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標(biāo)題: 魚類消化道微生物的分布及調(diào)控 [打印本頁]
作者: sunyunzhang    時(shí)間: 2008-8-8 15:12
標(biāo)題: 魚類消化道微生物的分布及調(diào)控
魚類生活的環(huán)境和魚類消化道中存在著大量的微生物，在魚類生長發(fā)育過程中，魚類消化道逐漸形成了一個(gè)由好氧菌、兼性厭氧菌和絕對(duì)厭氧菌組成的動(dòng)態(tài)正常菌群。正常情況下，魚類消化道的各種微生物生長良好，占主導(dǎo)優(yōu)勢的有益微生物菌群能使消化道處于健康環(huán)境中，從而保證魚類消化道的正常消化和吸收。同時(shí)，有益微生物菌群定植于腸內(nèi)壁黏膜，形成非特異性的生物保護(hù)屏障，抑制病原菌對(duì)腸壁的定植，維持腸道正常的微生態(tài)平衡。但當(dāng)出現(xiàn)餌料或環(huán)境變更等應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，這種理想的微生物區(qū)系平衡會(huì)受到?jīng)_擊，宿主的正常防御系統(tǒng)被破壞，某些條件致病菌會(huì)轉(zhuǎn)移、定植并侵襲魚體的其它組織器官，導(dǎo)致細(xì)菌性疾病的暴發(fā)[1]。因此，如何利用益生素、化學(xué)益生素等調(diào)控魚類消化道微生物的組成，保持魚類消化道微生物區(qū)系平衡，維持動(dòng)物健康正成為國際上的研究熱點(diǎn)。
1魚類消化道微生物的組成和分布
魚卵孵化前表面附著有大量的細(xì)菌，但剛孵化魚的胃腸道通常是無菌的。孵化后的仔魚在卵黃囊消耗以前就會(huì)開始飲水，水中的細(xì)菌得以進(jìn)入仔魚的消化道。稍大一點(diǎn)的仔魚還會(huì)攝食附著有大量細(xì)菌的懸浮顆粒和卵黃碎片。因此，養(yǎng)殖水體、懸浮顆粒和卵黃碎片的細(xì)菌成為仔魚消化道微生物區(qū)系的最初來源。但是，魚類胃腸道環(huán)境不同于水體環(huán)境，僅那些能適應(yīng)魚類胃腸道環(huán)境和宿主的免疫系統(tǒng)的微生物能夠定植于胃腸道。研究表明，仔魚期形成了最初的不穩(wěn)定的微生物區(qū)系，隨后此微生物區(qū)系逐漸成熟，幼魚期形成比較穩(wěn)定的微生物區(qū)系。例如，羅非魚（Tilapia mossambica）在孵化后20~60 d內(nèi)建立起比較成熟的微生物區(qū)系[2]。仔稚魚免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完成，它們更多的是依賴非特異性防御機(jī)制，其中，胃腸道粘膜上附著的正常菌群可能是仔稚魚對(duì)抗致病菌入侵的第一道屏障。然而，由于傳統(tǒng)方法的嚴(yán)重制約，特別是消化道微生物區(qū)系復(fù)雜多樣且需厭氧環(huán)境，目前有關(guān)仔稚魚消化道微生物的研究較少，仔稚魚胃腸道粘膜上附著的菌群種類、功能和變化尚不清楚。令人欣喜的是，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的日益發(fā)展，DGGE、TGGE等DNA指紋技術(shù)有望用于魚類消化道微生物區(qū)系的研究，從而加深人們對(duì)魚類消化道微生物菌群分布和功能的了解[3]。
