畜牧人

標(biāo)題: 豬場(chǎng)大腸桿菌耐藥性的流行病學(xué)調(diào)查 [打印本頁(yè)]

作者: vetqq    時(shí)間: 2008-5-26 11:28
標(biāo)題: 豬場(chǎng)大腸桿菌耐藥性的流行病學(xué)調(diào)查
豬場(chǎng)大腸桿菌耐藥性的流行病學(xué)調(diào)查
俞道進(jìn) 黃一帆 鄧文華 方雪燕
(福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,福建  福州 350002
摘要:NCCLS推薦的Kirby-Bauer藥敏紙片法,對(duì)從兩個(gè)豬揚(yáng)分離到的大腸桿菌進(jìn)行了17種抗菌藥物的敏感性測(cè)試。結(jié)果顯示,用藥習(xí)慣和用藥頻率存在較大差異的新舊兩個(gè)豬場(chǎng)分離到的大腸桿菌對(duì)這些抗生素的耐藥情況比較接近,對(duì)大部分抗生素僅為程度上的差別。表明細(xì)菌耐藥性形成有其特定規(guī)律,對(duì)某些抗生素的耐藥性一旦形成,很難恢復(fù)到敏感狀態(tài)。藥物使用頻率與多重耐藥菌的出現(xiàn)有直接的關(guān)系。
關(guān)鍵詞:大腸桿菌; Kirby-Bauer法;耐藥性;流行病學(xué)
Study on the epidemiology of E.coli resistance in pig farms
YU Dao-jin, HUANG Yi-fan, DENG Wen-hua, FANG Xue-yan
(Collge of animal science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)
Abstract In order to compare the difference of antibiotic resistant model between two pig farms, antimicrobial susceptivity test were carried out to E.coli
by using the Kirby-Bauer method recommended by NCCLS. The result indicated that there is little differences between the two pig farms
, though there are many differences in the using of antibiotic. It is prompted that there are some disciplinarians in the form of antibiotic resistance. To some antibiotic, once resistance has been formed, it is difficult for them to resume. There is directly relationship between the using frequency and the appearance of multi-resistant bacterium.
Key words: E.coli;Kirby-Bauer method;antibiotic resistance;epidemiology

細(xì)菌對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)常用抗生素產(chǎn)生耐藥性已經(jīng)引起普遍的關(guān)注,其中大腸桿菌的耐藥性研究較為集中也較為深入。目前研究多集中在對(duì)耐藥性進(jìn)行一定范圍的調(diào)查和運(yùn)用分子生物學(xué)手段進(jìn)行耐藥機(jī)理的研究,而對(duì)細(xì)菌耐藥性的流行病學(xué)研究較少[1-3]。本研究對(duì)用藥習(xí)慣和用藥頻率存在較大差異的新舊兩個(gè)豬場(chǎng)分離到的大腸桿菌進(jìn)行了17種抗菌藥物的敏感性測(cè)試,以期尋求細(xì)菌耐藥性形成的一些規(guī)律,為減少耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)和指導(dǎo)臨床合理用藥提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1
菌株

20044月,在福建省福清市兩個(gè)有代表性的規(guī)?;B(yǎng)豬場(chǎng),分離到大腸桿菌共計(jì)142株。
1.1.2
培養(yǎng)基

麥康凱瓊脂、水解酪蛋白瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯等購(gòu)自上海伊華醫(yī)學(xué)科技有限公司。
1.1.3
藥敏紙片



按照FDA認(rèn)可的臨床微生物實(shí)驗(yàn)室非嬌嫩細(xì)菌常規(guī)藥敏試驗(yàn)和報(bào)告規(guī)定選

擇抗生素。1 7種抗生素藥敏紙片購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。
1.1.4細(xì)菌生化鑒定管

腸桿菌科細(xì)菌生化編碼微量鑒定管(11×20/盒)購(gòu)自杭州天和微生物試
劑有限公司。
1.2 方法
1.2.1選擇試驗(yàn)豬場(chǎng)
選取新舊兩個(gè)有代表性的規(guī)?;B(yǎng)豬場(chǎng),舊場(chǎng)建于19975月,由于建場(chǎng)歷史較久,曾經(jīng)出現(xiàn)過(guò)較大的疫情,目前場(chǎng)內(nèi)正在遭受斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的影響,因此很經(jīng)常進(jìn)行預(yù)防性用藥。對(duì)仔豬拉稀的治療原來(lái)有使用過(guò)氯霉素,現(xiàn)在主要以慶大霉素、恩諾沙星等藥為主,同時(shí)四環(huán)素類(lèi)抗生素、磺胺類(lèi)抗生素、阿莫西林、先鋒Ⅳ等藥現(xiàn)在經(jīng)常用于飼料添加。新場(chǎng)建于2003年年底,由于豬場(chǎng)建筑設(shè)計(jì)比較合理,飼養(yǎng)管理水平較高,豬場(chǎng)到目前為止未有大的疫情出現(xiàn),預(yù)防性用藥很少,對(duì)仔豬拉稀的治療主要以恩諾沙星等藥為主。
1.2.2樣本采集
以滅菌棉簽采集仔豬新鮮拉稀糞便共36個(gè)樣本,將采集的標(biāo)本置于滅菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)管中保存,其中新場(chǎng)17個(gè)樣本,舊場(chǎng)19個(gè)樣本。
1.2.3細(xì)菌的分離與純化

