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標(biāo)題: 豬病實驗室常規(guī)診斷技術(shù)之 十五、豬傳染性胸膜肺炎間接血凝試驗（IHA）操作方法 [打印本頁]
作者: nnii521 時間: 2009-6-24 21:22
標(biāo)題: 豬病實驗室常規(guī)診斷技術(shù)之 十五、豬傳染性胸膜肺炎間接血凝試驗（IHA）操作方法
十五、豬傳染性胸膜肺炎間接血凝試驗（IHA）操作方法
本方法系用豬傳染性胸膜肺炎嗜血桿菌多血清型抗原致敏戊二醛—鞣酸化處理的綿羊紅細(xì)胞作為抗原，供作間接血凝試驗檢測豬傳染性胸膜肺炎抗體之用。
2. 稀釋液：含1%健兔血清（56℃30分鐘滅活）的pH7.2 0.15M PBS液。
1．滴加稀釋液：用微量移液器每孔加0.025毫升稀釋液。
2．血清稀釋：使用微量稀釋棒蘸取被檢豬血清，置于第1孔中，作倍比稀釋至7孔，8孔為空白對照，各孔稀釋度分別為1：2、1：4、1：8、1：16、：1：32、1：64、1：128。
3．滴加致敏紅細(xì)胞：給被檢測血清各稀釋孔滴加嗜血桿菌致敏的綿羊紅細(xì)胞懸液25微升。置于微型振蕩器上振蕩1~2分鐘，置37℃溫箱作用2小時后判定結(jié)果。
4．設(shè)對照：在同一V型板上設(shè)嗜血桿菌陽性血清對照、陰性血清對照和稀釋液對照。在所有對照成立時，方可判定結(jié)果。
被檢測豬血清血凝效價大于或等于1：8（++）以上者，判為陽性（暫定）。血凝價小于1：4（++）者為陰性。
附：玻片沉淀試驗
該方法采用環(huán)狀沉淀試驗的胸膜肺炎嗜血桿菌可溶性耐熱抗原和玻片凝集試驗所用抗血清進(jìn)行快速玻片試驗。
操作方法：將用于環(huán)狀沉淀試驗的一滴抗原與玻片上一滴血清混合，搖動，1~3分鐘后判定結(jié)果。
結(jié)果判定：如發(fā)生肉眼可見的絮狀凝集者為陽性，不凝集者為陰性。
1 材料準(zhǔn)備：待檢組織、培養(yǎng)基
引物：預(yù)期擴(kuò)增的片段大小為610bp，由上海生物工程公司合成。
序列為，上游引物P1： 5’_CCGACTTTTAAATCCGT-3’
下游引物P2:
5’_GAACAGTTGTTCCGCTAA-3’
儀器設(shè)備有：凝膠電泳紫外線檢測儀，PCR擴(kuò)增儀，電泳儀，CO2培養(yǎng)箱
2操作步驟：
2．1
培養(yǎng)基的制備：PPLO巧克力培養(yǎng)基的制備。取35克PPLO瓊脂加熱溶于1000ml水中，121℃ 滅菌30min，冷卻到60℃左右加10%（v/v）脫纖綿羊脂和1%的葡萄糖（w/v）于80℃水浴，培養(yǎng)基顏色由紅色變?yōu)榍煽肆ι?，倒平皿?/font>4℃保存。
2．2
樣品的采集：取病豬的肺組織，低溫保純。
2． 3 樣品的處理：采病豬的肺組織無菌接種于PPLO培養(yǎng)基，37℃，10% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-36h后，將菌落透明，圓潤，直徑1-2mm的菌株用刮取2個菌落洗脫于含100ml無菌水的離心管中，1000r/m離心5min，棄上清，用無菌水懸浮，渦旋后，于沸水中水浴10 min后，再放置-20℃凍結(jié)。凍融后10000r/min離心5min,取上清作模板。
2．4
PCR操作程序
PCR反應(yīng)體系： 總體積50µl ,5µl 10倍緩沖液，3µl 25 m mol/L Mgcl2, 1µl
2 m mol/L dNTPs,5µmol/L上游引物，下游引物各3µl,Taq 0.5µl,模板7µl，無菌
水27.5µl.
PCR.反應(yīng)條件：于94℃變性3min后，進(jìn)入循環(huán)94℃ 1 min,50℃ 1min30s,
72℃ 1min40s,進(jìn)行30個循環(huán)后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物于4℃保存.
2.5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測：取8µl.擴(kuò)增產(chǎn)物和5µl DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，加到含EB的0.8%瓊脂凝膠中，電壓為80V，電流為40-60mA，電泳15min左右，然后在紫外燈下觀察。
豬2型圓環(huán)病毒聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
引物：擴(kuò)增偽狂犬病病毒基因中1093-1586bp之間494bp基因片段，由上海生物工程公司合成。
上游引物P1:
5’-CAC GGA TAT TGT AGT CCT GGT-3’
下游引物P2:
5’-GAC AGT ATA TCC GAA GGT GCG G-3’
2操作步驟：
2.1 樣品的采集：采集病豬的淋巴結(jié)、肺臟置-20℃
2.2 樣品處理 所采病料經(jīng)組織研磨器充分研磨，按1:5用TEN緩沖液懸浮收集于離心管內(nèi)，-70℃反復(fù)凍融3次，7000r/min離心5min。取上清液472.5μl,加入25μl 10％SDS和2.5μl的20mg/ml 蛋白酶K，50℃水浴搖床上放置2h后加入等量的飽和酚500μl，渦旋20s。離心取上清液，加等量的酚：氯仿：異戍醇（25:24:1）抽提一次，再用氯仿：異戍醇（24：1）抽提一次，最后用乙醇沉淀，真空抽干后加入20μl雙蒸水溶解，-20℃貯存?zhèn)溆谩?/font>
2.3.
PCR的操作程序PCR反應(yīng)體系為：總體積50μl，含有50m mol/L KCl,10m mol/L Tris-HCl（pH 9.0），0.1％Triton X-100，100μmol/L dNTPs，5μmol/L引物，2 m mol/L MgCl2，及0.5U Taq酶，1μl模板DNA。
常用的反應(yīng)體系組成如下
10×緩沖液
5.0μl
15mM MgCl2
3.0 μl
dNTPs
1.0 μl
引物
各2.5μl
Taq聚合酶
0.5μl
DNA模板
1.0μl
滅菌去離子水
34.5μl
擴(kuò)増條件為:94℃變性3分鐘，進(jìn)入循環(huán)，94℃60秒，55℃60秒，72℃90秒，35個循環(huán)后72℃延伸10分鐘。
2.4
PCR產(chǎn)物的檢測
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在0.8％的瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙錠染色，在紫外光下觀察結(jié)果,可見一494bp的特異性片段。
作者: hanhong 時間: 2009-6-24 22:10
樓主你肯定是高手，向你學(xué)習(xí)！
作者: dwm8080 時間: 2009-6-24 22:12
基礎(chǔ)知識好，打包壓縮更方便
作者: 姜寧 時間: 2009-6-25 00:35
你可以操作嗎，到時找你檢測，如何？
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