有關(guān)幼魚和成魚消化道微生物區(qū)系組成研究較多，報(bào)道結(jié)果也不盡相同。但通常情況下，淡水魚消化道中常見的微生物主要有氣單胞菌(Aeromonas)、假單胞菌(Pseudomonas)、鄰單胞菌(Plesiomonas)、腸桿菌(Enterobacter)等，而海水魚消化道中最常見的是弧菌(Vibrio)、假單胞菌、不動(dòng)桿菌(Acinetobacter) 等[3]。成魚的消化系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)育完成，消化道微生物區(qū)系變得相對(duì)穩(wěn)定。但是，當(dāng)出現(xiàn)病原菌侵襲、餌料或環(huán)境變更等應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，這種理想的微生物區(qū)系平衡會(huì)受到?jīng)_擊，宿主的正常防御系統(tǒng)被破壞。Lodemel等[4]報(bào)道，正常情況下北極嘉魚(Salvelinus alpinus L.)腸道微絨毛上附著有大量的細(xì)菌，而人工感染殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida ssp. Salmonicida)后，附著于腸道的細(xì)菌數(shù)量下降了100倍，提示感染致病菌后北極嘉魚腸道正常菌群數(shù)量急劇下降。隨后，Ringo等[5]研究了殺鮭氣單胞菌攻毒對(duì)北極嘉魚腸道微生物的影響。結(jié)果表明，攻毒后北極嘉魚腸道微生物區(qū)系發(fā)生了一些變化，而肉桿菌(Carnobacterium) 則持續(xù)存在于后腸，且能阻止致病菌在腸道的定植，作者由此推斷肉桿菌是北極嘉魚腸道的固有菌群，是北極嘉魚對(duì)抗致病菌定植的天然菌群屏障的重要組成部分。此外，Olsen等[6]研究了急性應(yīng)激（養(yǎng)殖水面下降到5－10cm，用長桿追逐魚15min）和饑餓應(yīng)激對(duì)虹鱒(Oncorhynchus mykiss)消化道微生物區(qū)系的影響。電鏡結(jié)果表明，附著于后腸的微生物種類和數(shù)量均顯著下降，而糞中的微生物數(shù)量則上升，提示急性應(yīng)激可能會(huì)導(dǎo)致腸道粘膜的大量脫落。但是，也有研究表明，急性應(yīng)激和饑餓應(yīng)激11天對(duì)大西洋鮭(Salmo salar L.)腸道細(xì)菌總數(shù)和棲魚肉桿菌（Carnobacterium piscicola）沒有影響[7]。
隨著人們對(duì)魚類消化道微生物結(jié)構(gòu)和功能認(rèn)識(shí)的深入，一些學(xué)者還對(duì)魚類各段消化道微生物的分布進(jìn)行了研究，但報(bào)道的結(jié)果不一。多數(shù)研究表明，從前到后魚類各段消化道附著的微生物數(shù)量呈逐漸上升趨勢，這個(gè)結(jié)果相繼在大西洋鮭(Salmo salar)、鯡（Seriola quinqueradiata）、都花舌鰨（Solea solea）和北極嘉魚(Salvelinus alpinus
L.)消化道微生物的研究中得到證實(shí)[1，8]。與之相反，Austin等[9]報(bào)道，虹鱒各段消化道細(xì)菌數(shù)量呈逐漸下降的趨勢。而Ringo等[10]的研究發(fā)現(xiàn)北極嘉魚附著于小腸和大腸的細(xì)菌數(shù)量非常恒定。但是，目前有關(guān)有益菌（如某些乳酸菌）和致病菌（如某些弧菌）在魚類各段消化道分布的報(bào)道很少。這也制約了乳酸菌等有益菌作為益生素在魚類養(yǎng)殖過程中的應(yīng)用，因?yàn)槿绻靡嫔隰~類消化道的定植位點(diǎn)與致病菌的定植位點(diǎn)不一致，則難以發(fā)揮其益生效果[3]。因此，魚類消化道重有益菌和致病菌的分布尚須今后深入研究。
2 魚類消化道微生物的調(diào)控
魚類消化道正常菌群的建立對(duì)于消化系統(tǒng)的正常發(fā)育具有重要的作用，而且正常菌群的建立能夠作為生物屏障阻止致病菌的入侵，同時(shí)提高魚類的免疫力。因此，加強(qiáng)魚消化道微生物菌群分布和功能的研究，在此基礎(chǔ)上開發(fā)出綠色高效的益生素和化學(xué)益生素等調(diào)控魚消化道微生物菌群，保持消化道微生物區(qū)的穩(wěn)定，有望提高魚類的抗病力和生產(chǎn)性能。