把營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)管中的糞便標(biāo)本,用無(wú)菌接種棒挑取菌液接種于麥康凱瓊脂平板上,37培養(yǎng)24小時(shí),觀察菌落的生長(zhǎng)情況。在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上形成粉紅色菌落后,挑取典型的單個(gè)菌落,接種于伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上,37培養(yǎng)24小時(shí),觀察形成紫黑色有或沒(méi)有金屬光澤的菌落;鏡檢為革蘭氏陰性、兩端鈍圓的小桿菌,單在或成對(duì)。
1.2.4細(xì)菌鑒定及保存

采用腸桿菌科細(xì)菌生化編碼微量鑒定管進(jìn)行細(xì)菌的鑒定。將分離純化的可疑大腸桿菌菌株接種于系列細(xì)菌生化編碼微量鑒定管內(nèi),37培養(yǎng)24小時(shí)后,對(duì)細(xì)菌生化反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行判斷并編碼,按編碼值檢索腸桿菌科細(xì)菌生化編碼表即可獲得結(jié)果,對(duì)不確定菌株進(jìn)一步補(bǔ)充生化反應(yīng)予以判定。
經(jīng)生化反應(yīng)鑒定為大腸桿菌者,在新鮮菌液中加入滅菌甘油制成10%v/v)甘油菌,置于-20冰箱保存?zhèn)溆谩?/font>
1.2.5細(xì)菌藥敏試驗(yàn):
嚴(yán)格按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(National
Committee
for
Clinical
Laboratory
Standards
, NCCLS)推薦的K-B法進(jìn)行[4]。首先在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取單個(gè)菌落接種于2ml普通肉湯管內(nèi), 37培養(yǎng)16-18小時(shí)后,用MH肉湯調(diào)制菌懸液,使其達(dá)到0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡岫取S脺缇奘米吁慈≌{(diào)制好的菌懸液,均勻涂抹在MH瓊脂平板上,涂好后放置3-5分鐘,待培養(yǎng)基表面水分吸干后,即用無(wú)菌眼科鑷將藥敏紙片貼于平板上,各紙片中心相距>24mm,紙片距平板內(nèi)緣>15mm。37培養(yǎng)16-18小時(shí)后觀察結(jié)果。

