaCL2的生理鹽水），在37℃下放置2—4小時。
（5） 3000r/m20分鐘取上清。
（6） 28000r/m小時，沉淀重懸于小容積的生理鹽水中，即為初步純化病毒。
2、 解脫后的病毒蛋白液再上Sepadex G—200柱，以PBS洗脫，收集第1峰。即為進一步純化的NDV。
（二） NDV純化—離心法
1、 NDV種毒以滅菌生理鹽水作1：100稀釋，再接9—11日齡SPF雞胚的絨毛尿囊腔內(nèi)（0.1—0.2ml/胚）。
2、 37℃孵化，每天照蛋兩次，收獲24—96小時死亡雞胚的澄清無菌之尿囊液，測血凝價，分裝—30℃保存?zhèn)溆谩?br /> 3、 尿囊液經(jīng)5000Xg 30分鐘。
4、 取上清102732Xg離心30分鐘。
5、 再取上清用20%蔗糖墊底，110000Xg離心2.5小時.
6、 取沉淀用少量PBS懸浮，經(jīng)10—60%蔗糖等到密度性梯度離心，91000Xg 16小時（BecKman，L7，SW28）。
7、 收集含病毒的蔗糖區(qū)帶。
8、 用PBS稀釋上清，110000Xg離心2.5小時。用小量PBS懸浮沉降病毒，小量分裝，—70℃保存?zhèn)溆谩?br /> （三） NDV HN NP F蛋白制備—SDS—PAGE。
附：聚乙二醇法濃縮病毒
在病毒懸液中加入一定量的PEG6000。在此條件下，病毒可隨其他大分子物質(zhì)發(fā)生沉淀。操作步驟如下：
（1） 收獲經(jīng)病毒感染的尿囊液，6000r/m30分鐘，棄沉淀。
（2） 上清液中加入7.5%的PEG 和0.1—00.4MnaCL，4℃下放置2—4小時。
（3） 6000r/m30分鐘，收集絮狀沉淀物，重懸于小容量的緩沖液內(nèi)。
六、 MDV羽囊瓊擴抗原制備，從略。
七、 IBDV瓊擴抗原制備，從略。
八、 轉(zhuǎn)鐵蛋白制備：利凡諾—低溫乙 醇分級沉淀法。
1000ml血漿
加與血漿等到體積的2.0%利凡諾（內(nèi)含1%Na2CO370ml），
邊加邊攪拌產(chǎn)生黃色粘性沉淀物（為白蛋白）
校正上清PH8.1—8.2，靜置3—4小時
（ 白蛋白沉淀）棄 收集上清液
加1%活性吸附利凡諾（20分鐘）
抽濾，得澄清濾液
移入—10℃冷凍
用1M Hac調(diào)PH7.0—7.2
加乙醇終濃度為25%（乙醇要用Hac調(diào)PH7.0—7.2）
校正PH7.0—7.2
—60—70℃放2小時
—4℃離心20分鐘（20000r/m）
（球蛋白沉淀）棄
上清冷至—8℃（調(diào)PH5.80+(-)0.05）
加乙醇至終濃度40%
調(diào)PH5.8+（—）0.05
—10℃放置沉淀過夜
—4℃離心，收微紅色沉淀（轉(zhuǎn)鐵蛋白）
沉淀溶于5—10倍無熱原水中（含0.9%NaCL）
分裝、凍干。
稱干粉重，用水溶解[Pr]至于10%。
用1%Na2CO3調(diào)至PH6.8+（—）0.2,測[Pr]為10%
將溶液在60℃水浴恒溫10小時
用除菌濾器過濾
分裝5ml/瓶。
注意事項：
1、 乙醇要滴加，防止局部變性。
2、 PH要準確控制。
3、 溫度控制要準確。
4、 防止鐵被鏊合劑“抓”走。
5、 產(chǎn)品應(yīng)與標準品用條件電泳鑒定。
第三節(jié) 抗血清的制備程序
一、 免疫原的配制
1、福氏不完全佐劑（Ferund’S adjuvant，imcomplete，F(xiàn)IA）100克石臘油與50克羊毛脂置于鹽水瓶中充分渦旋混勻，過濾除菌或高壓滅菌（10P15分鐘），置4℃
存放備用。（有市售產(chǎn)品，Sigma）
2、福氏完全佐劑（Ferund’S adjuvant ，compelete，F(xiàn)CA）取干粉卡介苗25—250mg
于100ml鹽水瓶中草藥，加10ml福氏不完全佐劑，于渦旋器上混勻30—60分鐘，再加40ml福氏不完全佐劑再混勻10—20分鐘，4℃存放備用。（有市售產(chǎn)品，Sigma）
3、免疫原的配制 取等體積的蛋白質(zhì)溶液與福氏完全佐劑或不完全佐劑分別置于二支潔凈滅菌試管中，用2—5ml注射器（配5號針頭）吸取約1/5V的抗原溶液，將針頭插入佐劑液面下，急速注入油層。置旋渦器上充分混合。用同樣的方法分4—5次將其余的抗原溶液與佐劑混合。再于渦旋器混勻30分鐘，然后再用注射器反復(fù)抽吸，配成油包水“顆?！?，靜置15分鐘后，觀察管底部有無水相析出，如有水相析出，則再用注射器將水相注入油層，并混合之。
制成的油包水乳劑在免疫動物之前需檢查其乳化效果，方法是：取一只燒杯裝滿水，滴數(shù)滴上述乳劑于水面，第一滴通常分散開而其他滴呈球狀。如也分散開則表明不是油包水乳劑。
3、 一些抗原，如全菌抗原、顆粒抗原等，可以不使用佐劑而直接免疫動物。
二、 動物的選擇
免疫動物的選擇應(yīng)考慮以下幾方面因素：
1、 動物房的條件及飼養(yǎng)管理水平。
2、 抗血清的需要量：1只小鼠僅能提供1.0—1.5ml血,而一只山羊能提供幾升。
3、 可能提供的抗原量：小鼠通常對50ug或小于50ug的抗原應(yīng)答良好，山羊可能需要幾mg。
4、 應(yīng)考慮提供抗原的動物與產(chǎn)生抗體的動物之間的種系關(guān)系。多數(shù)情況下，應(yīng)選用在種系上與抗原供者無關(guān)的動物來進行免疫。如高度分化的哺乳動物的蛋白抗原應(yīng)選用非哺乳動物（如雞）來生產(chǎn)抗血清。
5、 特別注意的是，如果所制備的抗體僅僅是用來檢測蛋白質(zhì)間的微細差異，如同種異型，則可用關(guān)系相近的甚至是同種動物來分離抗原和制備抗體。
6、 此外，還應(yīng)考慮所選動物的年齡大小、性別、個體差異等對抗血清生產(chǎn)的可能影響。因此免疫動物只數(shù)不宜僅是1只。
三、 免疫程序的選擇
（一） 山羊抗小鼠、兔、豬和雞Ig免疫血清的制備。
程序一：
1、 每只山羊于兩側(cè)肩前淋巴結(jié)各注射0.5毫升(共含蛋白質(zhì)量650—1000ug，混于FCA中，F(xiàn)CA—Ag)。
2、 1個月后，采血測效價，如瓊凝擴效價未達1：32，則用二倍劑量抗原（混于FIA中，F(xiàn)IA—Ag）于頸部肌肉注射以加強免疫。
3、 2周后再試血，如效價仍未達到1：32，則再加強免疫（同2），直至達到1：32以上。
4、 頸動脈放血致死，分離血清，分裝，—20℃保存。
成功范例：羊抗雞血清。
附：瓊脂擴散沉淀法測定血清效價。
（1） 1%瓊脂凝膠：用含0.065% NaN2、5Mmedta—Na2的0.01MPBS(PH7.4)配制1%瓊脂。
（2） 抗血清以0.01MPBS(PH7.4)作1：2—1：256稀釋后，加入周圍孔，每一稀釋度加二孔。中央孔加提取的抗原。
（3） 37℃濕盒內(nèi)過夜擴散，觀察結(jié)果。
程序二：
1、 每只山羊于足掌、足趾、后腿部皮下注射2mlFCA—Ag（共含蛋白質(zhì)量1.2mg）。
2、 二周后，二側(cè)腘淋巴結(jié)內(nèi)注射1mlFIA—Ag（蛋白質(zhì)量為0.6mg）。
3、 二周后，后腿部肌肉注射4ml FIA—Ag。
4 、二周后試血，判定標準同上。若達不到效價，繼續(xù)后腿部肌肉注射4mlFIA— Ag
直至達到1：32 以上。
5、頸動脈放血致死，分離血清，分裝之，—20℃
成功范例：羊抗兔血清（1：256）。
程序三：
1、 每只山羊背部皮內(nèi)多點注射6mlFCA—Ag（每點30—50ul，共含蛋白質(zhì)量600ug）。
2、 1個月后，頸部和后腿部肌肉注射4mlFIA—Ag（蛋白質(zhì)量用400ug）。
3、 二周后試血，若效價達不到，同2繼續(xù)加強免疫，直至效價達1：32以上。
4、 采血，貯存同前。
成功范例：羊抗BALB/C小鼠血清。
程序四：
1、 每只山羊頸部、腿部皮下注射4mlFCA—Ag（共含蛋白質(zhì)4mg）。
2、 二周后，頸部、腿部肌肉注射4mlFIA—Ag，二周后，同法加強免疫一次（6mlFIA—Ag）。
3、 二周后試血。若效價不夠，繼續(xù)加強免疫，直至效價達1：32以上。
4、 采血并分離血清，貯存同前。
成功范例：羊抗豬血清
（二） 兔抗血清的制備
程序一：
1、 每只家兔上內(nèi)多點注射50—200ug蛋白抗原（FCA—Ag）。
2、 1個月后，用提純抗原靜脈注射0.5mg蛋白抗原.