2.1益生素
益生素（Probiotics）“是一類通過促進(jìn)腸道微生物平衡對(duì)宿主動(dòng)物產(chǎn)生有益影響的活的微生物飼料添加劑”[11]，最早應(yīng)用于陸生動(dòng)物。此后的研究表明益生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中亦具有一定的應(yīng)用效果。但是，水生生物由于與水環(huán)境密切相關(guān)，許多情況下有益微生物，如光合細(xì)菌可直接添加于養(yǎng)殖水體，通過拮抗病原菌、降解多余有機(jī)質(zhì)等對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物產(chǎn)生有益的影響。因此Gram等 [12]將益生素的含義擴(kuò)展為“一類通過改善微生物平衡來促進(jìn)寄主健康的活的微生物飼料添加劑”。研究表明，芽孢桿菌（Bacillus）、乳酸菌（lactic acid bacteria）、假單胞菌(Pseudomonas)和弧菌(Vibrio)均可作為水產(chǎn)動(dòng)物益生素調(diào)控消化道微生物的組成，而目前研究得最多的是芽孢桿菌和乳酸菌[3]。
芽孢桿菌(Bacillus)是一類革蘭氏陽性菌，在腸道或貯藏過程中都以內(nèi)生孢子的形式存在，因此其抗逆性很強(qiáng)。芽孢桿菌進(jìn)入腸道后，在腸道上部迅速復(fù)活，消耗大量的氧，有利于腸道固有菌群繁殖，同時(shí)有效抑制病原菌生長，維持腸道微生態(tài)平衡，促進(jìn)動(dòng)物的健康生長。目前，在水產(chǎn)養(yǎng)殖也中應(yīng)用較多的芽孢菌主要有枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）和蠟樣芽孢桿菌（Bacilis Cereus）等。Kozasa[13]用1株從土壤中分離的東洋芽孢桿菌(Bacillus toyoi)處理日本鰻鱺(Anguilla japonica)，降低了由愛德華氏菌(Edwardsiella)引起的鰻鱺死亡。華雪銘等報(bào)道，基礎(chǔ)日糧中添加0.1％的由三種芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和嗜熱球狀芽孢桿菌混合而成的益生菌，可以明顯提高暗紋東方鲀（Takifugu obscurus）幼魚的生長速度[ 14 ]。華雪銘等[15]在異育銀鯽 (Carassiusauratus gibelio)飼料中添加不同濃度的芽孢桿菌，結(jié)果表明芽孢桿菌可以極顯著地提高異育銀鯽對(duì)嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）的抵抗能力，添加量為0.2%的實(shí)驗(yàn)組異育銀鯽的相對(duì)增重率比對(duì)照組增加33%。總之，芽孢桿菌能提高魚類的存活率，促進(jìn)動(dòng)物生長，但是有關(guān)芽孢桿菌對(duì)魚類腸道菌群調(diào)控的研究較少。劉波等研究表明，基礎(chǔ)日糧中添加0.02%的地衣芽孢桿菌后，異育銀鯽增重率顯著提高，其腸道食糜中芽孢桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量大大增加，大腸桿菌的數(shù)量則顯著降低[16]。胡東興報(bào)道，從鯉魚(Cyprinus Carpio)體內(nèi)分離的地衣芽孢桿菌對(duì)氣單孢菌有生物拮抗作用[17]。因此，有關(guān)芽孢桿菌對(duì)魚類腸道菌群調(diào)控尚須今后深入研究。
