畜牧人
標題: 投喂益生菌對黃河鯉魚免疫效果的研究 [打印本頁] 作者: 胡文輝 時間: 2009-7-24 15:04標題: 投喂益生菌對黃河鯉魚免疫效果的研究
殷海成 趙紅月
摘要 ： 本試驗研究蘇云金芽胞桿菌（ Bacillus thuringiensis ）對黃河鯉魚血液免疫應(yīng)答強度的影響。將蘇云金芽胞桿菌按 1.0×1011 、 3.0×1011 、 5.0×1011 cfu/kg 三個濃度添加在魚用全價顆粒飼料中，投喂經(jīng)嗜水氣單胞菌 （ A . hydrophila ） 疫苗免疫 (A 0 ～3 ) 和未免疫組 (B 0 ～3 ) 黃河鯉魚，分別于 0 ， 15 ， 30 ， 40d 時檢測各組鯉魚白細胞吞噬活性、 血清溶菌酶活性、血清凝集抗體效價，并進行攻毒試驗。結(jié)果表明：添加蘇云金芽胞桿菌均能顯著提高黃河鯉的白細胞吞噬活性和溶菌酶活性，增強黃河鯉的凝集抗體效價；各實驗組與對照組免疫應(yīng)答強度差異顯著（ P <0.05 ），免疫組免疫應(yīng)答強度明顯高于未免疫組，且差異顯著（ P <0.05 ）；蘇云金芽胞桿菌能提高黃河鯉經(jīng)活菌攻毒后的存活率，其中，當菌株添加濃度為 5.0×1011cfu/kg 時，受免疫的鯉免疫保護率（ Relative percent survival ） 最高。即投喂蘇云金芽胞桿菌對黃河鯉魚血液免疫應(yīng)答有明顯促進作用。 關(guān)鍵詞：益生菌；黃河鯉魚；免疫 Effects of Feeding on Probiotics on the Immune Response of Cyprinus carpio in Yellow River YIN Hai-Cheng
Henan University of Technology,Zheng zhou 450001, China
Abstract:
To study the effect of Bacillus thuringiensis （ Bt ） on the immune response of Cyprinus carpio in Yellow River, the concentrations of Bacillus in test groups feed were respectively 1.0×1011, 3.0×1011, 5.0×1011cfu/kg for the fish were immunized with A . hydrophila in group (A0 ～ 3 ) and the fish weren’t immunized in group (B0 ～ 3 ), Phagocytic activity of leucocytes, lysozyme activity , agglutinating antibody titer and by challenging with live A·hydrophila were checked for 0 ， 15,30,40days. The results showed: Feed contain different concentrations Bacillus thuringiensis all could reprove the phagocytic activity of leukocytes, lysozyme activity and reprove agglutinating antibody titer. Difference is notable between adding and contrasting groups, were immunized and weren’t immunized (P <0.05). Bacillus could reprove the survival rate of cyprinus carpio in Yellow River after challenged with live A.hydrophila . When he concerntration of Bacillus is 5.0×1011cfu/kg feed, the RPS of immunized cyprinus carpio in Yellow River is the highest.
基金項目： 河南工業(yè)大學(xué)?；?/font> (06XJC024)
Namely feeding with the Bacillus thuringiensis having promoting an effect obviously to cyprinus carpio in Yellow River blood immunity response. Keywords : Probiotics ; Cyprinus carpio in Yellow River; Immunity