3、 2周后試血,效價不夠,可加強免疫一次.。
4、 于最后一次免疫2周后，心臟采血致死，分離血清，分裝—20℃凍存?zhèn)溆谩?br /> 成功范例：兔抗大腸埃希氏菌粘附素血清
程序二：
1、 第一次靜脈、腹腔各注射50mg/只差速離心粗提NDV抗原。
2、 第7天重復(fù)注射一次。
3、 第14天改為腹腔、肌肉注射器，劑量加倍。
4、 第21天肌肉注射100mg/只，四腳掌各10mg/只。
5、 末次注射后10天采血，分離血清。測HI滴度計算血凝抑制單位。
（三） 雞抗NDV血清制備
第一次用Lasota株雞胚尿囊液靜脈注射1ml/只，腹腔注射4ml/只，以的每隔5天重復(fù)注射二次（內(nèi)含1mlNDV強毒雞胚尿囊液），共三次，末次注射后第10天采血，測HI滴度。
（四） 小鼠抗血清抗原的制備
程序一：可溶性抗原的免疫程序
1、 以10—100ug抗原乳化在200ulFCA中（油包水），腹水注射3—12周齡BALB/C小鼠。
2、 4—6周后，以同樣劑量抗原乳化在FIA中，作1—2次追加免疫（i.p），間隔時間為2—3周。（可試血、采血）。
3、 以等量或加倍量抗原的PBS 溶液作最后一次免疫，2—4天后取脾細胞可作融合試驗用。
程序二：細胞性抗原的免疫程序
1、 細胞用PBS洗3—4次以除去血清成分。
2、 以10（7）細胞/只劑量腹腔注射BALB/C小鼠。
3、 3—8周后作追加免疫力。（可重復(fù)1—2次）。
4、 最后一次免疫2—4天取脾細胞供作融合。
程序三：短程免疫程序
1、 全菌抗原5X10（6）/只腹腔注射；（或用提純抗原40ng/只 i.p）。
2、2—3周后，腹腔注射提純抗原40ng/只（若每間隔2—3周用全菌抗原后提純抗原加強免疫5—6次，此乃“密集型”免疫程序）。
2、 3天的取脾細胞可供融合用。
（五） 體外免疫程序
Development of a serum—free medium for in vitre immune responses by using b—cyclodextrin
J Immunol Methods 1998:112:227—233
（六） IBDV血清生產(chǎn)（從略）
第十章 細菌學(xué)試驗中的幾個常用技術(shù)
第一節(jié) ；菌總數(shù)估測
一、 比濁法
1、 莫法蘭德濁度計的制備
按下述方法制備標準硫酸鋇懸液。
（1） 制備一份1%的C.P(化學(xué)純)硫酸溶液。
（2） 制備一份1%C.P氯化鋇溶液。
（3） 制備下述10個標準懸液：
加（1%氯化鋇溶液ml數(shù)）于（1%硫酸溶液ml數(shù)）
1 99
2 98
3 97
4 96
5 95
6 94
7 93
8 92
9 91
10 90
（4） 取各標準硫酸鋇沉淀的懸液3ml左右，封存在一支試管內(nèi)。試管必須仔細挑選，使其直徑、色澤和管型的厚度都一致。
2、 目測待檢樣品與幾號管濁度相近，并按下列關(guān)系，估計細菌濃度：
管號 細菌含量
1 3億
2 6億
3 9億
4 12億
…… ……
二、 常規(guī)平板計數(shù)法
1、 將待測均質(zhì)樣品制備10（-2）10（-3）10（-4）……等適度的十進制稀釋液，其方法系以無菌吸管吸取10ml原稀釋液，加于90.0ml稀釋液中（有時可采用1.0ml+9.0ml）混勻。注意：稀釋每個滴度的吸管都要更換，操作中防止出現(xiàn)泡沫。
2、 用吸管以每一個稀釋液內(nèi)吸取1.0ml，分別加入到有適當(dāng)標志的平皿（15mm X100mm）內(nèi)。注意：如果稀釋菌液靜置的時間超過3分鐘，則在吸取前，必須重新混勻。
3、 于每個平皿內(nèi)各加12-15ml標準法瓊脂（冷至44-46℃。瓊脂在45℃水浴中保溫備用）樣品的每一個稀釋系列做一個只加稀釋劑傾注瓊脂的對照平板。
4、 立即轉(zhuǎn)動或在一個平面上前后傾動平皿，使樣品稀釋液和瓊脂培養(yǎng)基充分混合均勻。
5、 待瓊脂凝固后，翻動平板，迅速防于35℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng) 48h+（-）2h。
6、 培養(yǎng)后，在適當(dāng)范圍的雙列平板用菌落計數(shù)器計數(shù)菌落數(shù)，記錄每一個稀釋度的平板計數(shù)結(jié)果。
7、 在三個稀釋倍數(shù)中，至少應(yīng)有一個稀釋倍數(shù)的兩個平板其菌落數(shù)在30—300個的范圍之內(nèi)。根據(jù)菌落數(shù)和稀釋度計數(shù)樣品中的需要平板數(shù)。
8、 所有從菌落數(shù)少于30個或多于300個的雙列平板計算而得的需氧平板計數(shù)數(shù)，都報告為估算數(shù)。
附：1、標準法瓊脂（平板計數(shù)瓊脂）
胰蛋白胨 5g
酵母浸膏 2.5g
葡萄糖 1g
DW 15g
PH7.0+(--)0.1 121℃15分鐘
2Butterfield氏緩沖液
基礎(chǔ)溶液：
磷酸二氫鉀 34g
D.W. 500ml
用1N氫氧化鈉將PH值調(diào)整至7.2，加蒸餾水至升。121℃高壓滅菌15分鐘，貯于冰箱。
稀釋的定量瓶裝（使用液）：
取上述基礎(chǔ)液1.25ml,加D.W.達1000ml,分裝于瓶內(nèi),每瓶99或99+(--)1ml。
121℃高壓滅菌15分鐘。
三、 直接顯微鏡檢查法（Official first action method，法定試行方法）。
1、 在油鏡下用顯微鏡測微尺測定每個視野的直徑d，則視野的面積為：
Af=（）（d/2）（）。
2、 每一平方厘米涂膜的視野數(shù)應(yīng)為
AF 1cm（）
——— =——————
Af Af[cm]（）
3、 每個涂膜含0.01ml樣品,則1.0ml樣品的視野數(shù)應(yīng)為：
AF
FF=100X————
Af
4、 每ml樣品中的菌數(shù)即為：
DMSCC（）/ml=[FF]X[每個視野的平均菌數(shù)]
（direct microscopic somatic cells count 直接顯微鏡菌體細胞計數(shù)）
5、 FF和檢查的視野數(shù)（至少10—60個）都為已知數(shù)，故可作為一個系數(shù)，稱視野工作系數(shù)（FWF）代入上式而得：
DMSCC/ml=[FWF]X計數(shù)的總細菌數(shù)
6、 菌液涂膜的制備：
（1） 吸0.01ml樣品,置于潔凈、干燥的載玻片上；
（2） 將菌液涂成1cm（）的涂膜；
（3） 將玻片放于35—40℃，至涂膜干燥；注意保持玻片的水平。
（4） 浸于二甲苯中1min，再浸于95%酒精中1min；
（5） North苯胺油亞甲藍染色劑中染色1—20min；
7、 漂洗玻片，鏡檢前在空氣中充分干燥。切忘用吸墨紙吸干。
附：North苯胺油—亞甲藍染色液
苯胺油（Aniline Oil） 3ml
酒精（95%） 10ml
鹽酸（濃） 1.5ml
亞甲藍(飽和溶液) 30ml
蒸餾水,加至 1000ml
將3ml苯胺油與10ml酒精相混合,在不停在攪拌下徐徐加入1.5ml鹽酸.。加30ml飽和亞甲基藍溶液，用水稀釋至100ml，過濾。
四、 分光光度計測定法
a、 波長選擇420nm，550nm，600nm。
b、 下列回歸方程為420nm條件下建立。
第一組
（1） 大腸桿菌
lgy（）=7.1370+2.7878X
(2)金黃色葡萄球菌：
lgy（）=7.4722+4.7259X
（3白色葡萄球菌：
lgy=6.9067+2.6950X
（5） 白色念珠菌：
lgy=5.9512+2.1948X
有效測定范圍在103___106ofe/ml
(摘自俞曉峰文章)
第二組
(1) 沙門細菌(S.pullorm)
未離心肉湯:lgy=7.3461+7.5306X
離心菌懸液:lgy=7.3112+7.7191X
(2) 大腸桿菌:
未離心肉湯:lgy=7.4197+1.2113X
離心菌懸液:lgy=7.3764+5.8632X
五、最近似數(shù)（MPN）（the most probable numbers）是一個代表作用物中活菌濃度的估計數(shù)。這個數(shù)是應(yīng)用機率的原理測定作用物（樣品）中細菌的總濃度而推知的。請參閱有關(guān)文獻。
第二節(jié) 幾種常用細菌培養(yǎng)基的配方
一、Minca Med 1000ml（Minca—Isoritalex）