乳酸菌(Lactic acid bacteria)是一類能利用可發(fā)酵糖產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌的通稱。乳酸菌通常是不運(yùn)動(dòng)、不產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性菌，可在厭氧、兼性厭氧條件下生長。乳酸菌通常耐酸，在pH為3.0-4.5時(shí)仍可生長，能耐受動(dòng)物胃腸道的酸性環(huán)境，因此乳酸菌能在恒溫動(dòng)物和魚類胃腸道中廣泛分布。其中，乳酸桿菌（Lactobacillus）、肉桿菌（Carnobacterium）等是魚類胃腸道中比較常見的乳酸菌種類?，F(xiàn)有研究顯示，餌料和水體中的有益菌進(jìn)入魚消化道后若能定植于腸道并大量繁殖，則可與消化道其它有益菌形成優(yōu)勢菌群，通過競爭營養(yǎng)物質(zhì)和腸壁附著位點(diǎn)以及分泌抑菌物質(zhì)抑制致病菌的增殖，提高魚類的抗病力。Gildberg等[18]報(bào)道，飼喂廣布肉桿菌（Carnobacterium divergens）制劑三周后，該菌成為大西洋鱈
(Gadus morhua)仔魚腸道的優(yōu)勢菌，仔魚的抗病力有一定的提高。王福強(qiáng)等[19]報(bào)道，投喂含有1.2×109cfu/g乳桿菌的飼料5 d后，牙鲆(Paralichthys olivaceus)消化道定植的乳酸菌超過106cfu/g，同時(shí)弧菌數(shù)量明顯下降，提示乳桿菌能有效抑制弧菌的生長。Campos等[20]報(bào)道，多株乳酸菌均通過產(chǎn)生細(xì)菌素抑制病原菌的生長。同時(shí)，乳酸菌在代謝過程中產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸，可降低消化道pH值。因?yàn)槎鄶?shù)致病菌難以在低pH值環(huán)境中生長良好，因此乳酸菌造成的這種低pH值環(huán)境能抑制病原菌的生長和繁殖。此外，大量研究顯示，乳酸菌是良好的免疫激活劑，添加于餌料中能有效刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)魚類的抗病力[3]。
假單胞菌(Pseudomona)為革蘭氏陰性直或略彎曲的桿菌，不產(chǎn)生芽孢。作為魚類消化道的正常菌群，某些假單胞菌具有作為益生菌的潛力[21，22]。早期研究表明，熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)能產(chǎn)生抑菌物質(zhì)抑制魚類病原菌的生長[23，24]。Gram等[12]研究表明，熒光假單胞菌AH2能體外抑制鰻弧菌(Vibrio anguillarum)的生長，體內(nèi)試驗(yàn)亦得到一致結(jié)果，即熒光假單胞菌能降低人工感染鰻弧菌虹鱒的死亡率：感染鰻弧菌7 d后試驗(yàn)組虹鱒的死亡率僅為25％，而對(duì)照組的死亡率高達(dá)47％。Spanggaard等[25]從虹鱒體表、腮和腸道分離到45株能抑制致病性鰻弧菌生長的細(xì)菌，其中28株屬于假單胞菌。作者選擇了其中9株（7株假單胞菌和2株肉桿菌）進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，結(jié)果表明6株假單胞菌能提高人工感染鰻弧菌虹鱒的存活率。然而gram等[26]研究表明，假單胞菌雖然能體外抑制殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)，但對(duì)于人工感染殺鮭氣單胞菌的大西洋鮭則沒有保護(hù)作用。因此，假單胞菌對(duì)魚類的保護(hù)作用及對(duì)消化道微生物的調(diào)控還有待深入研究。
