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畜牧人
標(biāo)題:
細(xì)胞ELISA實(shí)驗(yàn)手冊(cè)
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作者:
bluewing2003
時(shí)間:
2008-8-3 20:44
標(biāo)題:
細(xì)胞ELISA實(shí)驗(yàn)手冊(cè)
一、福爾馬林固定細(xì)胞
1
、用胰蛋白酶消化細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞；
2
、收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)；
3
、離心，1500rpm，10min；
4
、用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞于適當(dāng)?shù)臐舛龋?/font>
上皮細(xì)胞4×105個(gè)細(xì)胞/ml，
纖維細(xì)胞2×105個(gè)細(xì)胞/ml；
5
、滴加到96孔培養(yǎng)板中，100ul/孔；
6
、37C環(huán)境孵育過夜；
7
、用PBS洗板兩次；
8
、每孔加125ul 10％福爾馬林緩沖液；
9
、于室溫環(huán)境下固定15min；
10
、用雙蒸水洗滌三次；
11
、晾干；
12
、貯存于2-8 C
.
二、試劑：
1
、PBS：1％ BSA
2
、PBS：2％BSA
3
、碳酸鹽緩沖液：
1.59g
Na2CO3
2.93g
NaHCO3
溶解于900ml雙蒸水中，檢測(cè)并調(diào)整pH至9.6，定容至1L；
4
、10×底物液，pH6.0
36.6g
一水合檸檬酸
113.5g
磷酸氫二鉀
溶解于900mL雙蒸水中，調(diào)pH至6.0，定容至1L；
5
、0.3％H2O2：用雙蒸水按1：100稀釋30％的雙氧水
6
、OPD貯存液，4.0％：4g OPD溶解于100ml雙蒸水，分裝后保存到-20 C,注意避光。
7
、4.5N H2SO4
12.0mL
濃硫酸
88.0ml
雙蒸水混合
三、實(shí)驗(yàn)步驟：
1
、用雙蒸水洗滌ELISA板兩次；
2
、每孔加250ul含2％BSA的PBS；
3
、37C孵育1h；
4
、雙蒸水洗板三次；
5
、每孔加50ul腹水，上清，或用含1％BSA的PBS稀釋后的稀釋品；
6
、37C孵育2h；
7
、雙蒸水洗板五次；
8
、每孔加50ul用含1％BSA的PBS稀釋的HRP酶標(biāo)抗鼠IgG；
9
、37C孵育1h；
10
、用雙蒸水洗板5次。用碳酸鹽緩沖液洗兩次；
11
、加工作濃度底物液50ul/孔，配方如下：
0.5ml 4.0
％ OPD
5ul
30
％H2O2
1.0 ml 10
× 底物緩沖液
8.5ml
雙蒸水
12
、在室溫下孵育20min；
13
、加4.5N 硫酸溶液 25ul/孔；
14
、在酶標(biāo)儀上測(cè)OD490波長的值。
注意：
1
、檢測(cè)上清按1：5稀釋；
2
、檢測(cè)腹水可按1：100稀釋
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