畜牧人

標(biāo)題: 豬病實(shí)驗(yàn)室常規(guī)診斷技術(shù)（連載）之六、常規(guī)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù) [打印本頁]

作者: nnii521 時間: 2009-6-19 22:01
標(biāo)題: 豬病實(shí)驗(yàn)室常規(guī)診斷技術(shù)（連載）之六、常規(guī)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

六、常規(guī)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

（一）病毒的培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)動物：家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、倉鼠
主要用于：
①
分離病毒，并借助感染范圍試驗(yàn)鑒定病毒
②
培養(yǎng)病毒，制造抗原和疫苗
③
測定各毒株之間的抗原關(guān)系，（用實(shí)驗(yàn)動物作中和試驗(yàn)和交叉保護(hù)實(shí)驗(yàn)）
④
制備免疫血清和單克隆抗體
⑤
作病毒感染的實(shí)驗(yàn)研究，包括病毒毒力測定、建立病毒病動物模型等
注意：選擇對目的病毒敏感的實(shí)驗(yàn)動物品種品系，以及適宜的接種途徑和劑量。

雞胚
（一）條件要求

SPF雞、孵化溫度38-39℃，濕度40-70%，通風(fēng)。新鮮受精卵：產(chǎn)下后不超過10天并保存10℃左右。
（二）優(yōu)點(diǎn)
組織分化程度低，可選擇不同的日齡和接種途徑，病毒易于增殖，感染病毒的組織和液體中含有大量病毒，容易采集和處理，而且來源充足，設(shè)備和操作簡便易行。
（三）接種途徑
1．
絨毛尿囊膜接種（10-12日齡雞胚）

主要用于痘病毒和皰疹病毒的分離和增殖。
1）
方法一（造人工氣室）
①
在胚胎附近近氣室處，選擇血管較少的部位，用電烙器在卵殼上烙一個直徑約3-4mm的烤焦圈。
②
用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵殼，造成卵窗。
③
在氣室端中央鉆一個小孔。
④
用針尖挑破卵窗中心的殼膜，切勿損傷其下的絨毛尿囊膜。
⑤
滴加滴生理鹽水于刺破處，用橡皮乳頭緊貼于氣室中央小孔上吸氣，造成氣室內(nèi)負(fù)壓，使卵窗部位的絨毛尿囊膜下陷而形成人工氣室，此時可見滴于殼膜上的生理鹽水迅速滲入。
⑥
用1ml注射器滴入2-3滴接種物于絨毛尿囊膜上。
⑦
用透明膠紙封住卵窗，或用玻璃紙蓋于卵窗中，周圍涂上熔化的石蠟密封，氣室中央的小孔用石蠟密封。
⑧
雞胚橫臥于卵箱中，不許翻動，保持卵窗向上。
2）方法二
①
在氣室端的卵殼上開約1.5×1.5cm的口。
②
用滅菌眼科鑷子撕去一小片內(nèi)殼膜。
③
滴入接種物。
④
用透明膠紙封閉開口。
2．
尿囊腔接種（10-11日齡）

用于正粘病毒和副粘病毒（NDV）
1）
畫出氣室和胚位
2）
在氣室接近胚位處涂沫碘酊和酒精消毒
3）
用鋼錐穿一小孔
4）
將注射器針頭沿此小孔插入0.5-1cm，注入接種物
5）
用石蠟封口，置孵卵箱中孵育，每天翻卵1-2次
3．
卵黃囊接種（6-8日齡）

主要用蟲媒病毒以及鸚鵡熱衣原體和立克次氏體等的分離和增殖。
1）
畫出氣室和胚位
2）
垂直放置在卵座上，用碘酊和酒精消毒氣室外端
3）
以鋼錐在氣室中央錐一小孔
4）
將注射器針頭沿此小孔插入3cm，注入接種物
5）
用石蠟封口，置孵卵箱中孵育，每天翻卵1-2次
4．其它接種途徑

羊膜腔接種，正粘病毒和副粘病毒

靜脈接種，藍(lán)舌病毒

腦內(nèi)接種，狂犬病毒
組織培養(yǎng)
原代細(xì)胞：應(yīng)用胰酶等分散劑將動物組織消化成單個細(xì)胞懸液，適當(dāng)洗滌以后，加入營養(yǎng)液，通常即可使其貼附于玻璃壁上，并生長增殖。
繼代細(xì)胞：將原代細(xì)胞從玻璃瓶壁上消化下來再作培養(yǎng)。
傳代細(xì)胞：由于遺傳突變或者在理化學(xué)物質(zhì)和致瘤病毒的作用下，組織培養(yǎng)細(xì)胞中有時出現(xiàn)惡性變細(xì)胞，也就是癌變細(xì)胞，這種病變細(xì)胞具有很高的增殖勢能，而且?guī)缀蹩梢詿o限地傳代。
原代細(xì)胞培養(yǎng)（以雞胚成纖維細(xì)胞為例）
1）
在無菌條件下采取9-10日齡雞胚，置滅菌平皿中，除去頭（或僅除去喙和眼）、爪和內(nèi)臟，并剪成塊。
2）
用Hanks液，充分沖洗后移入大號青霉素瓶或其它廣口瓶中，用眼科剪剪成1mm3大小的碎塊。
3）
加入Hanks液，充分沖洗，并靜置幾分鐘，待組織塊下沉，吸棄上層液體，再加洗液。如此反復(fù)沖洗2-3遍。
4）
于沉淀組織塊內(nèi)加入約4倍量的0.25%胰酶，并調(diào)整pH至7.6-7.8，振蕩混勻后置37℃水浴中感作30分鐘，每10分鐘輕輕搖動一次。
5）
取出，小心吸棄上層胰酶溶液，用洗液輕洗2次后，用大口徑吸管反復(fù)吹打，使細(xì)胞游離。
6）
用雙層或三層紗布過濾，收集濾液于離心管中，以600rpm離心沉淀5-10min，吸棄上清液，按每個雞胚5ml的量，加入營養(yǎng)液，并用吸管反復(fù)吹打，直至形成均勻的細(xì)胞懸液。
7）
細(xì)胞計(jì)數(shù)（培養(yǎng)時，使細(xì)胞達(dá)到5×105個/ml）
取細(xì)胞懸液0.5ml+2ml 0.1%結(jié)晶紫——構(gòu)椽酸（0.1mol/L）溶液，室溫或37℃溫箱中5-10分鐘，充分振蕩后進(jìn)行計(jì)數(shù)。
按白細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)算4角4個大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)（N）。每ml懸液中的細(xì)胞數(shù)（n）=N/4×10000×K（稀釋倍數(shù)）。
傳代細(xì)胞系培養(yǎng)
優(yōu)點(diǎn)：1)可以無限的傳代。