弧菌通常菌體較小，彎曲成弧狀或逗號(hào)狀，廣泛存在于海水及淡水中，亦可見于動(dòng)物和人的消化道。雖然許多弧菌對(duì)于魚類具有一定的致病作用，但少數(shù)研究表明某些弧菌也具有一定的益生作用。Austin等[27]報(bào)道，溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)能有效降低殺鮭氣單胞菌和兩株致病性弧菌對(duì)大西洋鮭(Salmo salar)的致病作用，以該菌作為益生菌時(shí)，大西洋鮭的存活率顯著提高。Iranto等[28]報(bào)道，分離自虹鱒消化道的河流弧菌（Vibrio fluvialis）作為飼料添加劑時(shí)，人工感染殺鮭氣單胞菌虹鱒的存活率明顯提高。同一試驗(yàn)中，飼喂河流弧菌虹鱒的血清和粘膜的殺鮭氣單胞菌抗體沒有明顯提高，而紅細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞數(shù)量增加，溶菌酶活性增強(qiáng)。但是，迄今尚未見弧菌對(duì)魚類消化道微生物調(diào)控的報(bào)道。
2.2化學(xué)益生素
化學(xué)益生素一詞譯于“Prebiotics”，也稱前生素、益生元等，是一類非消化性食物成分，到達(dá)后腸后可選擇性地刺激動(dòng)物腸道有益菌的增殖，抑制潛在有害菌的增殖的作用[29]。化學(xué)益生素必須具備以下三個(gè)條件：第一，在消化道前段不會(huì)被降解和吸收；第二，作為一種或幾種腸道細(xì)菌特異性的底物，選擇性地促進(jìn)相應(yīng)細(xì)菌的增殖；第三，能夠改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)宿主健康。目前研究和應(yīng)用較多的化學(xué)益生素主要為寡糖和非淀粉多糖。陸生動(dòng)物研究結(jié)果表明，許多寡糖進(jìn)入小腸后，不能被病原菌如大腸桿菌和沙門氏菌利用，只能被有益菌如乳酸桿菌和雙歧桿菌等分解利用，從而促進(jìn)有益菌大量繁殖。同時(shí)，有益菌大量繁殖使腸道pH 值下降，這樣一方面直接抑制病原菌的生長，另一方面使腸道氧化還原電勢降低，具有調(diào)節(jié)腸道正常蠕動(dòng)的作用，間接阻止病原菌在腸道中的定植[30]。Mahious等[31]研究了菊糖和果寡糖作為化學(xué)益生素對(duì)大菱鲆（Scophthatmus maximus）生產(chǎn)性能及消化道微生物的影響。結(jié)果表明，果寡糖能顯著提高大菱鲆的生長速度。此外，飼喂果寡糖的大菱鲆腸道中分離到大量芽孢桿菌，而其它飼料組則沒有分離到芽孢桿菌，提示果寡糖能選擇性的促進(jìn)芽孢桿菌等有益菌的增殖。國內(nèi)張紅梅等[32]研究了甘露寡聚糖對(duì)生長期鯉魚的生長及腸道菌群的影響。結(jié)果表明，餌料中添加甘露寡聚糖45 d后，鯉魚腸道大腸桿菌的數(shù)量顯著降低，而乳酸桿菌和雙歧桿菌(Bifidobacterium)數(shù)量略有上升，且以添加0.3％的甘露寡聚糖試驗(yàn)組結(jié)果最為明顯。作者由此得出結(jié)論：餌料中添加0.3％甘露寡聚糖可使鯉魚養(yǎng)殖達(dá)到最好的生產(chǎn)性能，也最有利于腸道菌群的優(yōu)化。
大量研究表明，非淀粉多糖能提高魚類的免疫功能[33，34]，但有關(guān)非淀粉多糖對(duì)魚類消化道細(xì)菌菌群的調(diào)控研究很少。Ringo等[35]利用梯度稀釋平板技術(shù)和電鏡技術(shù)相結(jié)合研究了糊精和菊糖對(duì)大西洋鮭魚后腸微生物的影響。結(jié)果表明，飼喂糊精的鮭魚腸道微生物主要為葡萄球菌（Staphylococcus）、假單胞菌、微球菌（Micrococcus）等，而飼喂菊糖的鮭魚后腸道細(xì)菌數(shù)量較低，但肉桿菌、葡萄球菌、鏈球菌（Streptococcus）等革蘭氏陽性菌成為優(yōu)勢菌群，提示菊糖對(duì)大西洋鮭腸道菌群具有較好的調(diào)控作用。國內(nèi)蔡雪峰等[36]發(fā)現(xiàn)殼聚糖對(duì)虹鱒幼魚腸道菌群也有相似的影響，即飼喂殼聚糖后虹鱒幼魚腸道革蘭氏陽性菌的數(shù)量上升，而假單胞菌等革蘭氏陰性菌數(shù)量下降。最近，遲淑艷等[37]研究表明，奧尼羅非魚（Oreochromis aureus