KH2PO4 1.36g
NA2HPO4.12H2O 25.3g(NA2PO4.12H2O 10.1g)
Casamino acids 1g (Difco)
Trace salts solution’ 1ml’
agar(Difco) 12g
PH7.5 10P.10分鐘消毒
(Isoritalex(BBL):1 ampoule)
*Trace salts solution(100ml)
MgSO4.7H2O 10g
MnCl2.4H2O 1g
FeCl3.6H2O 0.135g
CaCl2.2H2O 0.4g
100℃滅菌。
二、SLANETS MEDIUM
Bacto tryptose 20g glucose 1g
NaCl 9g bacto agar 18g
A．D．W 1000ml
四、 BBL培養(yǎng)基
（1）大豆胨 10g
Trypton or Bacto—pepton
orpretose—pepton 10g
NaCl 4g
KH2PO4 1g
牛肉湯 1000ML
agar 20—30g
PH7.6 15磅 15分鐘滅菌
或（2）Trypton or Bacto—pepton 10g
NaCl 3g
NaH2PO4 2g
兔湯 500ml
牛肉湯 500ml
agar 20g
PH7.6 15P15’
或(3) 酪蛋白水解物 20g
大豆胨 10g
NaCl 3g
NaH2PO4 2g
PH7.6 15P 15’
四、TEM Med
Lab__Lemco 5g
bacto__tryptose(Difco) 10g
NaCl 3g
Na2HPO4.12H2O 2g
glucose 0.5g
yeast extract(Difco) 5g
*Trace element solution 5.0ml
PH7.3
bacto agar(Difco) 25g
A.D.W 1000ml
120℃ 15’
*Trece ekement salt
FeSO4.7H2O 0.5g
ZnSO4.7H2O 0.5g
MgSO4.3H2O 0.5g
1N H2SO4 20ml
A.D.W 1000ml
五、 M肉湯
1、Trypticase soy Broth
Trypticase 17.0g
phytone 3.0g
Glucose 2.5g
15p.s.i for 15min
Dipotassium phosphate 5.0g
D.W 1000ml
PH7.3
2、Tryptone Broth
Trytone 10.0g
D.W. 1000ml
3、M broth
an equal mixture of(1) and (2)
六、 其它各類培養(yǎng)基參見有關(guān)書籍。
第三節(jié) 常見細菌的分離鑒定
按常規(guī)程序進行各類細菌分離鑒定，請參閱有關(guān)書籍。這里僅以腸桿菌科沙門細菌的分離鑒定為例簡要概述，下面是該菌的分離鑒定的流程圖：
被檢材料
內(nèi)臟組織上 糞便、腸內(nèi)容物理學(xué) 各類食品、飼料等
前增菌
增菌培養(yǎng)（24—48小時）
選擇性增菌
鑒別培養(yǎng)基（24h）
三糖鐵瓊脂（24h）
幾次常規(guī)生化 尿素酶 多價抗O血清
試驗鑒定 測定 試驗
ELESA試驗、
結(jié)果判定 FA試驗、噬菌體系統(tǒng)
DNA雜交試驗等
動物試驗 O單因子血清測定 鑒別生化試驗
H血清鑒定
結(jié)果判定
第十一章 細胞免疫學(xué)試驗程序
第一節(jié) 玫瑰花環(huán)試驗（E—ROSETTES ASSAY）
一、總E花環(huán)（ERYTHOCYTE TOTAL ROSETTE，Et），或稱晚期玫瑰花環(huán)，淋巴細胞+SRBC等，37℃，低速離心——4℃ 2小時——檢測。
E的百分率（花環(huán)形成的細胞X100/總計細胞數(shù)）和絕對數(shù)可代表被檢標本中全部T淋巴細胞的百分數(shù)和總數(shù)。E是目前鑒定和計算外周血液和各種淋巴樣組織中T細胞的最常用方法之一。
二、活性E花環(huán)（ERYTHOCYTE ACTIVE ROSETTE， Ea），或稱早期玫瑰花環(huán)。淋巴細胞+SRBC或其它動物紅細胞——低速離心沉淀——檢測。
Ea與T細胞的體內(nèi)外功能活性密切相關(guān)，能更敏感地反映機體細胞免疫的水平和動態(tài)變化，是目前檢測細胞免疫水平最為簡便快速的方法之一。
三、 操作步驟
1、 靜脈采血，以肝素作為抗凝劑，每毫升血含20UL或0.2mg；若為以EDTA—Na2作抗凝劑1—2mg/ml血。一般認為EDTA—NA2比肝素好，因為T淋巴細胞、RBC、肝素均帶負電，有相互排斥。
2、 淋巴細胞的分離 淋巴細胞比重在1.077___1.080之間,紅細胞和粒細胞比重為1.092。配制1.077___1.080高分子液進行密度梯度離心,高分子溶液的主要成分是蔗糖,商品名為FICOLL
取抗凝血1.0ml,加等量HANK’S液(無鈣鎂,PH7.4)稀釋后,用毛細吸管沿管壁緩慢加入裝有淋巴細胞分層液的試管內(nèi),使血凝重疊于分層液上,用水平離心機以2000R/M30分鐘離心。此時紅細胞沉降至最下層，上層為血漿，中層為分層液，血漿與分層液的界面有一白色挾帶為淋巴細胞和單核細胞。
以毛細吸管吸取界面處的淋巴細胞與單核細胞，置于離心管中，用HANKS液以1000r/m10分鐘洗2次，以HANKS液配成107個細胞/ml的細胞懸液。
3、1%RBC懸液的制備 取阿氏液保存的血液，以HANKS液洗3次，2000r/m10分鐘離心后，將壓積紅細胞用HANKS液配成1%懸液，含紅細胞數(shù)約108/ml。
6、 Ea花環(huán)0.3ml淋巴細胞懸液+1%RBC 0.3+0.1ml滅活小牛血清___混勻___37℃25分鐘___1500r/m5分鐘___此培養(yǎng)物即可作涂片或滴片觀察.
5、E1花環(huán):上述培養(yǎng)物中再加入0.8%戍二醛1滴,輕輕搖勻混合,置4℃凍箱中作用2小時(或過夜)。取出后，輕輕旋轉(zhuǎn)試管，使沉淀的細胞重新懸浮，用毛細管輕輕混勻。
7、 制片鏡檢
（1）濕片 取上述培養(yǎng)物一滴加于事先鋪有瑞氏染液的玻片上，覆以蓋玻片，在高倍鏡或相差鏡下觀察。凡吸附4個或更多RBC的單核細胞為RE花環(huán)形成細胞，共計數(shù)200個細胞，算出百分率。
（2）干片 取培養(yǎng)物1滴于載玻片上涂片、干燥，滴加甲醇固定5分鐘，用PH6.4PBS沖洗,取I液染4分鐘,沖洗,再加II液染色4分鐘,沖洗,待干,鏡檢。紅細胞染成紅色，淋巴細胞染成藍色。
附1 染液配方
I液 瑞氏粉0.1g,甲醇60ml,研碎混勻.
II液 姬姆氏粉0.5g,純甘油33ml,甲醇33ml,先將姬姆氏粉溶于甘油中,并置60℃溫箱中,最后加甲醇即可.
使用時,分加將I液和II液用PH6.4PBS稀釋一倍.
附2 試驗條件選擇
1、 人、豬、牛、羊淋巴細胞——SRBC：
2、 馬、犬淋巴細胞—豚鼠RBC：
3、 豚鼠淋巴細胞——家兔RBC：
4、 RBC：LC=50—100：1
5、 染液亦可用0.2%美蘭, Giemsa ___Wright氏液.
第二節(jié) 淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗
（LYMPHOCYTE TRANSFORMATION TEST）
淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗是體外檢測淋巴細胞功能的一種方法。Tc與特異性抗原或非特異促分裂因子在體外共同培養(yǎng)時，細胞代謝和形態(tài)發(fā)生一系列的變化，代謝旺盛、蛋白質(zhì)和核酸的合成增加，細胞體積變大，轉(zhuǎn)化為能分裂的淋巴母細胞。轉(zhuǎn)化率的高低反映機體的免疫功能狀態(tài)，這種方法為淋巴轉(zhuǎn)化試驗。
一、試劑配制：
1、 DMEM+10%FCS
2、肝素2000U/ml
（4萬單位溶于20mlPBS，過濾除菌；使用時0.1ml肝素+10ml血）
3 無Ca++、Mg++，PBS，滅菌
4、0.2%臺盼藍
5、PHA80ug/ml
0.8mgPHA+無菌10mlDMEM+10%FCS中;
6、H—THYMIDINE
1mCi/ml的液體0.5ml___溶于50mlDMEM+FCS液中,終濃度為1uci/100ul.