2)不少細(xì)胞系對病毒很敏感。

3)某些傳代細(xì)胞系能在懸浮培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，適合病毒抗原的大量生產(chǎn)。

4)生長旺盛，繁殖快速，對營養(yǎng)條件不苛刻。
缺點(diǎn)：在傳代過程中遭到支原體和病毒的污染。
細(xì)胞分散劑
1．
胰酶
使精氨酸或賴氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之間的多肽鏈發(fā)生水解，導(dǎo)致細(xì)胞間質(zhì)水解而使細(xì)胞或組織塊消化為分散的單個細(xì)胞。
2．
乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）
營養(yǎng)液
1．
人工綜合營養(yǎng)液
氨基酸、糖類、無機(jī)鹽類、維生素、輔酶、嘌呤、嘧啶、輔助生長因子。
2．
血清
1）
動物血清中含有細(xì)胞生長所必須的各種營養(yǎng)因子。
2）
促進(jìn)細(xì)胞的貼壁和生長。
3）
具有很強(qiáng)的酸堿緩沖作用。

（二）病毒感染力的滴定

LD50，EID50，TCID50
（TCID50的測定）
1．
在青霉素瓶中將病毒作連續(xù)10倍的稀釋，從10-1— 10-10。
2．
將稀釋好的病毒接種到96孔微量培養(yǎng)板中，每一稀釋度作8孔，每孔接種100ul。
3．然后在每孔加入細(xì)胞懸液100ul，使細(xì)胞量達(dá)到3×105個/ml。
4．設(shè)正常細(xì)胞對照，正常細(xì)胞對照作兩縱排。
5．逐日觀察并紀(jì)錄結(jié)果，一般需要觀察5-7天。
6．結(jié)果的計(jì)算，按Reed-Muench兩氏法或Karber法進(jìn)行。
TCID50的計(jì)算方法：
1．Reed-Muench法

file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image001.gif病毒液稀釋度	出現(xiàn) CPE孔	不出現(xiàn)CPE孔	累計(jì) 出現(xiàn)CPE孔不出現(xiàn)CPE孔		出CPE的孔所占的%
10-1	8	0	27	0	100（27/27）
10-2	8	0	19	0	100（19/19）
file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image002.giffile:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image003.gif10-3	7 3 1	1 5 7	11	1	91.6(11/12)
10-4			4	6	40（4/10）
10-5			1	13	0.7（1/13）
10-6	0	8	0	21	0（0/21）

高于50%的百分?jǐn)?shù)-50%

91.6-50
file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image004.giffile:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image005.gif距離比例=
=
=0.8

高于50%的百分?jǐn)?shù)-低于50%的百分?jǐn)?shù)
91.6-40
lgTCID50=距離此例X稀釋度對數(shù)之間的差+高于50%病變率的稀釋度的對數(shù)

=0.8×(-1)+(-3)=-3.8

TCID50=10-3.8
2. Karber法
病毒液稀釋度
出現(xiàn)CPE孔的比率
10-1

8/8=1
10-2
8/8=1
10-3

7/8=0.875
10-4

3/8=0.375
10-5

1/8=0.125
10-6

0/8=0
lgTCID50=L-d(s-0.5)
L: 最高稀釋度的對數(shù)
D：稀釋度對數(shù)之間的差
S：陽性孔比率總和
lgTCID50=-1-（-1）×(3.375-0.5)

=-3.875
TCID50=10-3.875/0.1ml

（三）病毒中和試驗(yàn)

一、原理
抗體與相應(yīng)的病毒粒子特異性地結(jié)合，使后者喪失感染能力。
二、用途
1. 疾病診斷。
2. 病毒分離株的鑒定。
3. 不同病毒株的抗原關(guān)系研究。
4. 疫苗免疫原性的評價。
5. 免疫血清的質(zhì)量評價。
6. 測定實(shí)驗(yàn)動物血清中是否存在抗體等。
三、分類
（一）終點(diǎn)法中和試驗(yàn)
1. 固定病毒——稀釋血清法。
1)
將測好TCID50的病毒稀釋成200個TCID50的病毒懸液。
2)
在96孔微量培養(yǎng)板中將血清作連續(xù)倍比稀釋（具體方法是在96孔板中先加入50ul生長液，再加50ul待檢血清，混勻后，吸50ul至下一孔，如此下去。一直到1:256），每個稀釋度作4孔。
3)
在上述各孔內(nèi)加入50ul稀釋好的病毒液，混勻后放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中作用45min-60min。
4)
同時設(shè)待檢血清毒性對照，陰、陽性血清對照，病毒對照和正常細(xì)胞對照。
5)
感作完成后每孔加入100ul細(xì)胞懸液，放37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐日觀察并記錄結(jié)果。

6)
結(jié)果計(jì)算，按Reed-Muench兩氏法或Karber法進(jìn)行。

Reed-Muench計(jì)算方法：

血清稀釋度	CPE孔數(shù)	無CPE孔數(shù)	累計(jì) CPE孔數(shù) 無CPE孔數(shù) 保護(hù)率（%）
1:4（10-0.6）	file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image006.gif0	file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image007.gif4	0	9	100
1:16（10-1.2）	1	3	1	5	83
1:64（10-1.8）	2	2	3	2	40
1:256（10-2.4）	4	0	7	0	0
1:1024（10-3.0）	4	0	11	0	0

