畜牧人

標(biāo)題: 豬繁殖與呼吸綜合征病毒地方株的分離與鑒定 [打印本頁]
作者: linyiwangzhi    時間: 2008-12-25 18:23
標(biāo)題: 豬繁殖與呼吸綜合征病毒地方株的分離與鑒定
豬繁殖與呼吸綜合征 (Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的豬的一種繁殖障礙與呼吸困難的傳染病。其特征為發(fā)病母豬厭食、發(fā)熱，懷孕后期發(fā)生流產(chǎn)、死胎和木乃伊胎，幼齡仔豬發(fā)生呼吸道癥狀[1]。1987年在美國中西部首先發(fā)現(xiàn)該病，并分離到病毒，其后在北美、歐洲、亞洲等國家流行。目前該病已在全球范圍內(nèi)傳播、蔓延[2­3]。我國郭寶清等[4]于1996年首次從暴發(fā)流產(chǎn)的胎兒中分離到PRRSV。國內(nèi)諸多血清學(xué)檢測結(jié)果表明，該病在我國許多地方已有流行[5]。河南某豬場發(fā)生臨床癥狀疑似PRRS的傳染病，用間接ELISA法檢測，呈PRRS抗體陽性。從病豬肺、淋巴結(jié)病料中分離到1株疑似PRRSV，并對其進(jìn)行了一系列的鑒定。  
1　材料與方法  
1.1　材料  
1.1.1　病料　采自河南某豬場疑似 PRRS發(fā)病仔豬肺臟及淋巴結(jié)。  
1.1.2　細(xì)胞及血清　細(xì)胞系Marc­145、Vero、PK­15均購自中國獸藥監(jiān)察所；陽性血清購自中國獸藥監(jiān)察所；陰性血清采自無PRRS病史豬場的新生仔豬血清，經(jīng)中和試驗證明為陰性。  
1.1.3　主要試劑及試劑盒　RNasin、dNTP、反轉(zhuǎn)錄  
Buffer、M­MLV、rTaq酶均購自寶生物(大連)工程有限公司；瓊脂糖為  
Sigma公司產(chǎn)品；其他常規(guī)試劑均為分析純；UNIQ­10柱式Trizol總RNA抽提純化試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。  
1.1.4　RT­PCR引物設(shè)計　根據(jù)GenBank公布的 PRRSV美洲株ORF5核苷酸序列，參照文獻(xiàn)[6]自行設(shè)計并由寶生物(大連)工程有限公司合成下述一對引物，引物擴增片段長度為 720bp；上游引物 P1 5′­CTG GAG CCG TGC TAT CAT­3′；下游引物 P2 5′­TCC ATT  
TCA TGA CAC CTG­3′。  
1.2　方法  
1.2.1　細(xì)胞培養(yǎng)　生長液為含 100 mL/L新生牛血清(NCS)的 RPMI­l640培養(yǎng)液；維持液為含 20 mL/L NCS的 RPMI­l640培養(yǎng)液。Marc­145、Vero和PK­15細(xì)胞均在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中于37 ℃培養(yǎng)至單層后傳代培養(yǎng)。  
1.2.2　病料的處理　無菌采集發(fā)病仔豬的淋巴結(jié)、肺臟、脾臟等組織并剪碎，用 Hanks液研磨并制成5倍～10倍的乳懸液，反復(fù)凍融 3次后，經(jīng)5 000 r/min離心 30 min，上清懸液用 0.22μm微孔濾膜過濾后，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?nbsp; 
1.2.3　病毒的分離　將上述處理的病料懸液 1 mL分別接種于長成單層的  
Marc­145細(xì)胞、Vero細(xì)胞和PK­15細(xì)胞，37 ℃吸附 1 h，補加維持液至 8 mL，繼續(xù)培養(yǎng) 3 d～5 d，反復(fù)凍融 3次，收獲培養(yǎng)上清液，同時設(shè)參考毒株、正常細(xì)胞作為對照。出現(xiàn)典型PRRSV細(xì)胞病變時按上述方法繼續(xù)傳代，供進(jìn)一步檢測備用，連傳5代未出現(xiàn) CPE者判為陰性。  
1.2.4　分離毒的毒價滴定(TCID50)　采用微量法按參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行，測定其在Marc­145上的   TCID50，結(jié)果按 Reed­Muench氏法計算。  
1.2.5　病毒中和試驗　采用固定病毒­稀釋血清法，按參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行，并按 Reed­Muench氏法計算中和指數(shù)。  
1.2.6　分離毒的動物回歸試驗　將 107.5TCID50/mL HN株病毒細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)口鼻途徑接種 30日齡健康豬2頭，3.0 mL/頭，并設(shè)1頭健康豬接種正常細(xì)胞培養(yǎng)物作為陰性對照，隔離飼養(yǎng)，每日測體溫，并觀察其采食、飲水、精神狀況及其他臨床表現(xiàn)，1周左右剖檢觀察其病變。然后分別采集接種豬和陰性豬的肺臟、淋巴結(jié)等組織，用作PCR檢測。  
1.2.7　RT­PCR鑒定  
1.2.7.1　病毒基因組總 RNA的提取　按總 RNA抽提純化試劑盒說明提取。  
1.2.7.2　反轉(zhuǎn)錄(RT)　0.8 μL MgCl2(25 mmol/L)、4.0 μL 反轉(zhuǎn)錄buffer (5×)、2 μL：dNTP (10 mmol/L)、1.0 μL P1 (25 pmol/L)、1.0 μL P2  (2 5 pmol/L)、1.0 μL RNasin(40 U/μL)、9.2 μL 總 RNA，然后置于 PCR儀上 65 ℃  
15 min后，加入 M­MLV(5 U/μL)  1.0 μL，最后 于42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min結(jié)束反應(yīng)。  