7、消化液20ml
濃甲酸 15ml
H2O2（30%） 5ml
8、液閃液（所有器皿需烘干）
PPO 5g
POPOP 2.5g
溶于200ml無水乙醇+800ml甲苯,搖勻;
9、MTT
二、外周血淋巴細胞PBM制備
1、 10ml肝素抗凝血；
2、 50g，4℃10—15min；
3、 收集上層液體；
4、 用DMEM+10%BFS洗一次；
400g 4℃ 10min；
5、 吸棄上清，加5mlDMEM+10%BFS；
6、 活細胞計數(shù)（方法見前）
調(diào)整細胞濃度至2X107/ml
三、同位素法測定轉(zhuǎn)化后的細胞活性
1、按下列方式分別加入淋巴細胞懸液和PHA：
1 2 3 4 5 6
A
B
C
D
(1) 淋巴細胞濃度2X107/ml，每孔加入0.5ml,終濃度為1X107/ml;
(2) PHA濃度80 40 20 10 5 0ug/ml,每孔加入0.5ml,終濃度為40 20 10 5 2.5 0;
2、 37度CO2箱內(nèi)培養(yǎng)56h;
3、 A、B兩排每孔加1uci、’H-thymidine;
4、 繼續(xù)培養(yǎng)16小時;
5、 收集A、B、C排細胞于離心管內(nèi)；
6、 400g10min，棄上清；
7、 A、B排細胞沉淀用PBS洗一次，400g×10min；
8、 放射性測定；
（1）A、B離心館開蓋80度烘干，2-3小時；
（2） 每管內(nèi)加消化液200ul；
（3） 蓋好，90度水浴1小時；
（4） 每管取100ul置液閃瓶內(nèi)；
（5） 每瓶加4ul閃爍液
（6） 液閃儀測定
刺激指數(shù)SI= 加PHA管的CPM均值
——————————————
對照管CPM均值
四、形態(tài)學(xué)方法：
1、 C排管內(nèi)細胞沉淀物涂片
2、 GIEMSA——WRIGTH染色
3、 鏡檢
200個LC,計算轉(zhuǎn)化率
轉(zhuǎn)化率（%）=轉(zhuǎn)化LC/淋巴細胞總數(shù)
五、 MTT法
MTT法是一種四甲基偶氮唑鹽[3—（4.5- dimethyl__thlazd-2-yl）-2.5-diphenyl-terrazolium bromide]淡黃色，易溶液于水，MTT經(jīng)活細胞線粒體中的脫氫酶作用后可氧化成藍色結(jié)晶甲襸，甲襸經(jīng)異丙醇作用后溶解顯色，此法簡易，準確且無同位素污染，以此法代替H’—TDR摻入法可進行細胞代謝活性及增殖反應(yīng)的測定。
1、 不同處理的細胞加入96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100ul，37℃6%CO2培養(yǎng)。
2、 培養(yǎng)結(jié)束前4小時加入100ul/孔MTT試劑。
3、 培養(yǎng)結(jié)束后，取出培養(yǎng)板，4℃下1500r/m離心7分鐘，甩去上清。
4、 立即加入10%鹽酸一異丙醇，100ul/孔，充分吹吸混勻。
5、 于DG一3022型酶聯(lián)免疫儀上測定OD570nm、OD650nm，求出OD550值。
第十二章 動物實驗的一般規(guī)則
一、 依據(jù)實驗?zāi)康囊螅绮《綥D50、LD100、ID50等、細菌毒力測定、免疫效力試驗、免疫血清制備等，選擇不同種類、品系及不同飼養(yǎng)管理條件下的實驗動物式實驗用動物。常用的實驗（用）動物包括小白鼠、大白鼠、豚鼠、綿羊、山羊、小香豬、他豬八戒、家兔、雞、鴨、鵝等十幾種。其中部分動物又有自然繁殖、近交系等、SPF與非SPF等區(qū)分。
二、依據(jù)動物騍病原體的敏感性或騍接種物的應(yīng)答性不同，確定選用動物的年齡、性別，特別是使用動物的數(shù)量。
四、 不同實驗研究類型所要求的動物數(shù)量不相同，現(xiàn)簡述如下：
（一） 現(xiàn)況研究（Cross-sectional study）的一般樣本大小可用下列公式計算：
S．E．=PQ/N
S．E．=標準誤，P=某病的現(xiàn)患率或感染率，Q=1-P，N為樣本大小。根據(jù)上述公式，可得到下列簡便公式。
1、 若容許誤差d=0.10P,95%可信水平t=2樣本的感染率P與總體感染P之間有差異d。P-p=+（-）d=+（-）txS.E,S.E.=d/t.0.05水平,自由度為無限大時,t值約為2.
P.Q P.Q t（2）PQ
N=———— =—————— =——————
(S.E.)（2） (d/t)（2） d（2）
令d=0.1P
2（）PQ 4PQ Q
N=———————— =———————— =400X——
（0.1P）() 0.02P() P
2、 若容許誤差d=0.15P,則
Q
N=178X——
P
3、 若容許誤差d=0.20P,則
N=100XQ/P
4、 抽樣調(diào)查腫瘤或其它發(fā)病率很低的疾病時，樣本大小可參考Poisson分布期望可信限表。
（二） 病例對照研究（case-control study），又稱回顧性研究（retrospective studies），研究樣本大小可按下列分式計算。
N=————————————
Ka與Kb分別為a與b時正態(tài)分位數(shù)?？梢躁牨碇胁榈?。
P1和P2分別為估計 對照組與病例組有暴露史的比例。
Q1=1-P1， Q2=1-P2
P=（P1+P2）/2，Q=1-P
另，病例的暴露史可用下列公式估計：
P2=（ORXP1）/（1-P1+ORXP1）
OR為比值比。
附表 正態(tài)分布的分位數(shù)表
KA（ 單側(cè)檢驗）
KC（單側(cè)和雙側(cè)檢驗） Kb（雙側(cè)檢驗）
3.090
2.878
2.576
2.326
2.058
1.960
1.645
1.282 3.290
3.090
2.807
2.576
2.326
2.242
1.960
1.645
（三） 隊列研究（cohort study）,又稱前瞻性研究(prospective studies).研究樣本大小可用下列公式計算：
但這里P1為暴露組的發(fā)病率，P0為非暴露組的發(fā)病率。
Q1=1-P0 ， Q0=1-P0
P=（P0+P1）/2， Q=1-P
如已知P0與估計某相對危險度（R），則
P1=RP0
（四） 實驗研究
1、 對于發(fā)病率在5%以上的疾病作實驗研究時，兩組需要的動物數(shù)（N1及N2）可用下列公式計算：
可信限為95%。T值為1.96按2計算。式中P1為對照組的預(yù)期發(fā)病率，q1=1-p1;p2為實驗組的預(yù)期發(fā)病率， q2=1-p2;N1為對照組需要的觀察數(shù)。
設(shè)N1=N2，上式中僅N為未知，將p、q值分別代入公式即可得N值。
2、 對于發(fā)病率在5%以下，尤其是在1%以下的低發(fā)病率疾病的調(diào)查研究時，常采用泊松分布來推導(dǎo)樣本數(shù)。
四、試驗動物數(shù)的多少，除用上述公式計算和查表外，還應(yīng)考慮以下幾個因素：
1、 疾病的罹患率高低。
2、 實驗措施有效率的高低。
3、 要求實驗精確度的高低。
4、 要求實驗組和對照組差異顯著性的程度。
5、 兩組的均衡性即齊同必的好壞。
6、 實驗分組越多，則樣本世紀數(shù)就需要增長率大。
五、 實驗動物的分組必須考慮各組中動物的齊同性、隨機性、重復(fù)性等，盡量減少實驗田的偏差。實驗動物的隨機性分組方法詳細參閱有關(guān)書籍，常見方法有完全隨機設(shè)計、配對設(shè)計、隨機單位組設(shè)計和拉丁方法設(shè)計和正交設(shè)計等。
六、 實驗中必須設(shè)立嚴格合理的對照。通過對照組可取得研究指標的數(shù)據(jù)差異、清除被試因素以外的其它因素對結(jié)果的影響等。
七、 使用實驗動物務(wù)必記住節(jié)約二字，需要什么樣的動物園就使用什么樣的動物園，不要越級使用。在周密的設(shè)計和論證的基礎(chǔ)上，再提出實驗田動物的訂購計劃。
八、 正式實驗之前的充分準備工作可以起到事半功倍的效果，通常預(yù)試期可以達到下列目的：
1、 使試驗動物園習(xí)慣于試驗期的環(huán)境條件。
2、 做好試驗動物的長勢、驅(qū)蟲、防疫注射等項準備工作以及對它們的健康觀察。