高于50%的保護(hù)率-50%

file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image008.gif距離比例=

高于50%的保護(hù)率—低于50%的保護(hù)率

83-50
file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image009.gif

=
= 0.7

83-40
高于50%的保護(hù)率血清稀釋度的對數(shù)+距離比例×稀釋系數(shù)的對數(shù)
=-1.2+0.77×(-0.6)
=-1.66

-1.66的反對數(shù)=1/46
即：1:46稀釋的待檢血清可保護(hù)50%的組織培養(yǎng)細(xì)胞免于出現(xiàn)CPE。
2. 固定血清——稀釋病毒法。
1) 將病毒作連續(xù)10倍稀釋
1）
將稀釋好的病毒接種96孔板，每個稀釋度接種一縱排共8孔，每孔50μl，做兩塊板子，在一塊板子的每孔加入50μl待檢血清（試驗(yàn)組），另一塊板子的每孔加入50μl正常血清（對照組），混合后置37℃
5%CO2培養(yǎng)箱作用1h。
2）
然后在每孔中加入100μl細(xì)胞。
3）
另外還設(shè)兩縱排正常細(xì)胞對照。
4）
置37℃
5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐日觀察并記錄結(jié)果。
5）
分別計(jì)算每組病毒的TCID50，然后計(jì)算血清的中和指數(shù)。

試驗(yàn)組TCID50
file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image010.gif中和指數(shù)=

對照組TCID50
(二) 蝕斑（痘斑）減數(shù)試驗(yàn)
1、蝕斑技術(shù)
病毒蝕斑：又稱空斑，指病毒在已長成的單層細(xì)胞上形成的局限性病灶。
原理：將病毒懸液作連續(xù)的10倍稀釋，隨后各取定量，接種于已經(jīng)長成單層的敏感細(xì)胞上，并覆蓋中性紅瓊脂糖，待其出現(xiàn)蝕斑后計(jì)數(shù)，即可算出每毫升病毒懸液中所含的蝕斑單位。
用途：①用于病毒純化；②測定病毒懸液中感染病毒的含量。
2、蝕斑減數(shù)試驗(yàn)

將病毒——正常血清混合物以及病毒——待檢血清混合物分別接種到單層細(xì)胞上，隨后覆蓋營養(yǎng)瓊脂或甲基纖維素，進(jìn)行蝕斑測定，比較病毒——正常血清組和病毒——待檢血清組產(chǎn)生的蝕斑數(shù)，兩者的差數(shù)表示待檢血清的中和能力。以試驗(yàn)組的蝕斑數(shù)比對照組減少50%作為判定依據(jù)，血清稀釋度就是其蝕斑減數(shù)試驗(yàn)效價。
(三) 交叉保護(hù)試驗(yàn)

先將實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行主動免疫或被動免疫，然后以待檢病毒進(jìn)行攻擊，根據(jù)實(shí)驗(yàn)動物被保護(hù)的情況，判定待檢V的種類或型別。其缺點(diǎn)是試驗(yàn)周期太長，并且需要大量的實(shí)驗(yàn)動物。
用途：（1）應(yīng)用已知V鑒定未知V

（2）應(yīng)用已知免疫血清鑒定未知V

（3）應(yīng)用已知V鑒定未知血清

（四）病毒的分離和鑒定
病毒材料的注備
1．
腦、肝、肌肉等器官或組織

充分研磨后加入5倍量的Hank’s液（內(nèi)含P.S各200V/ml）反復(fù)凍融三次。2000rpm 10min，取上清作接種物。
2．
鼻液、乳汁、膿汁等分泌物或滲出物

用內(nèi)含青、鏈霉素100u/ml的Hank’s液，將其稀釋3-5倍，充分混勻懸浮后，置4℃冰箱內(nèi)感作2-4h或過夜，200rpm 10min取上清作接種物。
3．
咽喉拭子或鼻拭子

仔細(xì)用棉拭子擦拭咽喉部，并迅速將其泡入盛有2-5ml Hank’s液的（200-500u/ml P.S）試管內(nèi)，充分涮洗棉拭子，反復(fù)凍融3-5次，收集液體部分，2000rpm 10min，收集上清作接種物。
4．
糞便

用含100u/ml P.S的Hank’s液作10-20倍稀釋，4℃感作4h，2000rpm 10min取上清作接種物。
5．
無菌的體液或雞胚液

直接接種用。

接種方法
1．
實(shí)驗(yàn)動物
2．
雞胚
目前常用雞胚分離的病毒有正粘V、副粘V、痘V、腦炎V及引起禽類疫病的其它許多V。
3．
組織培養(yǎng)細(xì)胞。

病毒增殖的判定
1．
細(xì)胞病變（CPE）
2．
抗原的測定
3．
中和試驗(yàn)
4．
病毒間的干擾現(xiàn)象
file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image011.gif乙型腦炎V
脊髓灰質(zhì)炎V
file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image012.gif流感V
西方馬腦炎V
file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image013.giffile:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image012.gif
豬傳染胃腸炎
牛病毒性膜炎
粘膜病V
5．
電子顯微鏡觀察
6．
實(shí)驗(yàn)動物或雞胚接種

病毒感染力的滴定

LD50、EID50、TCID50

病毒理化學(xué)特性的測定
1．
病毒核酸型鑒定（藥物抑制試驗(yàn)）
FUDR、IVDR、BRUDR
原理：FUDR、ICDR、BRUDR是嘧啶的鹵化物，進(jìn)入cell后發(fā)生磷酸化，摻入新合成的DNA以代替胸腺嘧啶產(chǎn)生至功能分子，從而抑制DNA的合成。常用濃度為50ug/ml。
2．脂溶劑敏感性試驗(yàn)
1）
乙醚敏感試驗(yàn)