1.2.7.3 　PCR反應(yīng)　 1.4 μL MgCl2(25 mmol/L)、4.0 μL buffer(10×)、0.6 μL rTaq酶(5 U/μL)、10 μL模板 cDNA，置于 PCR儀中擴增。反應(yīng)參數(shù)為：95℃ 5 min； 94 ℃  
1 min，55 ℃  30 s，72 ℃ 1 min，共進(jìn)行 35個循環(huán)；最后72 ℃ 10 min。結(jié)束后將PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。  
2　結(jié)果  
2.1　病毒分離  
將過濾后的病料懸液接種于 Marc­145細(xì)胞，盲傳前 3代未出現(xiàn)CPE，至第 4代后開始出現(xiàn)規(guī)律性CPE，在 24 h～36 h出現(xiàn)約70%的CPE。病變特征為細(xì)胞折光性增強、變圓、膨大，部分細(xì)胞緊縮呈索狀隨后皺縮、脫落、形成大片空洞，與  PRRSV典型CPE相符。此毒株接種 Vero細(xì)胞和PK­15細(xì)胞不出現(xiàn) CPE，判為陰性(圖1)。
2.2　PRRSV分離株TCID50測定結(jié)果  
按Reed­Muench法計算距離比得出 TCID50結(jié)果為10­6.50/0.1 mL，即 PRRSV分離株在Marc­145細(xì)胞上的增殖毒價為 107.5TCID50/mL。  
2.3　中和試驗結(jié)果  
按 Reed­Muench法計算可知，PRRSV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清對分離病毒株的中和效價為 1∶24，即 1∶24稀釋的陽性血清可保護(hù) 50% Marc­145細(xì)胞不產(chǎn)生CPE。中和試驗結(jié)果表明，PRRSV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清能抑制該分離毒在 Marc­145細(xì)胞上增殖，此分離病毒是 PRRSV。  
2.4　動物回歸試驗結(jié)果  
將病毒細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)口鼻接種 30日齡健康仔豬后 2 d左右，仔豬開始出現(xiàn)體溫升高，并出現(xiàn)輕度的呼吸困難、四肢末梢供氧不足、耳尖發(fā)紫等癥狀。1周左右將接種豬剖檢未見明顯的病理變化，僅見肺部邊緣有少量的出血點，有時可觀察到間質(zhì)性肺炎。而對照豬則無異常變化。  
2.5　RT­PCR擴增和鑒定結(jié)果  
從分離的PRRSV分離株細(xì)胞培養(yǎng)物以及攻毒仔豬后所采取的肺臟、淋巴結(jié)等組織進(jìn)行總RNA的提取，并用設(shè)計的針對 PRRSV美洲株 ORF5所設(shè)計的引物進(jìn)行 RT­PCR反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明，前兩種材料均可擴增出 720 bp大小的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖2)。
1.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000；2.病料上清懸液 RT­PCR 產(chǎn)物；3.接種豬組織懸液 RT­PCR 產(chǎn)物；4.對照豬組織懸液 RT­PCR 產(chǎn)物(陰性對照)  
3　討論  
PRRS是1987年發(fā)現(xiàn)的一種新的豬病毒病。臨床上病豬表現(xiàn)精神沉郁、發(fā)熱、厭食及呼吸困難。母豬流產(chǎn)、死胎、不孕、假孕及產(chǎn)出弱仔，公豬性功能下降[1]。目前 PRRS已呈世界性分布，在我國也廣泛存在。從 1996年初，我國郭寶清等首次從國內(nèi)疑似PRRSV感染豬群檢出 PRRSV抗體并分離出 PRRSV起，PRRS在我國的流行范圍越來越廣，血清陽性率也呈上升趨勢，在我國的許多省、市(地區(qū))已經(jīng)分離到很多地方株。  
PRRSV為動脈炎病毒科病毒，其有著嚴(yán)格的宿主范圍，在常見的原代和傳代細(xì)胞中不能生長，在體外培養(yǎng)中，能在豬原代肺泡巨噬細(xì)胞、CL2621、MA104系的克隆株  
Marc­145生長增殖。本試驗將處理后的病料懸液接種在Marc­145上連續(xù)傳代后即出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，而將其接種在Vero、PK­15細(xì)胞則連續(xù)傳 5代都不出現(xiàn)CPE，與有關(guān)文獻(xiàn)報道相一致。  
目前，PCR方法已被廣泛應(yīng)用于PRRS臨床樣品的檢測，檢測的目標(biāo)通常是針對PRRSV基因組ORF7、ORF6或ORF1b[10]。已報道這種方法可以直接檢測 PRRSV感染的病豬血清、精子、流產(chǎn)胎兒的病理組織及感染的肺泡巨噬細(xì)胞等。本試驗根據(jù)PRRSV美洲株ORF5基因設(shè)計的一段引物，通過RT­PCR反應(yīng)能特異性擴增出 PRRSV HN株的ORF5基因片段，且證明建立的RT­PCR方法完全可以檢測病料中的 PRRSV。  
本試驗從河南某豬場疑似 PRRS發(fā)病仔豬的肺臟及淋巴結(jié)組織中分離到1株病毒，并進(jìn)行了分離和鑒定。根據(jù)分離病毒株致Marc­145的特征性病變、動物回歸試驗、毒價滴定、中和試驗以及 RT­PCR反應(yīng)，初步判斷所分離的病毒為  PRRSV。但有關(guān)該毒株的其他一些生物學(xué)特性尚待進(jìn)一步鑒定。



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