3、 訓(xùn)練試驗人員，熟練掌握操作規(guī)程。
4、 考核試驗設(shè)計是否恰當(dāng)和切實可行，發(fā)現(xiàn)部題及時糾正。
5、 通過預(yù)試期得到統(tǒng)計數(shù)據(jù)，對試驗動物進一步審查、調(diào)整。一般要求預(yù)試期試驗動物園頭數(shù)應(yīng)多于正式試驗的頭數(shù)；預(yù)試期的長短可因試驗要求而定，一般為15——20天。
九、 實驗結(jié)果必須進行統(tǒng)計分析。
十、 幾個使用動物園進行實驗的范例
1、 Z4+HVT二價活苗的實驗室免疫效力試驗；
2、 Z4保護力及其致瘤性測定；
3、 應(yīng)用粘附素單抗治療仔豬下痢的研究；
4、 免疫血清的制備；
5、 病毒常規(guī)毒力指標測定（包括使用雞鴨鵝胚）；
6、 細菌毒力測定等。
第十三章 電泳技術(shù)、層析技術(shù)
有關(guān)電泳技術(shù)、層析技術(shù)已分別在前面各章節(jié)中討論，這里不再單獨贅述。對于剛開始實驗工作的人員請詳細參閱：
1、 Mononlonal Antibodies：Principle and Practice James W.Goding
2、 生化實驗技術(shù)與原理
隋德新
單克隆抗體:原理、方法及應(yīng)用
劉秀梵
第四部分 家畜傳染病學(xué)實驗指導(dǎo)
目錄
家蓄傳染病學(xué)實驗規(guī)則
附 學(xué)生實驗守則
家蓄傳染病實驗報告內(nèi)容
實驗一 碳疽的診斷
實驗二 巴氏桿菌病的診斷
實驗三 結(jié)核桿菌病和布氏桿菌病的檢疫
實驗四 豬瘟的診斷
實驗五 雞新城疫的診斷
Ⅰ、雞新城疫病毒的雞胚分離
Ⅱ、免疫熒光實驗
Ⅲ、HA和HI試驗
實驗六 雞馬立克氏病的瓊擴診斷
實驗七 沙門氏菌快速檢驗試驗
實驗八 雞白痢的檢疫
家蓄傳染病學(xué)實驗規(guī)則
1、 實驗前必須穿好工作服，實驗后必須認真洗手后方可離開實驗室。
2、 實驗室禁止飲食、吸煙，勿以手指、器械等與面部接觸，以防感染 。
3、 操作時務(wù)須聚精會神，嚴肅認真，不得顧盼言他。
4、 污染的器皿及廢棄病料、污水等均應(yīng)嚴格按規(guī)定處理。
5、 菌種、毒種不得擅自帶出實驗室。
6、 愛惜實驗器械，若有損壞應(yīng)主動登記、報告。
7、 保持實驗室安靜、整潔。
8、 實驗后，必須關(guān)好水電，清洗整理好本小組物品。
9、 每次實驗完畢，值日生應(yīng)認真預(yù)習(xí)，熟悉實驗內(nèi)容，實驗完畢應(yīng)以科學(xué)態(tài)度寫出實驗報告。
附一 學(xué)生實驗手則
1、 實驗前應(yīng)認真預(yù)習(xí)，經(jīng)教師質(zhì)疑不合格者不得進行實驗。
2、 服從教師指導(dǎo)，按規(guī)定和步驟進行實驗，認真地觀察和分析實驗對象，如實地記錄實驗數(shù)據(jù)，不得抄襲他人實驗結(jié)果。
3、 要注意安全，愛護實驗用具和設(shè)備，節(jié)約水、電、氣和實驗材料等。
4、 進入實驗室或?qū)嶒瀳龅?，必須衣著整齊，保持安靜，嚴禁談笑喧嘩、抽煙、隨地吐痰，更不得動用與本實驗無關(guān)的其他儀器設(shè)備或教學(xué)標本等。
5、 認真作好實驗報告，凡不合格要求者，均須重做。
6、 實驗完成后，主動整理好實驗用具，關(guān)好水、電、氣流，搞好清潔衛(wèi)生。
7、 凡違反實驗規(guī)程或擅自動用其它實驗用具、設(shè)備而導(dǎo)致?lián)p失者，必須寫出書面檢查，并按要求賠償損失，情節(jié)嚴重者給予紀律處分。
家蓄傳染病實驗報告內(nèi)容
1、 送檢病例情況簡述。
2、 診斷程序和結(jié)果。
3、 診斷意見。
4、 分析和討論實驗結(jié)果。
5、 實驗診斷注意事項。
實驗一 炭疽的診斷
一、 目的
掌握炭疽的實驗室診斷步驟和方法；
學(xué)習(xí)和復(fù)習(xí)實驗室的基本操作方法；
二、 實驗器材
試管架鐵絲簍酒精燈酒精棉球碘酒棉球剪刀鑷子解剖臺紗布搪瓷盆解剖刀鉑金耳消毒試管載玻片擦鏡紙鏡油染色缸吸水紙滴管平皿離心機天平玻璃鉛筆
10%甲醛溶液美蘭染色液瑞氏染色液革蘭氏染色液普通瓊脂平板血瓊脂平板肉湯培養(yǎng)基毛細滴管滴頭炭沉管紙盒炭疽沉淀血清1%新潔爾滅消毒液0.2%升汞消毒液新鮮移植菌種斜面純培養(yǎng)小白鼠
三、 實驗動物的準備
實驗前一周著手準備，在嚴格隔離條件下進行，將炭疽桿菌菌種移植到一支肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12-18小時，用此幼齡培養(yǎng)物，小白鼠皮下或腹腔注射0.1-0. 2ml/只，小白鼠在注射后2-3天死亡，死鼠冷藏供實驗用。
實驗前一天，分別移植炭疽桿菌和枯草桿菌到血斜面上進行培養(yǎng)，供實驗時做對照用。
四、 實驗步驟
1、 無菌操作解剖小白鼠，從小白鼠脾臟或肝臟作細菌分離培養(yǎng)于普通平板、血平板和肉湯培養(yǎng)基中。
2、 取脾、肝或血液在載玻片上作觸片或涂片。
3、 用炭疽桿菌純培養(yǎng)物和枯草桿菌純培養(yǎng)物在另一塊載玻片上作涂片。
4、 待步驟2、3中的觸片和涂片自然干燥，火焰固定，在5-10%甲醛溶液中浸泡10-15分鐘，滅活細菌，置玻片架上晾干。
5、 組織觸片用美蘭染色，純培養(yǎng)物用革蘭氏染色，鏡檢，觀察細菌形態(tài)。
6、 Ascolis反應(yīng)
取脾臟、肝臟數(shù)克剪成小塊，置消毒試管中，加3-5倍量生理鹽水，隔水煮沸30分鐘，2000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，吸取脂肪層下的溶液與炭疽沉淀血清作Ascolis反應(yīng)。
示教實驗 串珠試管
五、 思考題
1、 炭疽桿菌的形態(tài)特征和培養(yǎng)特征主要有哪些？與枯草桿菌有什么區(qū)別？
2、 Ascolis反應(yīng)的原理是什么？它在炭疽診斷中是否可靠？為什么？
3、 炭疽桿菌在什么情況下能形成串珠現(xiàn)象？
4、 肉聯(lián)廠發(fā)生了疑似炭疽，應(yīng)如何盡快進行診斷和處理？
實驗二 巴氏桿菌病的診斷
一、 目的
觀察雞巴氏桿菌病的臨床表現(xiàn)和病理變化；
掌握巴氏桿菌病的實驗室診斷方法。
二、 實驗器材
美蘭染色液 瑞氏染色液
載玻片 染色缸 吸水紙 顯微鏡 鏡油 擦鏡紙
試管架 鉑金耳 酒精燈 鑷子 剪刀 生理鹽水
肉湯培養(yǎng)基 血平板 酒精棉球 0.1%新潔爾滅消毒液
送檢雞
三、 實驗動物的準備
１、 移植雞巴氏桿菌強毒株于一支血斜面和一支肉湯培養(yǎng)基上，３７℃培養(yǎng)２４小時。
２、 用生理鹽水洗下血斜面上的巴氏桿菌菌落，制成菌懸液，?。玻埃恚熳⑸溆谛“资蟾骨唬“资笤冢玻矗矗感r內(nèi)死亡。
３、 無菌操作解剖死鼠，去死鼠肝臟觸片，染色，鏡檢，若確為巴氏桿菌致死，則取出肝脾于玻璃磨碎器中，加入５－１０倍量的肉湯培養(yǎng)基或生理鹽水，磨碎，制成組織懸液，取該懸液0.3-0.4ml注射健康雞,肌注，通常雞在注射后24小時死亡，死雞供實驗用。
四、 實驗步驟
１、 解剖雞。無菌操作，自肝臟作細菌分離于血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)16-24小時，觀察培養(yǎng)結(jié)果。
２、 取肝、心血制觸片或涂片數(shù)張，美蘭和瑞氏染色，鏡檢，觀察細菌形態(tài)。
３、 仔細觀察死亡雞病變（肌肉、皮下、肝、心包、心冠脂肪、肺、漿膜、粘膜等臟器組織病變），并做記錄。
４、 示教組織中的巴氏桿菌。
五、 思考題
１、 巴氏桿菌的菌落和培養(yǎng)特性是什么？
２、 為什么巴氏桿菌成兩極染色？
３、 什么是巴氏桿菌的熒光現(xiàn)象？與致病菌性有無關(guān)系？
４、 巴氏桿菌能致多種動物的疾病,其主要特點是什麼?
５、 從病豬臟器分離到巴氏桿菌,,是否就可以確診為巴士桿菌病?為什么?
６、 研制巴士桿菌疫苗要注意什么問題?
實驗三 結(jié)核桿菌病和布氏桿菌病的檢疫
一， 目的
掌握結(jié)核桿菌病的變態(tài)反應(yīng)診斷方法;
掌握布氏桿菌病的血清學(xué)診斷方法..