蘇云金芽胞桿菌 ( Bacillus thuringiensis ， Bt) 屬于革蘭氏陽性菌 ， 廣泛應(yīng)用于防范作物、森林、果蔬蟲害 ， 如殺滅寄生線蟲、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲、日本血吸蟲等 ， 在生物防治中占有極其重要的地位 （ 李今煜等 ， 2008 ） 。隨著對 Bt 結(jié)構(gòu)功能、遺傳、工程菌構(gòu)建、以及全基因組序列等深入研究，使 Bt 的應(yīng)用前景更加廣闊。對于魚類的免疫研究，主要體現(xiàn)在應(yīng)用中草藥、免疫多糖、肽類、益生菌制劑以及免疫增強劑等。如李清等（ 2005 ）應(yīng)用小肽探討鯉魚的免疫應(yīng)答，添加 1% 的劑量取得較好的免疫效果； Kozinska A,Guz L （ 2004 ）用脂多糖注射鯉魚，可提高其免疫力。然能否將 Bt 作為微生態(tài)制劑，應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，目前沒有報道，故值得研究。 本試驗應(yīng)用全價飼料添加不同劑量的 Bt ，研究 Bt 對黃河鯉魚免疫應(yīng)答反應(yīng)的效果，探討 Bt 在水產(chǎn)動物養(yǎng)殖中的應(yīng)用價值。
1 材料和方法
1.1 黃河鯉魚分組 與免疫處理
選擇 400 尾體重 75 ± 0.52 g 的健康黃河鯉，隨機均分 8 組，每組 50 尾，編號分別為： A0 （對照組） 、 A1 、 A2 、 A3 （含 A 四組在 7 d 和 14 d 分別注射 A ． hydrophila 菌苗 免疫 0.2 mL/ 尾（ 1×108 cells/mL ）和 B0 （對照組） 、 B1 、 B2 、 B3 （含 B 四組未免疫），養(yǎng)于直徑 2 m 的專用箱馴養(yǎng) 15 d ，開始試驗。
免疫結(jié)束后，開始試驗。試驗期間投喂飼料成分相同，試驗組飼料中分別添加蘇云金芽胞桿菌 1.0×1011 、 3.0×1011 、 5.0×1011 cfu/kg ，對照組不添加 。每日喂食兩次（ 8:00 ， 17:00 ），連續(xù) 30 d 。之后改投相同的不含芽孢桿菌飼料。 日投餌量為試驗魚體重的 2.50%-4.50 % 。整個試驗期間，保持微流水， 24 h 充氣。
1.2 飼料選擇及加工 飼料選用河南大德飼料科技開發(fā)有限公司生產(chǎn)的鯉魚全價配合顆粒飼料（ 101 ＃，粗蛋白 34% 、粗脂肪 5.0% 、粗纖維 8.0% ），粉碎后加入需要量蘇云金芽胞桿菌，充分拌勻，用小型制粒機（ 曲阜市應(yīng)用科技研究所， 93KWP-105 ） 加工成直徑為 1.5 mm 的顆粒，于 38 ℃ 下烘干，保存?zhèn)溆谩?/font>
1.3 抗原 將嗜水氣單胞菌（ A ． hydrophila ）接種于 FWA 培養(yǎng)基， 28 ℃ 培養(yǎng) 36 h ，集菌。然后加入終濃度為 0.5% 的福爾馬林， 28 ℃ 滅活 24 h ，即為福爾馬林滅活的 A ． hydrophila 菌苗，以 0.65% 的滅菌生理鹽水將滅活的 A ． hydrophila 菌苗濃度調(diào)整為 1×108cells/mL 作為抗原。置 4 ℃ 冰箱中保存?zhèn)溆谩?/font>
1.4 采血 及處理 試驗的第 0d 、 15d 、 30d 、 40d （停喂后的第 10d ） 上午進行血樣采集，采用心臟和斷尾采血兩種方法。每組取 10 尾。取血后，將每尾魚的血液樣本分成 2 份， 1 份置室溫 1h ，再置冰箱內(nèi) 4h ，以 2000r/min 離心 15min 分離血清，供檢測溶菌酶活性；另一份以肝素抗凝，供測定白細胞吞噬活性。
1.5 白細胞吞噬活性測定 將金黃色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus ）接種在 FWA 培養(yǎng)基上， 28 ℃ 培養(yǎng) 36h ，集菌，并用無菌生理鹽水離心洗滌 2 次，制成金葡菌懸液。取 金葡菌 懸液，加入終濃度為 0.5% 的福爾馬林， 28 ℃ 滅活 24 h ，作為本試驗中的吞噬原。在 0.25mL 抗凝血中加入 0.1mL 用滅菌生理鹽水調(diào)整為 1×108cells/mL 的金葡球菌懸液，搖勻后置于 28 ℃ 恒溫水浴鍋中，孵育 1 h ，每個血樣做血涂片 5 張，自然晾干，甲醇固定， Giemsa 染色，油鏡觀察并計數(shù)。計算：吞噬百分比（ PP ） = （ 100 個白細胞中參與吞噬的細胞數(shù) /100 ） ×100 ；吞噬指數(shù)（ PI ） = 被吞噬的細菌數(shù) / 吞噬細菌的細胞數(shù)。