取同批病毒分裝于兩個青霉素瓶中，每瓶16ml，在其中1瓶加入麻醉用乙醚，使終濃度為20%，兩瓶均用橡皮塞塞緊后，置4℃凍箱內(nèi)作用24h，其間不時振蕩，隨后以2000rpm離心20min。已加乙醚的小瓶，用毛細(xì)吸管吸取病毒液，移入另一小瓶內(nèi)，適當(dāng)吹打，使殘余乙醚揮發(fā)殆盡，然后滴定兩組病毒的TCID50。
2）
氯仿敏感性試驗(yàn)

向病毒液內(nèi)加入分析純氯仿，使其終濃度為4.8%，置4℃振蕩混合10min。隨后500rpm 5min，然后吸取上層液體，滴定病毒TCID50。對照組病毒加入終濃度為4.8%的生理鹽水，同樣處理和滴定。
3．胰蛋白酶敏感試驗(yàn)
脊髓灰質(zhì)炎V、豬傳染性胃腸炎V對胰酶有較強(qiáng)的抵抗力，痘V、呼腸孤V、皰疹V易被胰酶滅活。取病毒液兩瓶，每瓶1ml,在其中1瓶加入1ml 1%的trypsin，使終濃度為0.5%，另一瓶加入1ml 1640（培養(yǎng)基），用橡皮塞塞緊瓶口，將小瓶倒轉(zhuǎn)幾次，使其充分混合，置37℃1h，隨即加入滅活犢牛血清8ml，充分混合，終止胰酶的作用。最后滴定兩瓶V的TCID50。
4．
耐酸性試驗(yàn)

pH3.0 2h or pH5.0 1h

取等量病毒液兩瓶，用0.1mol/L HCL將1個小瓶中的病毒液的pH調(diào)至3.0(or 5.0)，并在另一個小瓶內(nèi)加入相同于用酸量的培養(yǎng)基作為對照，置37℃水溶或室溫中感作2h(or 1h)，再用5.6%NaHCO3溶液將pH調(diào)回至7.2左右，對照組再加緊入相同于NaHCO3量的培養(yǎng)基，測定兩者的TCID50。
5．
耐熱性試驗(yàn)

將病毒液分成等量的11小瓶，其中4小瓶分別置50℃、60℃、70℃、80℃水溶中1h，另6瓶置50℃水浴中分別感作5、10、15、30、60和180min，隨后測定每瓶V的感染X。
6．
病毒粒子大小測定
1)電子顯微鏡直接觀察（透射電鏡、磷鎢酸負(fù)染）
2)超速離心沉淀
3)濾過試驗(yàn)
取澄清的病毒液20ml，留出1ml作為對照，將剩余的19ml病毒液在正壓下依次通過孔經(jīng)為450nm、225nm、100nm和50nm的各級微孔，每通過一種孔徑的濾膜就吸取1ml濾液用為樣品，并將剩余的濾液通過一次濾膜。最后測定原病毒液以及各級濾液的TCID50。

病毒液種類
TCID50/0.1ml

濾前病毒液

10-6.75

450nm孔徑液
10-6.23

225nm孔徑液
10-5.78

100nm孔徑液
10-4.50

50nm孔徑液
10-0.50
免疫——血清學(xué)檢查
目的：①新分離毒株的種類及型別的鑒定。

②檢測發(fā)病動物體液中的Ab，或進(jìn)一步比較動物急性發(fā)病期和恢復(fù)期血清中的Ab效價，了解病毒性Ab是否有明顯的增長，從而判定V感染的存在。
（一）
中和試驗(yàn)
1．
終點(diǎn)法中和試驗(yàn)
固定病毒——稀釋血清法中和試驗(yàn)
固定血清——稀釋病毒法中和試驗(yàn)
2．
蝕斑（痘斑）減數(shù)試驗(yàn)
1）
蝕斑技術(shù)
病毒蝕斑，又稱空斑，指病毒在已長成的單層細(xì)胞上形成的局限性病灶。
原理：將病毒懸液作連續(xù)的10倍稀釋，隨后各取定量，接種于已經(jīng)長成單層的敏感細(xì)胞上，并覆蓋中性紅瓊脂糖，待其出現(xiàn)蝕斑后計(jì)數(shù)，即可算出病毒懸液中每毫升所含的蝕斑單位。
用途：①用于病毒純化；②測定病毒懸液中感染病毒的含量。
2）
蝕斑減數(shù)試驗(yàn)

將病毒——正常血清混合物以及病毒——待檢血清混合物分別接種到單層細(xì)胞上，隨后覆蓋營養(yǎng)瓊脂或甲基纖維素，進(jìn)行蝕斑測定，比較病毒——正常血清組和病毒——待檢血清組產(chǎn)生的蝕斑數(shù)，兩者的差數(shù)表示待檢血清的中和能力。以試驗(yàn)組的蝕斑數(shù)比對照組減少50%作為判定依據(jù)，血清稀釋度就是其蝕斑減數(shù)試驗(yàn)效價。
3．
交叉保護(hù)試驗(yàn)

先將實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行主動免疫或被動免疫，然后以待檢病毒進(jìn)行攻擊，根據(jù)實(shí)驗(yàn)動物被保護(hù)的情況，判定待檢V的種類或型別。其缺點(diǎn)是試驗(yàn)周期太長，并且需要大量的實(shí)驗(yàn)動物。
用途：（1）應(yīng)用已知V鑒定未知V；

（2）應(yīng)用已知免疫血清鑒定未知V；

（3）應(yīng)用已知V鑒定未知血清。

（五）凝集試驗(yàn)

定義：

顆粒性抗原（如細(xì)菌、紅細(xì)胞等）或表面載有抗原的顆粒狀的物質(zhì)（如聚苯乙烯膠乳、紅細(xì)胞、炭素顆粒等），與相應(yīng)抗體在電解質(zhì)存在下凝集成團(tuán)的試驗(yàn)。
分類
file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image014.gif
直接凝集試驗(yàn)：顆粒狀A(yù)g與相應(yīng)Ab所發(fā)生的凝集反應(yīng)。（布氏桿菌）