二,實驗器材
消毒盒 剪毛剪 鑷子 游標卡尺 紗布 變態(tài)反應(yīng)用金屬注射器和針頭 結(jié)核菌素 記錄表 酒精棉球 搪瓷盤 獸用16號針頭貼有標簽的無菌5ml試管 膠鞋
試管架 干凈試管 干凈吸管(1ml或5ml)100ml三角燒瓶 0.05%石炭酸生理鹽水 布氏桿菌陽性診斷血清 布氏桿菌試管凝集試驗用抗原 被檢牛血清 振蕩器 布氏桿菌陰性診斷血清
三,實驗步驟
(一) 第一次實驗（地址：牛場）
內(nèi)容:變態(tài)反應(yīng)皮內(nèi)試驗和采血
1,將牛固定好.
2,在成牛頸側(cè)中部上1/3處剪毛,直徑為10cm
3,用游標卡尺測量術(shù)部中央皮皺厚度并作好記錄
4,術(shù)部用酒精棉球消毒
5,向術(shù)部中央注射0.2ml結(jié)核菌素,注射時應(yīng)同時向前和向皮膚內(nèi)用力,將針頭斜向刺進皮內(nèi),并應(yīng)立即用左手固定針頭,或手慢慢將結(jié)核菌素注射進皮內(nèi)。抽出針頭后,用手指檢查注射部位是否有突起的硬塊,若無硬塊必須重新注射。
6,尋找頸靜脈.
7,在頸靜脈處剪毛，術(shù)部用酒精棉球消毒.
8,左手按住頸靜脈的術(shù)部向心端,右手將16號針頭垂直或沿頸靜脈走向斜向刺入頸靜脈,調(diào)整針頭插入深度使靜脈血從針頭流出,立即用消毒試管收集流出的血液，在采血的過程中，左手始終要按緊頸靜脈的術(shù)部向心端,扎針時要看清突起的血管，果斷用力，力求一針見血.
9,每頭牛采3-5ml血液，送開左手后,右手拔出針頭,用酒精棉球消毒術(shù)部，在收集血液的試管上標記上相應(yīng)的牛號.將采有血液的試管斜放，待凝固后，帶回實驗室分離血清，以便進行布氏桿菌凝集實驗.
結(jié)核菌素點眼試驗(操作示范)
(1) 保定牛。
(2) 仔細檢查牛眼睛，發(fā)炎者不能做點眼試驗.
(3) 用左手拇指和食指將牛眼的上、下眼瞼分別向上、下翻張使眼結(jié)膜囊暴露，右手用1%硼酸棉球擦去眼周圍活物.
(4) 右手用滴管將結(jié)核菌素-5滴滴入眼結(jié)膜內(nèi)，滴管頭不要接觸眼結(jié)膜。
(二) 第二次實驗（地址：牛場）
1 ，變態(tài)反應(yīng)皮內(nèi)實驗。必須在第一次注射結(jié)核菌素后，分別在７２小時和第１２０小時觀察注射局部的反應(yīng)情況。主要是觀察有無炎癥反應(yīng),并測量皮皺厚度和腫脹面積的大小，據(jù)此判定試驗結(jié)果，對第72小時觀察，反應(yīng)呈陰性或可疑的牛只須立即在第一次注射的同一部位，以同一劑量進行第二次注射，劑量同第一次。第二次注射后48小時(即第一次注射后第120小時)應(yīng)在觀察一次.觀察情況均有詳細記錄。
變態(tài)反應(yīng)點眼實驗 應(yīng)于點眼后3,6,9小時各觀察一次,并作好記錄，必要時可觀察第24小時的反應(yīng),觀察時可作翻眼檢查
（三）分離血清步驟
１、 將試管中凝固的的血清檢樣，2000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘。
２、 將血凝塊上的血清用滴管吸至另一空的消毒試管中，然后將原試管上的牛號標簽貼至血清的試管上。
３、 如果離心后仍無血清析出，可用干凈鐵絲插入管底，沿管壁移動鐵絲使血凝塊與試管分離，再離心，并重得步驟2。
４、 血清置4℃冰箱保存，72小時內(nèi)作布氏桿菌試管凝集試驗。
（四）布氏桿菌試管凝集試驗
１、 操作方法表解如下：
試管號 1 2 3 4 5 6 7
稀釋倍數(shù) 1：25 1：50 1：100 1：200 1：400 陽性對照 陰性對照
試
液
0.5%石炭酸生理鹽水 2.4
0.1
0.5 0.5
0.5 0.5
0.5 0.5
0.5 布氏桿菌陽性診斷血清(1:100)
0.5ml
棄0.5ml 布氏桿菌陰性診斷血清(1:100).
0.5ml
布氏桿菌診斷Ag(1:20) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
充分振蕩,混勻,37℃溫箱24小時,觀察結(jié)果
２、 比濁管制備
3.5%石炭酸生理鹽水
布氏桿菌診斷Ag液(1:10)
清朗度
標記
1.0
0.75
0.5
0.25
0.0
0.6
0.25
0.5
0.75
1.0 100%
75%
50%
25&
0.0% ++++
+++
++
+
-
３、 判定結(jié)果并記錄
四、思考題
１、 本試驗中，如何觀察結(jié)果？確定為結(jié)核桿菌或布氏桿菌病陽性、可疑的標準各是什么？對陽性或可疑牛應(yīng)如何處理？
２、 犢牛變態(tài)反應(yīng)皮內(nèi)法的試驗部位是什么？注射劑量是多少？羊布氏桿菌凝集試驗用什么稀釋度？
３、 家畜布氏桿菌的診斷方法有哪幾種？其優(yōu)點各是什么？
４、 在進行牛結(jié)核病菌 變態(tài)反應(yīng)診斷時，什么情況下春用皮內(nèi)法？在什么情況下需同時用皮內(nèi)和點眼兩種方法？為什么？
實驗四 豬瘟的診斷
I免疫酶組化法
一、 目的
了解免疫酶組化法的一般程序和酶標記技術(shù)：
掌握用免疫酶組化法診斷豬瘟的方法。
實驗器材
剪子、鑷子、100ml染色缸。載玻片、玻片ml試管、滴頭、1ml吸管、脫脂棉、吸水紙、擦鏡紙、顯微鏡、橡皮膏、酒精燈、鉑耳、1000ml燒杯、銅藍、攪拌器、磁捧、酒精棉球
500ml量筒、500ml三角燒瓶、大濾斗。
酶標抗體、PH7.2 0.015M PBS、1%NaN2、1%H2O2、Tris_HCL緩沖液、DAB 、4℃丙酮、病豬血液（抗菌素凝血）、病豬臟器、水浴箱。
二、 溶液配制
１、 PH7.6 0.05Mtris_HCL緩沖液:
0.2M Tris(24.24g/l) 250ml
0.1N HCL(8.4ml/L) 375ml
NaCL 7.6g
DW 1000ml
2、0.01%H2O2、NaN2、PH7。6 0.05M Tis-HCL,緩沖液,用作內(nèi)源酶滅活液:
取PH7.6 0.05M Tris-HCL緩沖液98ml,加1%H2O2 1ml和1%NaN2 ,1ml即成.
3底物液：PH7.6 0.05M Tris-HCL緩沖液100ml加DAB75mg,避光攪拌3小時,使其溶解,濾紙過濾.臨用前加工廠%H2O2 0,5ml.
四、 實驗動物的準備
用豬瘟自然病例或人工感染豬病料作實驗。
人工感染需要在實驗前四天用豬瘟強毒（血毒）注射40斤左右的豬瘟易感豬，2ml/只，肌注。豬在3-4天后發(fā)病死亡，臨死前采豬心臟血，抗凝，以備做白細胞涂片。
解剖豬，采淋巴結(jié)、脾、扁桃體，各做組織觸片。
五、 實驗田步驟
１、 制片
（1） 取試管中抗凝血漿層置另一空試管中3000r/ml15分鐘，棄血漿，用生理鹽水將試管中的沉積細胞洗一次，最后用0.1-0.3ml生理鹽水懸浮沉積細胞,取2鉑耳在載玻片上作2個均勻的涂片.自然干燥.