1.2.6細(xì)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)
參照NCCLS1999)公布的標(biāo)準(zhǔn)以敏感(S)、中介(I)、耐藥(R3種形式對(duì)抑菌圈大小作出解釋?zhuān)卸?biāo)準(zhǔn)如表1所示。
2 結(jié)果與分析
2.1 不同豬場(chǎng)大腸桿菌耐藥情況及比較
新舊兩豬場(chǎng)分離的大腸桿菌對(duì)抗生素的耐藥情況分別如表2和表3所示。本次試驗(yàn)結(jié)果表明,在各類(lèi)抗菌藥中,從兩個(gè)豬場(chǎng)分離到的大腸桿菌對(duì)四環(huán)素、復(fù)方新諾明等常用抗生素的耐藥率較高,對(duì)已經(jīng)不再使用的氯霉素也仍然有高的耐藥率,對(duì)氨基糖苷類(lèi)的慶大霉素耐藥率較高,而同類(lèi)的鏈霉素和丁胺卡那則較敏感。值得引起注意的是氟喹諾酮類(lèi)抗生素在本次試驗(yàn)中表現(xiàn)出比較高的耐藥率,而細(xì)菌對(duì)臨床少用的抗生素如多粘菌素、氨曲南、頭孢哌酮等藥物的敏感性較高。
對(duì)兩個(gè)場(chǎng)大腸桿菌的耐藥譜進(jìn)行比較,結(jié)果如圖1所示。雖然兩個(gè)場(chǎng)建場(chǎng)時(shí)間不同,藥物使用習(xí)慣和使用頻率存在較大差異,但兩場(chǎng)的細(xì)菌耐藥譜卻比較一致,許多情況下僅為耐藥程度的差別??傮w來(lái)說(shuō),舊場(chǎng)分離的細(xì)菌對(duì)各種抗生素表現(xiàn)出較高的耐藥率,一些在新場(chǎng)非常敏感的抗生素,在舊場(chǎng)已經(jīng)表現(xiàn)出一定程度的耐藥。比較其他學(xué)者的研究成果[5-6]發(fā)現(xiàn),大腸桿菌在不同的環(huán)境下對(duì)氨芐青霉素、阿莫西林、氯霉素、復(fù)方新諾明和四環(huán)素類(lèi)藥物都比較容易產(chǎn)生較高水平的耐藥,而且這種耐藥性一般來(lái)說(shuō)比較持久。
2.2 不同豬場(chǎng)大腸桿菌多重耐藥情況及比較
考察兩個(gè)豬場(chǎng)大腸桿菌多重耐藥情況,結(jié)果如圖2所示??傮w而言,兩個(gè)場(chǎng)的細(xì)菌多重耐藥情況比較接近,新場(chǎng)分離細(xì)菌6重耐藥以下的細(xì)菌數(shù)明顯多于舊場(chǎng),提示藥物使用頻率和程度對(duì)細(xì)菌多重耐藥的形成有直接的影響。從圖中可以了解到目前養(yǎng)殖場(chǎng)分離的大腸桿菌普遍存在對(duì)抗生素的多重耐藥現(xiàn)象,本試驗(yàn)中許多細(xì)菌表現(xiàn)出對(duì)四環(huán)素、復(fù)方新諾明、氯霉素、氨芐青霉素、阿莫西林以及阿莫西林/棒酸合劑的共同耐藥,因此0-4重耐藥菌所占比例很小,6重耐藥細(xì)菌最多。同時(shí)一些細(xì)菌又發(fā)展出對(duì)氨基糖苷類(lèi)或氟喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥性,所以6-10重耐藥細(xì)菌成為分離細(xì)菌的主體。本試驗(yàn)中的10-11重耐藥菌,就是對(duì)臨床常用抗生素都耐藥的細(xì)菌,這部分細(xì)菌所占比例也不少,應(yīng)該引起我們的高度重視。

1
K-B
法大腸桿菌耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)
Table 1
E.coli antibiotic resistance standard of K-B method
藥物名稱(chēng)
含藥量
μg/片)
        徑(mm
R
I
S
氨芐青霉素
10
13
14-16
17
阿莫西林
10
14
15-17
18
阿莫西林+棒酸
20+10
13
14-17
18
氨曲南
30
15
16-21
22
亞氨培南
10
13
14-15
16
頭孢哌酮
75
15
16-20
21
頭孢唑啉
30
14
15-17
18
丁胺卡那
30
14
15-16
17
慶大霉素
10
12
13-14
15
鏈霉素
10
11
12-14
15
氯霉素
30
12
13-17
18
四環(huán)素
30
14
15-18
19
新諾明+TMP
23.75+1.25
10
11-15
16
多粘菌素
300u
8
9-12
13
環(huán)丙沙星
5
15
16-20
21
諾氟沙星
10
12
13-16
17
氧氟沙星
5
12
13-15
16
注:本表整理自美國(guó)NCCLS藥敏紙片擴(kuò)散法法規(guī)及操作規(guī)程
2
舊場(chǎng)大腸桿菌耐藥情況
Table 2
E.coli antibiotic resistance model of old pig farm
藥敏紙片

細(xì)菌總數(shù)

R
I
S

細(xì)菌數(shù)
%
細(xì)菌數(shù)
%
細(xì)菌數(shù)
%
氨芐青霉素
阿莫西林
75
69
92.0

4
5.3

2
2.7
75
74
98.7
1
1.3
0
0
阿莫西林/棒酸

60

56
93.3
4
6.7
0

0
氨曲南

75

0
0

2
2.7
73
97.3
亞氨培南
64

1
1.6
11
17.2
52
81.2
頭孢哌酮
75

1
1.3
5
6.7
69
92.0
頭孢唑啉
75

4
5.3
17
22.7
54
72.0
丁胺卡那
75

17

22.7
1
1.3
57
76.0
慶大霉素
56

28
50.0
4
7.1
24
42.9
鏈霉素
56

4
7.1
64
85.3
10
17.9
42
75.0
氯霉素
75

3
4.0

8
10.7
四環(huán)素
75

74
98.7
0
0

1

1.3
新諾明+TMP
75

68
90.7
5
6.6
2
2.7
多粘菌素
56

1
1.8
0
0
55
98.2
環(huán)丙沙星
75

34
45.3
5
6.7
36
48.0
諾氟沙星

69

32
46.4
2
2.9
35
50.7
氧氟沙星
75

28

37.3
6
8.0
41
54.7

3
新場(chǎng)大腸桿菌耐藥情況
Table 3
E.coli
antibiotic resistance model of new pig farm
藥敏紙片