間接凝集試驗(yàn)（被動凝集試驗(yàn)）：可溶性抗原吸附到載體顆粒表面，與相應(yīng)抗體所發(fā)生的凝集反應(yīng)，可以證明相應(yīng)抗體的存在并測定效價。反相問接凝集試驗(yàn)（反向被動凝集試驗(yàn)）：將抗體吸附到顆粒表面與相應(yīng)抗原所發(fā)生的凝集反應(yīng)。
file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image015.gif
間接血凝試驗(yàn)

膠乳凝集試驗(yàn)

炭凝集試驗(yàn)
間接凝集試驗(yàn)

皂土凝集試驗(yàn)

脂質(zhì)體凝集試驗(yàn)
file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image016.gif
間接凝集抑制試驗(yàn)：先將被檢的抗體（或抗原）與已知的抗原（或抗體）作用后，再與抗體（或抗原）致敏的顆粒時行反應(yīng)。

反向凝集抑制試驗(yàn)

間接凝集試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)：快速、簡便、特異、敏感
間接血凝試驗(yàn)（IHA）（PHA）

口蹄疫、豬瘟、弓形體、胸膜肺炎、衣原體

反向IHA：FMDV、水皰病病毒Ag、豬傳染笥胃腸炎病毒Ag、小鵝瘟病毒Ag等。
紅細(xì)胞作為載體的優(yōu)點(diǎn)：
1．
來源廣泛，容易取得。
2．紅細(xì)胞表面幾乎可以吸附任何一類的Ag或Ab，如蛋白質(zhì)、糖蛋白、核蛋白以及多糖等。
3．具有天然的均一性，比其它許多載體都更容易標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)格化。
缺點(diǎn)：容易破裂、難于保存
IHA的優(yōu)點(diǎn)：
①敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性和穩(wěn)定性好，操作簡便、反應(yīng)迅速。
②既可定性又可半定量，而且試劑價格低廉，不需要特殊、復(fù)雜的設(shè)備。
注意：影響紅細(xì)胞凝集的因素很多：紅細(xì)胞的來源，致敏條件、操作技術(shù)、標(biāo)本中的雜質(zhì)、細(xì)菌污染和類屬Ag常引起非特異性凝集反應(yīng)。
1．
紅細(xì)胞的選擇和保存
選擇：許多種類動物的紅細(xì)胞，包括人的0型紅細(xì)胞都可用，但用得最多的是綿羊紅細(xì)胞。
保存：用玻璃珠脫纖法采集或用肝素抗凝。
②無菌的紅細(xì)胞在4℃冰箱中可保存3-4天。
②采血時加等量氏液和適量抗生素，4℃保存2周，但這樣紅細(xì)胞致敏時容液自凝。
2．
紅細(xì)胞的醛化
醛化劑：甲醛、戊二醛、丙酮醛、丙酮醛—甲醛雙固定、戊二醛—丙酮醛雙固定。
1）
無菌采取綿羊靜脈血，加至紅細(xì)胞保存液內(nèi)，4℃保存?zhèn)溆谩?/font>
2）
取紅細(xì)胞懸液1份，加入10倍量0.1mol/L、PH7.2磷酸緩沖液（PH7.2PB），洗5遍，并以該液配成8%紅細(xì)膩懸液。
3）
紅細(xì)胞懸液1份+3%丙酮醛液等量，24左右的室溫中用電磁攪拌器緩慢攪拌17h。PH7.2PB配成8%懸液，——丙酮醛固定紅細(xì)胞懸液。
4）
丙酮醛固定紅細(xì)胞懸液1份+等量3%甲醛液，如上攪拌17hr。
5）
再以PH7.2PB液洗5遍，最后用內(nèi)含0.1%疊氮鈉的ph7.2PB配成20%的紅細(xì)胞懸液，分裝后置4℃冰箱內(nèi)保存，可用2個月—雙醛化紅細(xì)胞懸液。
3．紅細(xì)胞的鞣化
作用：可增加紅細(xì)胞吸附蛋白質(zhì)的能力，新鮮紅細(xì)胞用1：200000濃度的鞣酸，醛化紅細(xì)胞用1：100000濃度的鞣酸。
程序：取紅細(xì)胞，用PH7.2PB洗4—5遍，并用同液配成2.5%懸液，同時以PH7.2PB臨時配制1：200000優(yōu)質(zhì)鞣酸，將其與紅細(xì)胞懸液等量混合，37℃水浴咸作15min。取出后用ph7.2PB洗一次，再用PH7.2pB配成20%紅細(xì)胞懸液。
4．致敏紅細(xì)胞的制備：
1）
抗體致敏紅細(xì)胞

取20%鞣化或未鞣化的雙醛化紅細(xì)胞懸液1ml，離心沉淀，棄去上清液，將沉淀紅細(xì)胞重新懸浮于0.1mol/L.PH3.5~4.0醋酸緩沖液10ml中，加入等量的提純IgG液（每毫升需含IgG100~300g）置37℃水浴中咸作2-4h，每15-20分釧用吸管輕輕吹吸混合2-3次。以ph7.2PB洗5遍，再將沉淀紅細(xì)胞用1%滅活免血清鹽水配成0.8%懸液備用。—— Ab致敏紅細(xì)胞懸液。
2）
抗原致敏紅細(xì)胞