（2） 用脾、腎、淋巴結(jié)、扁桃體等臟器中的一種在載片上作兩個橫切觸面，自然干燥。
（3） 對兩張片子作正反、左右標記。
２、 固定
將玻片置染色缸中，用4℃丙酮固定10分鐘。
３、 滅活內(nèi)源酶
取內(nèi)源酶滅活液100ml于待檢玻片的染色中，室溫滅活30分鐘，將玻片取出，流動的PBS洗15分鐘，再換去離子水洗10分鐘，取出玻片，自然干燥。
４、 酶染
用1mlPBS溶解一支凍干豬瘟標抗體制劑 ，在玻片左邊的觸（涂）面上滴加2滴豬瘟酶標抗體液并涂開，使其覆蓋觸（涂）面，右邊用PBS覆蓋作對照，將玻片平放在玻片上，置37℃45分鐘，取出玻片，流動的PBS洗15分鐘。
５、 顯色
取底物液100ml于放有檢樣玻片染缸中，置室溫。避光，30分鐘。取出玻片，流動的去離子水洗15分鐘，使其干燥。
６、 鏡檢
若左邊觸（涂）面中細胞 漿呈棕黃色，細胞核無色，右邊對照不顯色者，則為陽性；否則為陰性。
７、 認真觀察病變。
II免疫熒光試驗
一、 目的
掌握免疫熒光試驗的方法及原理。
二、 實驗步驟
１、 制片、固定同前法。
２、 加染熒光抗體
在玻片左邊的觸（涂）面上滴2滴豬瘟熒光抗體液并涂開，右邊用PBS作對照，將玻片平放在玻片架上，置37℃45分鐘，其后PHS（PH7.4,0.01M）洗15分鐘。
３、 晾干玻片后，鏡檢。若左邊觸（涂）面中細胞漿呈特異性黃綠色熒光，右邊對照不呈色者，則為陽性；否則為陰性。
III、示教實驗
１、 ELISA試驗檢測豬瘟抗；
２、 豬瘟病毒單克隆抗體的診斷應(yīng)用；
３、 感染豬瘟病毒PK-15細胞的IIF。
IV思考題
１、 為什么要對觸（涂）片進行固定？
２、 為什么要滅活內(nèi)源酶？機理是什么？
３、 免疫酶組化法和常規(guī)ELISA有何異同點？優(yōu)缺點是什么？
４、 診斷豬瘟還可用哪些方法？
實驗五 雞新城疫的診斷
I、 雞新疫病毒的雞胚分離
一、 目的
掌握利用雞胚分離病料中的NDV；
熟悉雞胚接種方法。
二、 實驗器材
碘酒棉球、酒精棉球 錐子 蛋架 10ml滅菌管 1ml 、5ml吸管 玻璃研磨器 1ml注射器 5號針頭 9-10齡雞胚 生理鹽水
青霉素雙抗液（1萬iu/ml） 離心機 天平 剪刀 鑷子 玻璃
鉛筆 ND病死雞 透明膠布 照蛋器
三、 實驗動物的準備
將NDV強毒做1：100稀釋注射健康的NDV易感小雞（1月齡左右），0.2ml/只胸肌注射,小雞將在注射后48小時左右死亡.死亡雞盡快進行實驗.
亦可從ND自然病雞分離病毒.
四、 實驗步驟
１、 無菌操作，沿死雞顱腔邊剪開顱骨，用鑷子除去頭蓋骨，使腦髓暴露。
２、 取約1g（蠶豆大?。┠X髓置玻璃磨器內(nèi)，并加少量生理鹽水，磨碎，再補加生理鹽水使總量約為5ml。然后加入雙抗液0.5ml（最終濃度達1000iu/ml），置37℃作用20分鐘，離心，2000轉(zhuǎn)/分，15分鐘。
３、 取上清液接種雞胚尿囊腔
（1） 照蛋。在靠近氣室的下方，避開大血管，用玻璃鉛筆標記接種點。
（2） 消毒。打孔。
（3） 接種：將針頭以與蛋殼成30（度）角的方向刺入尿囊腔，向尿囊腔內(nèi)接種經(jīng)步驟2處理的病料上清液0.1ml,注射速度宜慢.
（4） 用透明膠布封口.
４、 接種24小時開始照蛋，每天上、下午各照一次，棄去24小時內(nèi)死亡的雞胚，24小時以后死亡的雞胚，置鐵簍中，大頭朝上，置4-8℃?zhèn)渥鯤A、HI試驗。
５、 觀察死亡雞的病變并做記錄。
II、 免疫熒光試驗
一、 目的
了解免疫技術(shù)的一般程序和熒光抗體的制備；
掌握利用抗NDV單克隆抗體和間接免疫熒光技術(shù)診斷ND的方法。
二、 實驗器材
抗NDV單抗 兔抗鼠熒光抗體 PH7.2 0.01MPBS 銅藍 丙酮 蒸餾水 載玻片(潔凈無油) 1000ml燒杯 磁棒 磁力攪拌器
滴管 吸水紙 剪刀 外科手術(shù)刀 鑷子 病死雞(新鮮)
三、 實驗動物的準備
同實驗I
四、 實驗步驟
１、 無菌操作，解剖雞。
２、 取腦、肺、脾和盲腸扁桃體，用切面在載玻片上作兩個很薄的壓印，自然干燥。
３、 壓印片置盛有4℃丙酮的染色缸內(nèi)固定10分鐘，取出自然蒸發(fā)干燥。
４、 壓印片置染色架上，一個壓印面上加NDV單抗液數(shù)滴覆蓋，另一個壓印面上加PBS覆蓋作對照，染色架置于37℃飽和水汽中（可置于水浴箱中）作用30分鐘。
５、 取出載玻片，用去離子水和蒸餾水漂洗后，置銅藍中，流動PBS沖洗30分鐘，15分鐘換液一次，取出，吸水紙吸干并充分干燥。
６、 將工作濃度稀釋的兔抗鼠熒光抗體加于蓋玻片的兩個圖片上，置37℃水浴作用30分鐘。
７、 流動的PBS沖洗30分鐘，15分鐘換液一次，自然干燥。
８、 鏡檢
凡組織胞漿內(nèi)出現(xiàn)蘭綠色熒光或熒光顆粒而細胞核無熒光的判為陽性，否則為陰性。
Ⅲ、血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗
一、 目的
了解和HA和HI試驗并用于診斷ND
二、 實驗器材
蛋架 鑷子 滴管 10ml試管 微量血凝板 磨平滴管 生理鹽水 振蕩器 大平皿 1ml吸管 試管架 碘酒棉球 1%雞紅血球 NDV陽性抗血清 搪瓷盤 疑似ND病料接種致死的雞胚（見實驗I）
三、 實驗步驟
（一） HA、HI試驗
１、 無菌操作，收獲雞胚尿囊腔液。
２、 作HA試驗，測出血凝價。
３、 作HI試驗，測出血凝抑制價。
４、 觀察雞胚病變，并做記錄。
HA試驗操作方法表解如下：
試管號 1 2 3 4 5 6 7 8 9
稀釋倍數(shù) 1：10 2：10 1：40 1：80 1：160 1：320 1：640 1：1280 對照
試 生理鹽水
1:5稀釋尿囊液
液 0.5%雞紅血球 0.5
0.5
0.5 0.5
0.5
0.5 0.5
0.5
0.5 0.5
0.5
0.5 0.5
0.5
0.5 0.5
0.5
0.5 0.5
0.5
0.5 0.5
0.5
0.5 0.5
棄 0.5
0.5
混勻,置室溫20-30分鐘觀察結(jié)果
結(jié)果舉例 # # # # # # ++ -- --
表1所 示HA價為1:320
表2 HA-微量法(單位:滴)
孔號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
稀釋倍數(shù) 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 對照
生理鹽水 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
尿囊原液 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
0.5%雞紅血球 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
混勻,置室溫20-30分鐘,觀察結(jié)果
結(jié)果舉例 # # # # # # # # # # # #
表2所示HA價為1:256
表3 HI-試管法(單位:ml)
試管號 1 2 3 4 5 6 7 8 9
稀釋倍數(shù) 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 對照
尿囊液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 棄0.5
1:5稀釋的抗NDV血清 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
混勻,置室溫30分鐘
0.5%雞紅血球 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
混勻置室溫20-30分鐘觀察結(jié)果
結(jié)果舉例 - - - - - + ++ # -
表3所示HI價為1:160
表4 HI-微量法(單位:滴)
孔號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
稀釋倍數(shù) 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 對照
尿囊液 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 棄1
抗NDV血清 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
混勻,置室溫30分鐘觀察結(jié)果
0.5%雞紅血球 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
混勻,置室溫20-30分鐘
結(jié)果舉例 - - - - - - - + ++ +++ # -
表4所示HI價為1:128
注:若HA價是1:320,則0.5ml1：160稀釋的尿囊液中含2iu病毒，0.5ml1:80稀釋的尿囊液中含4iu病毒,0.5ml1:40稀釋的尿囊液中含8iu病毒.
HI試驗用搞原直接稀釋血清法,表3和表4中,第1管(孔)用0.5ml含水8個iu病毒的尿囊液,第2—4管(或2—12孔)用0.5ml含4個iu病毒的尿囊液.