細(xì)菌總數(shù)

R
I
S

細(xì)菌數(shù)
%
細(xì)菌數(shù)
%
細(xì)菌數(shù)
%
氨芐青霉素
阿莫西林
67
61

91.0

1
1.5

5
7.5

67
61


91.0

2
3.0

4
6.0

阿莫西林/棒酸
54

49


90.7

3
5.6

2
3.7

氨曲南
67

0


0

2
3.0

65
97.0

亞氨培南
64

0


0

3
4.7

61
95.3

頭孢哌酮
67

0


0

2
3.0

65
97.0

頭孢唑啉
67

0


0

13

19.4

54
80.6

丁胺卡那
67

7

10.5

0
0

60
89.5

慶大霉素
64

21

32.8

6
9.4

37
57.8

鏈霉素
54

3


5.6

56


83.5

0
0

51
94.4

氯霉素
67

3
4.5

8
12.0

四環(huán)素
67

65


97.0

0
0

2
3.0

新諾明+TMP
67

59


88.1

0
0

8
11.9

多粘菌素
67

0


0

0
0

67
100

環(huán)丙沙星
67

23
34.3

2
3.0

42
62.7

諾氟沙星
69

20

33.3

0
0

40
66.7

氧氟沙星
67

24

35.8

1
1.5

42
62.7





3討論
3.1藥物使用頻率與耐藥率的關(guān)系
四環(huán)素類(lèi)抗生素和氯霉素類(lèi)抗生素在新場(chǎng)使用較少,但試驗(yàn)結(jié)果卻表明細(xì)菌對(duì)這兩種抗生素有較高的耐藥率,這可能與引進(jìn)種豬體內(nèi)攜帶的耐藥菌群有關(guān),據(jù)了解,新場(chǎng)的原種場(chǎng)建場(chǎng)時(shí)間為1998年。這同時(shí)提示我們,對(duì)這兩種抗生素已經(jīng)形成耐藥的細(xì)菌,即使停藥較長(zhǎng)時(shí)間也不容易恢復(fù)到敏感狀態(tài)。
3.2抗生素的交叉耐藥性
調(diào)查發(fā)現(xiàn),耐藥菌株表現(xiàn)出了對(duì)同類(lèi)抗生素的交叉耐藥性,這在氟喹諾酮類(lèi)和氨基糖苷類(lèi)抗生素表現(xiàn)得特別明顯,環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星都是氟喹諾酮類(lèi)抗生素,近年來(lái)其耐藥率有不斷積累的趨勢(shì)。本次試驗(yàn)表明臨床分離的大腸桿菌已經(jīng)有相當(dāng)程度的耐藥率。有文獻(xiàn)報(bào)道氧氟沙星在該類(lèi)抗生素中較少誘導(dǎo)出耐藥菌[7],本次試驗(yàn)可能是由于交叉耐藥現(xiàn)象的存在,結(jié)果顯示臨床分離細(xì)菌對(duì)氧氟沙星的耐藥率也比較高。因此,獸醫(yī)臨床用藥應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果,有針對(duì)性地使用,同時(shí)要首先選用不容易誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的藥物,而且必須經(jīng)常更換抗生素種類(lèi),以免產(chǎn)生新的耐藥菌株。
目前,獸醫(yī)臨床上抗生素的廣泛、長(zhǎng)期使用導(dǎo)致許多菌種的耐藥性增強(qiáng),這不僅給控制和治療疾病帶來(lái)困難,而且加劇了抗生素在畜禽體內(nèi)的殘留,嚴(yán)重危害動(dòng)物食品安全[8]。面對(duì)世界上對(duì)抗生素在食品動(dòng)物上使用的限制日益嚴(yán)格的趨勢(shì),加強(qiáng)開(kāi)發(fā)抗生素替代產(chǎn)品成為必然,其中中草藥以其低毒性、低殘留、不容易誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥性等特點(diǎn),成為許多研究的熱點(diǎn),今后仍然有必要加強(qiáng)這方面的研究[9]。同時(shí),面對(duì)日益嚴(yán)重的耐藥性問(wèn)題,獸醫(yī)臨床有必要定期對(duì)豬場(chǎng)的常見(jiàn)病原菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn),而且要加強(qiáng)耐藥性的流行病學(xué)研究,對(duì)目前在飼料中廣泛添加阿莫西林、磺胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)藥物的有效性有必要進(jìn)行合理的評(píng)價(jià)。

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基金項(xiàng)目:福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(           
作者簡(jiǎn)介:俞道進(jìn)(1974—),男,講師,博士. 研究方向:獸醫(yī)藥理與毒理




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