取PBS（PH6.4）4ml病毒抗原1ml，2.5%鞣酸化紅細(xì)胞懸液1ml，混勻后，置室溫下振蕩結(jié)合30—60min（隨病毒Ag種類不同）或37℃水浴30-45min，其間適當(dāng)振搖。隨后以1500rpm離心沉淀10min，并用2倍量的PH7.2PB(內(nèi)含1%滅活兔血清)洗2遍后，配成1%的致敏紅細(xì)胞懸液供試驗(yàn)用。以病毒致敏的紅細(xì)胞懸液應(yīng)立即使用。4℃冰箱保存，不宜超過2天。
※致敏紅細(xì)胞的保存：用1%兔血清鹽水或0.4%明膠緩沖液洗滌，并用其配成2.5%懸液保存?zhèn)溆谩ｉL期保存：用含1%糖和4%兔血清的生理鹽水，將致敏紅細(xì)胞配成10%懸液，然后于真空中冷凍干燥。
乳膠凝集試驗(yàn)
乳膠的預(yù)處理

取空白乳膠用PBS（PH7.4）配成2%溶液，加入10%的胰蛋白酶液，使其終濃度為1%，于56℃水溶作用18-24h，其間搖動幾次，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩谷槟z穩(wěn)定并減少非特異性凝集。（離心上清，將沉淀用PBS懸浮配成2%乳膠溶液）
乳膠的致敏
1．

將濃縮的病毒抗原作倍比稀釋（PBS），加入等量的2%空白乳膠中（逐滴加入，邊加邊搖動）。37℃作用15-30min。
2．

加入10%牛血清白蛋白，使終濃度為1%，混合均勻，37℃ 15-30nin，或2h，即得乳膠抗原。

（六）標(biāo)記抗體技術(shù)（免疫標(biāo)記技術(shù)）

原理： 抗體能追蹤抗原，在抗原所在部位與之結(jié)合，一旦結(jié)合后就不易洗脫。但此種結(jié)合反應(yīng)肉眼不易察出。有一些物質(zhì)在超微量時，即能用某種特殊理化因素將其檢測出來。如將這些構(gòu)標(biāo)記在抗原或抗體分子上，就能利用調(diào)換體與原特異結(jié)合的特性，檢測抗原或抗體，即免疫標(biāo)記技術(shù)。
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熒光抗體技術(shù)（免疫熒光技術(shù)）
分類：
酶標(biāo)記抗體技術(shù)（免疫酶技術(shù)）

同位素標(biāo)記抗體技術(shù)（放射免疫測定技術(shù)）

鐵蛋白標(biāo)記抗體技術(shù)
免疫熒光技術(shù)
基本方法和原理
1．
直接法

將標(biāo)記的特異熒光抗體，直接加在Ag標(biāo)本上，經(jīng)一定溫度和時間的染色，用水洗去來參加反應(yīng)的多余熒光抗體，室溫干燥后封片，鏡檢。優(yōu)點(diǎn)：方法簡便，非特異熒光染色因素少。缺點(diǎn)：不夠敏感，且一種標(biāo)記抗體只能檢測一種Ag。
2．
間接法

既可檢查抗體，也可檢查抗原。
1）
檢查抗原

用已知未標(biāo)記的特異抗體（一抗）與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)，用水洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗體（二抗）與抗原標(biāo)本反應(yīng)，使之形成抗原一抗體——抗抗體復(fù)合物，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗抗體，干燥封片后鏡檢。
2）
檢查Ab

Ab標(biāo)本為已知的，待檢血清為第一抗體，其它步驟同上。缺點(diǎn)：但特異性較差?？赡苁情g接法的中間層可結(jié)合更多的標(biāo)記抗體所致。優(yōu)點(diǎn)：敏感性高，且標(biāo)記一種抗體球蛋白抗體，可用于多種抗原，抗體系統(tǒng)的檢查。既可檢測Ag，也可檢測Ab。
3．
補(bǔ)體法

應(yīng)用補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)的原理，用熒光素標(biāo)記抗補(bǔ)體抗體，鑒定未知Ag或未知Ab。先將未標(biāo)記的Ab和補(bǔ)體加在Ag標(biāo)本上，使其發(fā)生反應(yīng)，隨后再加標(biāo)記抗體抗體，使之形成Ag— Ab—cb抗補(bǔ)體復(fù)合物。缺點(diǎn)：特異性較差。優(yōu)點(diǎn)：敏感性高。標(biāo)記一種抗體補(bǔ)體Ab，可用于各種Ag—Ab系統(tǒng)的檢查（可用于各種動物）
間接法：雙層法、混合法、三層法。補(bǔ)體法：抗體一抗補(bǔ)體法、異屬補(bǔ)體結(jié)合法。涂片壓印片、冰凍切片、石蠟切片、組織培養(yǎng)物、可溶性Ag標(biāo)本（醋酸評維素膜）。
放射免疫測定技術(shù)
原理：用放射性同位素標(biāo)記已知的Ab或Ag，用以檢測被檢材料中Ag 或Ab。隨后根據(jù)Ag—Ab復(fù)合物中的同位素放射性強(qiáng)度進(jìn)行定性或定量的測定。優(yōu)點(diǎn)：敏感性和特異性都很強(qiáng)。缺點(diǎn)：射線污染。
分類和操作原理：
（一）
液相放射免疫測定
1．
直接法（Ag、Ab）

用放射性同位素標(biāo)記病毒Ag或Ab。檢測相應(yīng)的Ab 或Ag。主要同于顆粒性物質(zhì)，如懸浮細(xì)胞內(nèi)病毒抗原的初步檢測，檢測Ag時，通過超速離心將Ag—Ab復(fù)合物沉淀下來，分別檢測沉淀物和上清液中的放射性強(qiáng)度，檢測Ab時，在Ab、Ag感作以后，再加入適當(dāng)濃度（40-50%飽和度）的硫酸銨，叫Ag—Ab復(fù)合物鹽析沉淀，而Ag仍處于溶解狀態(tài)。
2．
間接法（主要用于病毒抗體的檢測）

被檢血清+ Ag+二抗離心沉淀
3．
競爭法（主要用于病毒抗原的檢測）

被檢抗原+標(biāo)定濃度的特異抗體，混合咸作一定時間再加入標(biāo)定量的放射性同位素標(biāo)記抗原—離心沉淀。
（二）
固相放射免疫測定（聚苯乙烯小管或微量滴定板上，或者用溴化氫、二醛等將Ab偶聯(lián)或共價聯(lián)結(jié)于瓊脂糖珠或纖維素等表面）
1．
夾心法