♂×Oreochromis niloticus♀）飼料種添加1.0％～1.5％ β-葡聚糖，可以明顯改善其生長性能和抗嗜水氣單胞菌感染的能力。
總之，化學(xué)益生素作為飼料添加劑能調(diào)節(jié)魚類消化道微生物組成，提高魚類的抗病力和生產(chǎn)性能，但化學(xué)益生素對(duì)魚類消化道細(xì)菌菌群的調(diào)控機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。
2.3 中草藥
中草藥來源于天然植物，成分眾多，除含有具有直接醫(yī)療價(jià)值的有效成分外，還含有蛋白質(zhì)、多糖、脂類、微量元素、維生素等營養(yǎng)成分，這使中草藥尤其復(fù)方中藥具有多種藥理效應(yīng)。大量研究表明，中藥能夠明顯改變腸道細(xì)菌組成及數(shù)量，使有益菌類增加，并抑制條件致病菌的生長，從而有效地調(diào)節(jié)病魚胃腸道的微生態(tài)平衡。羅琳等[38]報(bào)道，穿心蓮對(duì)草魚（Ctenopharyngodon idellus）腸道細(xì)菌的種類，尤其是優(yōu)勢菌群的種類沒有明顯影響，但１％和２％的穿心蓮可降低草魚腸道內(nèi)氣單胞菌的數(shù)量。劉紅柏等[39]將5 種常用中草藥黃芩、板蘭根、黃芪、茯苓及魚腥草作為飼料添加劑飼喂鯉魚，均使鯉魚腸內(nèi)細(xì)菌數(shù)增加，并對(duì)組成產(chǎn)生影響，試驗(yàn)組出現(xiàn)了對(duì)照組所沒有的芽孢桿菌屬及棒桿菌屬（Corynebacterium）細(xì)菌，并且使優(yōu)勢菌群的組成發(fā)生了改變，不動(dòng)細(xì)菌屬明顯增加，芽孢桿菌屬所占的比率也在10%以上，而氣單胞菌屬、鄰單胞菌屬、假單胞菌屬、弧菌屬及腸桿菌科細(xì)菌數(shù)量則明顯下降。但是，由于中草藥成分非常復(fù)雜，其對(duì)魚類消化道微生物的調(diào)控機(jī)理尚不清楚，有待今后進(jìn)一步研究。
3 展望
雖然“魚類消化道微生物分布及其調(diào)控”的研究正成為當(dāng)前國際上的一個(gè)前沿研究領(lǐng)域。但是長期以來，由于傳統(tǒng)方法的嚴(yán)重制約，特別是消化道微生物區(qū)系復(fù)雜多樣且需厭氧環(huán)境，有關(guān)魚類消化道微生物區(qū)系及其調(diào)控的研究還很薄弱。這也間接導(dǎo)致了生產(chǎn)中益生素和化學(xué)益生素的使用效果不穩(wěn)定，限制了其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用。因此，加強(qiáng)魚類消化道微生物組成和結(jié)構(gòu)的研究，指導(dǎo)高效綠色的益生素、化學(xué)益生素和中草藥的開發(fā)和使用，促進(jìn)我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的同時(shí)，還將有助于從根本上解決我國水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中抗生素和其它化學(xué)藥物的長期大量使用所帶來的負(fù)面效應(yīng)，具有重要而深遠(yuǎn)的意義。



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