四、思考題
１、 什么叫血凝價（HA價）？什么叫血凝單位？什么叫血凝抑制價？
２、 為什么診斷ND要做HI 試驗？
３、 HA和HI試驗在家畜傳染病學(xué)上應(yīng)用有哪些？
４、 為什么NDV具有自動解凝現(xiàn)象？解凝后的紅細胞能否再被NDV凝集？
５、 如何判定HA和HI試驗結(jié)果？
IV、 示教試驗
１、 NDV單抗分型試驗（IIF）？
２、 單抗夾心ELISA試驗檢測NDV。
實驗六 雞馬立克病的瓊擴診斷
一、 目的
掌握瓊脂板的制作方法和利用雙向瓊擴試驗診斷ND。
二、 實驗器材
干凈大平皿 打孔器 打孔圖紙 16號針頭 7號針頭 磨平針頭
剪刀 鑷子 試管 架 搪瓷盤 天平 鋁鍋 電爐 玻棒
10ml吸管 毛細滴管 滴頭 紅鉛筆 橡皮膏 濕盒 陽性羽根
瓊脂粉 氯化鈉 量管 蒸餾水 示教平板
三、 實驗步驟
（一） 瓊 脂板制備
１、 稱取瓊脂粉4g，NaCL 400g鋁鍋內(nèi)加蒸餾水500ml，煮沸溶化。
２、 澆瓊脂板，每只直徑90mm平皿傾注溶化的0.8%瓊脂液18—20ml,然后將平皿置于水平的桌面上,使其自然凝固成厚度均勻的瓊脂平板。
３、 按試驗的需要打孔，燙孔。
（二） 羽根瓊擴試驗
１、 按打孔圖紙所示模式打孔，燙 孔。
２、 每只受檢雞拔取6根新羽（最好是羽根帶血的新羽），剪下羽根，長約0.5ｃｍ。
３、 在孔內(nèi)加抗MD陽性血清。
４、 距血清孔內(nèi)約3mm的四周上均勻六點垂直插入同一只雞的六根羽根，并做陽性羽根對照。在平皿壁上標記受檢的號碼。
５、 平皿置濕盒中，于37℃進行擴散。
６、 24小時后觀察結(jié)果，同一只雞的六根羽根只要有一根與抗MD陽性血清孔間出現(xiàn)沉淀即可判定為MD陽性雞。
（三） 血清瓊擴和羽根浸液瓊擴試驗
１、 受檢雞血清分離
以帶20號針頭的1ml玻璃注射器從雞翅靜脈采血約0.5ml注入滅菌試管，也可以刺破靜脈后，將一滅菌試管靠近流血處使血流流入試管約0.5ml，將試管擺成斜面，待血凝固，血清析出，供實驗用。
２、 羽根浸液的制備
將受檢雞新生羽根10條放在小試管內(nèi)，加生理鹽水約0.5ml，用玻璃棒輕壓羽根，使囊內(nèi)的MDV浸出，上清液供實驗用。
３、 按打孔圖紙模式打孔、燙 孔，共九個區(qū)。
４、 實驗程序
（1） 血清瓊擴
將MD診斷抗原液加入中間孔，受檢雞血清加入周圍孔，每個檢樣用一孔，并設(shè)抗MD 陽性血清對照，每區(qū)最接近平皿壁的孔定為第1孔，由此按順時針方向定為2、3、4、5、6孔，在記錄本上記下與孔號相對應(yīng)的雞號。
（2） 羽根浸液瓊擴
將MD陽性血清加入中間孔，受檢羽根浸液加周圍孔，每個檢樣用一孔，并設(shè)陽性MD 抗原對照，記錄雞號的方法，同血清瓊 擴。
５、 將平皿置濕清加入中，于37℃進行擴散。
６、 24小時后觀察實驗結(jié)果，出現(xiàn)沉淀線則為MD陽性雞。
四、 思考題
１、 羽根瓊擴和血清瓊擴各適用于何種月齡 的雞的MD診斷？為什么？
２、 血清瓊擴在實際工作中還可用于哪些禽病的診斷？
３、 用雞血清進行瓊 擴試驗，應(yīng)用什么濃度NaCL 的瓊 脂板？
４、 瓊擴試驗的原理是什么？
５、 瓊脂平板的保存應(yīng)注意什么問題？
五、 示教試驗：MDV單抗分型鑒定（IIF）
注：雞傳染性法氏囊?。↖BD）的瓊擴診斷是取待檢雞血清與傳染性法氏囊病診斷抗原作瓊擴試驗，其原理和操作方法同MD 的血清瓊 擴試驗。
實驗七 沙門氏菌快速檢驗試驗
一、 目的
了解沙門氏菌快速檢驗的方法和原理；
掌握FA和ELISA的操作步驟
二實驗器材
使用儀器、器械、試液，請參閱前述有關(guān)章節(jié)模擬待檢樣品
三實驗步驟
（一） 直接免疫熒光試驗檢測沙門氏菌
１、 取勝模擬樣品增菌培養(yǎng)物10ml，于載玻片上涂成2cm（）面積的薄膜，空氣干燥。
２、 以4℃或-20丙酮固定涂膜，室溫10—15分鐘，晾干。
３、 加染熒光抗體（FITC標記兔抗菌素沙門氏菌血清或O 抗菌素原單抗），37℃45分鐘。
４、 PBS PH7.4 0.01M攪拌下洗滌10分鐘,晾干.
５、 于熒光鏡下鏡檢，陽性樣品在細菌四周有特異性黃綠色熒光，而陰性樣品未見黃綠色熒光。
（二） 單抗夾心ELISA試驗檢測沙門氏菌
１、以方陣試驗確定單抗包被濃度和酶標制劑的使用濃度。
２、以pH9.6碳酸鹽緩沖液包被單抗，100ul/孔，4℃過夜，或37℃2hr。
３、PBST洗滌三次。
４、以10%CFS-PBS封閉37℃3hr。
５、PBST洗滌三次。
６、加模擬樣品增菌液，100ul/孔,室溫15分鐘。
７、PBST洗滌三次。
８、加新配套OPD底物緩沖液，100ul/孔,室溫15分鐘。
９、2M HSO終止反應(yīng)（100ul/孔）。
10、加新配OPP底物緩沖液，100ul/孔，室溫15分鐘。
11、2M H2SO4終止反應(yīng)（100ul/孔）
12、肉眼判定或測定OD496值。
（三） 示教試驗 沙門氏菌O-I噬菌體裂解試驗。
實驗八 雞白痢的診斷
一、 目的
掌握快速全血平板凝集反應(yīng)并用來診斷雞白痢。
二、實驗器材
小搪瓷盤 鐵絲環(huán) 滴管 玻璃板 干凈紗布 24號針頭 7號針頭 滅菌大平皿
生理鹽水 雞白痢凝集抗原液
三、實驗步驟
（一） 快速全血平板凝集試驗
１、 將雞白痢診斷抗原液充分振蕩混勻，用滴管吸取抗原滴2滴于玻板上。
２、 一人保定雞，另一人用7號針頭刺破被檢雞的翅靜脈使其出血。
３、 用鐵絲環(huán)沾取一滴環(huán)血液與玻板上的抗原液攪拌均勻，并涂開至直徑約1.5cm大小的涂面。
４、 25℃時，于2分鐘內(nèi)出現(xiàn)明顯的凝集顆?；蚰瑒t為陽性反應(yīng)。
（二） 示教實驗
１、 雞白痢沙門氏菌的分離鑒定；
２、 間接血凝試驗；
３、 瓊脂擴散沉淀試驗；
４、 抗體競爭ELISA試驗。
注：雞慢性呼吸道病的現(xiàn)場診斷是慢性呼吸病平板凝集抗原與受檢全血做凝集試驗。操作方法同雞白痢的快速全血玻板凝集實驗。
作者:
順風(fēng)
時間:
2007-11-5 12:43
深深感謝樓主的慷慨行為！
作者:
ligye123
時間:
2007-11-5 16:17
樓主辛苦了!太感謝了!
作者:
hzpig
時間:
2007-11-14 17:57
感謝樓主分享如此詳盡的好資料
作者:
xiangtl168
時間:
2008-8-26 00:16
太辛苦了，我們連論壇幣就不用花了！謝謝了?。。。?！
作者:
jasminedl
時間:
2008-10-28 10:36
我怎么看不到內(nèi)容？
作者:
jasminedl
時間:
2008-10-28 10:48
現(xiàn)在看到了~~~~~~~~~~~~:tiaotiao:
作者:
qiaoqiao
時間:
2008-12-30 23:33
感謝感謝。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。
作者:
jiexiaodi
時間:
2009-2-12 16:07
真是非常感謝樓主，這是我找了很多地方都沒有找到的好東西啊
作者:
ruiangulai
時間:
2009-4-20 08:35
資料十分詳細，太感謝了。
作者:
白鶴
時間:
2009-4-20 08:50
資料十分詳細，太感謝了
作者:
xishanzhongke
時間:
2009-4-20 09:02
強烈建議該貼加精！
作者:
020712002
時間:
2009-8-8 10:41
真希望樓主把文件壓縮，下載方便
作者:
616842768
時間:
2009-8-14 19:00
好啊 真的好 太好了
作者:
王存海
時間:
2009-8-14 22:51
資源共享的品德值得學(xué)習(xí)
作者:
jackwang
時間:
2009-8-16 22:59
樓主簡直是雪中送炭啊，敬禮?。。?！
作者:
斯諾
時間:
2009-8-19 09:10
很實用呀，我正在弄一個實驗室，很多東西可以用的上！謝謝分享！
作者:
kcwwy
時間:
2010-9-21 20:50
謝謝樓主的辛苦
作者:
kcwwy
時間:
2010-11-7 11:01
樓主辛苦了
作者:
kcwwy
時間:
2010-11-7 11:02
沒有看到資料
作者:
kcwwy
時間:
2010-11-7 11:07
樓主能不能給我發(fā)一份資料
xiaoyong8734@163.com
,xiexie
作者:
高永長
時間:
2010-11-7 11:26
給我們省了，謝謝了
作者:
高永長
時間:
2010-11-7 11:26
給我們省了，謝謝了
作者:
高永長
時間:
2010-11-7 11:27
給我們省了，謝謝了
作者:
tom06
時間:
2011-1-5 16:04
深深感謝樓主的慷慨行為！
歡迎光臨 畜牧人 (http://ffers.com.cn/)
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