Ab+待檢Ag+標(biāo)記Ab
2．
夾心間接法，與上法相比，敏感性更強(qiáng)。

Ab包被+待檢Ag+另一動物的抗病毒Ab+同位素標(biāo)記的抗第二次Ab的抗抗體
3．
競爭法

Ab包被+待檢抗原+標(biāo)記Ag
file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image009.gif
兩者同時加入or待檢Ag先加
4．
阻斷試驗(yàn)法

Ab包被+已知Ag+被檢血清+同位素標(biāo)記的Ab。
（三）
放射免疫自顯影

用同位素標(biāo)記Ab or Ag，然后進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)或免疫電泳對流免疫電脈，檢測相應(yīng)的Ag or Ab。擴(kuò)散或電泳完畢后，將瓊脂板置于鹽水和ddH2O中充分浸泡，除去未結(jié)合的標(biāo)記Ab或Ag。干燥后，覆蓋X光膠片，置暗室中曝光1-2天。經(jīng)過顯影和定影，即可在X光膠片上顯示特異的沉淀線。
免疫酶技術(shù)
file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image018.gif免疫酶染色法
抗酶抗體法
放大抗體法：同時使用酶標(biāo)記抗體和抗酶抗體
1．
酶標(biāo)記抗體法
1）
直接法

用酶標(biāo)記的特異性Ab，直接檢測病毒或病毒Ag。在將含有uirus或virus Ag的組織和細(xì)胞標(biāo)本固定的消除其中的內(nèi)源性酶以后，應(yīng)用酶標(biāo)記Ab直接處理，隨后滴加底物顯色，直接鏡檢。
2）
間接法

將含有V或V Ag的組織或細(xì)胞標(biāo)本，先用特異性V Ab處理，充分涮洗后，再用酶標(biāo)記的抗體處理，使其形成Ag-Ab-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，最后滴加底物，鏡檢。
2．
抗酶抗體法

不需進(jìn)行酶的標(biāo)記，比前都簡便和靈敏
1）
免疫球蛋白橋法
搭橋：用二抗（如抗兔IgG的抗體）將抗體和已結(jié)合在病毒抗原上的同種動物（兔）特異性Ab連接起來。

加酶，形成Ag+Ab+抗抗體+抗酶抗體+酶加底物顯色、鏡檢。
2）
可溶性酶——抗酶復(fù)合物法（PAP）
3）
雜交抗體法

將來自同種動物的抗IgG抗體（或其Fab碎片）與抗酶抗體（或其Fab碎片）結(jié)合起來，使之成為一種具有抗IgG和抗酶雙重活性的雜交抗體。再用這種雜交抗體進(jìn)行免疫酶染色。Ag+Ab+雜交Ab+酶
（一）
免疫酶測定法

固相免疫酶測定法：利用固相載體，以化學(xué)的或物理的方法將Ag或Ab聯(lián)接于其上，制成免疫吸附劑，隨后進(jìn)行免疫酶測定。

均相免疫酶測定法：不需將游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物分離，也不需要載體，直接從溶液中測定結(jié)果。
1．
固相免疫酶測定法

根據(jù)固相載體的種類和免疫吸附劑的制備方法。分為兩類：、
1）
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)或測定法（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）。
①
間接法，用Ag包被板子+Ab（未知）+抗Ab+酶底物顯色
②
雙抗體夾心法，用于檢測Ag。Ag+Ag（未知）+抗Ab+酶底物顯色
③
競爭法：（測定Ag）

利用酶標(biāo)記Ag和未標(biāo)記Ag共同競爭有限量的Ab，測定樣品中的Ag。需同時微只加酶標(biāo)記Ag的系統(tǒng)作對照。Ab+待檢Ag和酶標(biāo)記Ag（與可先加待檢樣品，稍后再加酶標(biāo)記Ag）。對照組：只加酶標(biāo)記Ag。
④
夾心間接法

應(yīng)用酶標(biāo)記抗抗體測定Ag。Ab+Ag（待檢）+不同種動物的同的Ab+酶標(biāo)抗第二種抗體的動物球蛋白（二抗）
2）
特定Ag基質(zhì)球法（Defined antigen substrate sphere, DASS）

應(yīng)用溴化氰活化的瓊脂糖球作為固相載體，將Ag或Ab結(jié)合于其上，制成免疫吸附劑。
2．均相酶免疫試驗(yàn)（酶放大免疫試驗(yàn)）

利用競爭原理，將含有小分子半Ag的樣品，酶標(biāo)半Ag及相應(yīng)Ab混合感作，隨后測定酶的活性。如果樣品中主要用于激素、抗菌素和嗎啡微生物等小分子半Ag的檢測，沒有半Ag，則酶標(biāo)半Ag與Ab結(jié)合，酶的活性受到抑制。
ELISA的操作要領(lǐng)：
1．
固相載體的選擇
file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/msohtml1/01/clip_image019.gif聚苯乙烯微量反應(yīng)板

PVC塑料軟板

硝酸纖維素膜，斑點(diǎn)——ELISA（Dot—ELISA）

疏水聚酯布，布——ELISA（C-ELISA）
2．
預(yù)備試驗(yàn)

確定酶結(jié)合物、包被抗原或抗體的最適濃度，底物的最適反應(yīng)時間。
1）
酶結(jié)合物的確定

用PH9.6的碳的酸鹽緩沖液將IgG稀釋至100ug/ml,加入固相載體的每一孔中進(jìn)行包被,洗滌后將酶結(jié)合物以1:200,1:400,1:800……作系列稀釋,依次加入各孔,每一稀釋度加2孔。反應(yīng)完畢后加底物顯色，以能產(chǎn)生光吸收值（A）為1.0的稀釋度為結(jié)合物的最適濃度。
2）
包被蛋白質(zhì)濃度的確定

將欲包被的蛋白質(zhì)用PH9.6的碳酸鹽緩沖液作1：10，1：20，1：40…….系列稀釋，每一稀釋度包被2個孔，然后進(jìn)行常規(guī)的ELISA操作。以能產(chǎn)生光吸收值（A）為1.0的稀釋度為包被蛋白質(zhì)的最適濃度。
3）
底物最適作用時間的測定

以最適稀釋度Ag和酶結(jié)合物進(jìn)行試驗(yàn)，加入底物后在不同時向終止反應(yīng)，即可確定最適反應(yīng)時間。
3．
包被
1）
載體
2）
包被液的PH：通常用PH9.5~9.6,0.05mol.L or 0.1mol/L的碳酸鹽緩沖液稀釋Ag or Ab。吸咐時的PH一般為9.0左右。如PH較低，則吸附時間延長，但PH低于6.0則非特異性吸附增加。
3）
吸附時間與溫度，一般為4℃過夜，有時也可采用37℃吸附1-5h。
4）
蛋白質(zhì)濃度，在固相載體上，每孔加入量一般為0.1-100us/ml。濃度太高，令固Ag或Ab蛋白分子之間的相互作用較大而影響載體對蛋白質(zhì)的吸附，濃度太低，則感染性下降。
4．
洗滌，將載體各也甩干，再加洗滌充滿各孔，靜置3-7min如此重復(fù)3次。

常用的洗滌液：含有0.05%吐溫-20，0.01mol/L
PH7.4的PBS或含有0.05%吐溫-20，0.01mol/L
PH7.4的Tris-cl。
5．
封閉
抗原或抗體包被后，載體表面仍可能遺留有未吸附蛋白質(zhì)的空白位點(diǎn)，從而造成下一步的非特異性吸附。
封閉液： 1%-3%牛血清白蛋白，3%-5%脫脂乳，10%?；蝰R血清加入封閉液后，37℃吸附 2h，然后洗滌。
6．
結(jié)果判定
1）
目視比色法：定性
2）
光電比色法：P/N比法，P/N值≥2.0為陽性

（七）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）與疾病診斷

聚合酶鏈反應(yīng)（ polymerase chain reaction, PCR）是1985年Mallis等根據(jù)核酸自然擴(kuò)增的原理，建立的一種人工體外擴(kuò)增DNA技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于病毒學(xué)研究及病毒病的診斷。
基本原理
PCR又稱為體外酶促基因擴(kuò)增，即在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸（dNTP）存在的條件下依賴于DNA聚合酶的體外擴(kuò)增反應(yīng)，其原理類似于天然DNA的復(fù)制。雙鏈靶DNA分子變性后解鏈，兩條單鏈DNA分別經(jīng)復(fù)性與兩條引物互補(bǔ)結(jié)合，在4種dNTP存在和合適的條件下，由DNA聚合酶催化引物由5’――3’ 擴(kuò)增延長，每經(jīng)過變性、復(fù)性、延伸一個循環(huán)，模板DNA增加1倍，新合成的DNA鏈又可作為下一循環(huán)的模板，經(jīng)過30-50個循環(huán)，可使原DNA量增加106-109倍。由于引物的序列決定了擴(kuò)增的范圍，而數(shù)十個循環(huán)，又使原DNA模板大量增加，因此，PCR具有特異、敏感等許多優(yōu)點(diǎn)，適用于病毒性疾病的診斷。
主要步驟
PCR的每一個循環(huán)包括變性、復(fù)性、延伸3個步驟。
1）變性通過加熱（90-95℃），使雙鏈DNA模板的氫鍵斷裂，雙鏈解離成單鏈。
2）復(fù)性適當(dāng)降溫（42-62℃），使引物與其互補(bǔ)的模板在局部形成雜交DNA雙鏈。
3）延伸
72℃，在DNA聚合酶、4種脫氧核糖核苷酸底物及Mg+離子存在的條件下，引物延長，新鏈合成。
幾種模板的處理方法
1.
細(xì)菌
挑細(xì)菌于離心管中，加適量ddH2O，渦懸，于沸水浴中變性10min，迅速置冰浴中，然后3000rpm離心數(shù)秒，取上清作為模板。
2.
細(xì)胞培養(yǎng)物
收集病變的細(xì)胞（不要凍融）懸液，10000rpm離心數(shù)秒，取細(xì)胞沉淀用適量Sample Buffer懸浮，加入蛋白酶K至終濃度為100μg/ml，于37℃溫箱中作用1h，取出于沸水浴中變性10min,立即置冰浴中，3000rpm離心數(shù)秒,取上清作為模板。
Sample
Buffer

終濃度
KCl
50mM
Tris-HCl(pH9.0)
10mM
MgCl2
1.5mM
明膠
0.01%
Triton X-100
0.1%
NP-40
0.45%
Tween 20
0.45%
3. 質(zhì)粒、病毒基因組DNA
沸水浴中變性10min，迅速置冰浴上備用。
4.
病料與鼻拭子
1)
用勻漿器將病料組織充分勻漿，用TEN緩沖液按1:5進(jìn)行稀釋。
2)
收集懸液于離心管內(nèi)，-20℃反復(fù)凍融三次。
3)
取出，5000rpm離心5min。
4)
取472.5μl上清液于另一離心管中，加入25μl 10%的SDS(終濃度為0.5%)

和2.5μl
20mg/ml的蛋白酶K(終濃度為100μg/ml)，混勻。
5)
50℃水浴過夜
6)
用等體積(500μl)的苯酚:異戊醇、苯酚:氯仿:異戊醇、氯仿:異戊醇各抽提一次
7)
吸取上清，加2倍體積的無水乙醇、0.1倍體積的3M NaAc于－20℃沉淀30min，

10000rpm離心10min。
8)
沉淀用70%乙醇洗一次，真空抽干，用20μl ddH2O溶解，－20℃保存?zhèn)溆谩?/font>

作者: 524343253 時間: 2009-6-19 22:26
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