1.6 血清溶菌酶活性測定 1.6.1 菌液的制備
以粉狀溶壁微球菌（ micrococcus lysoleikticus ）配成 4×106 cfu/mL 菌液，再用 722 型分光光度計于 640 nm 測定并調(diào)整其濃度，使 OD640=0.3 。
1.6.2 溶菌酶活性的測定
取 0.1 mL 血清 2 份，一份于 28 ℃ 水浴鍋中預(yù)熱 5 min 后加入 1.8 mL 菌液， 2 min 時加入 2 滴 5 mol/L KOH 溶液終止反應(yīng)，測 640 nm 波長下透光率為 T1 ％。另一份重復(fù)上述步驟，測透光率為 T0 ％。 T1 ％－ T0 ％即溶菌酶所致透光率的變化。與標準曲線對比，查血清中溶菌酶活性。
1.7 凝集抗體效價測定
采用血凝板依常法進行。反應(yīng)抗原采用 F-AH 。 1.8 攻毒試驗 于免疫后第 40d 采用 A ． hydrophila （ 1×108cells/mL ）對各組試驗魚進行攻毒。每組分別取供試魚 20 尾，經(jīng)胸鰭基部注射 0.2mL A ． hydrophila 活菌懸液。飼養(yǎng)觀察 14d ，統(tǒng)計各組的死亡率，依下式計算免疫保護率（ relative percent survival, RPS ）。
免疫保護率（ RPS ） =[1 －（免疫組死亡率 / 對照組死亡率） ]×100%
1. 9 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)用 STATISTIC6.0 軟件進行統(tǒng)計分析，組間差異用 Dunca ， s 多重比較，顯著水平為 0.05 。
2 結(jié)果與分析 2.1 投喂芽孢桿菌對黃河鯉白細胞吞噬活性的影響
投喂蘇云金芽胞桿菌對受免和未免黃河鯉白細胞吞噬活性的影響見表 1 。 表 1 投喂蘇云金芽胞桿菌對受免和未免黃河鯉白細胞吞噬活性的影響； * 表示停止 Bt 后 10d
Table1 cyprinus carpio before and after feeding Bt . （ Mean ±SD ） ; * 10 d after feeding without Bt
天數(shù)
Days
吞噬活性
Phogocytic activity
組別 （ Groups ）
A0 0
PP
32.91±3.08a
PI
1.16±0.19a
15
PP
38.81±3.06b60.81±2.54c 64.67±5.12c 63.15±4.23c 55.03±2.05c 58.48±1.58c 58.83±3.21c
PI
1.26±0.16b3.45±0.22c 2.60±0.11c 3.27±0.32c 2.18±0.81c 2.35±0.15c 3.01±0.26c
30
PP
38.24±2.09b
PI
1.47±0.16b
40 *
PP
39.80±3.01b
PI
1.58±0.11b
由表 1 可以看出， 各試驗 組在投喂芽孢桿菌前， PP 、 PI 均無顯著性差異。投喂芽孢桿菌后第 15 d ，免疫組 A1 、 A2 、 A3 組的吞噬活性達到最強，分別為 60.81±2.54c 、 3.45±0.22c ， 64.67±5.12c 、 2.60±0.11c ， 63.15±4.23c 、 3.27±0.32c ，對照 A0 組為 38.81±3.06b 、 1.26±0.16b ， 15d 后， A1 、 A2 、 A3 組的 PP 和 PI 雖有不同程度的下降，但仍顯著高于 A0 組。 Dunca ， s 多重比較 A1 、 A2 、 A3 組間 PP 和 PI 無顯著性差異（ P >0.05 ），與 A0 組對比差異顯著（ P <0.05 ）， A0 組在投喂前后則差異顯著（ P <0.05 ）。試驗對未受免組，芽孢桿菌也能提高黃河鯉白細胞的吞噬活性，表現(xiàn)和免疫組相似，但白細胞的 PP 和 PI 均低于免疫組（ 30d 時最高）。 說明投喂一定量蘇云金芽胞桿菌 可提高受免黃河鯉的白細胞吞噬活性。
2.2 投喂芽孢桿菌對鯉血清溶菌酶活性的影響 投喂蘇云金芽胞桿菌對鯉魚血清溶菌酶活性的影響見表 2 。試驗各組在投喂蘇云金芽胞桿菌前，溶菌酶活性并無顯著性差異 （ P >0.05 ） 。投喂開始之后的第 15d ，免疫組 A1 、 A2 、 A3 各組的溶菌酶活性顯著增高，且達到最高值，分別為 99.87±2.12c 、 106.10±1.21b 、 100.94±1.47a 。而未經(jīng)免疫各組同樣增高，但增速小于免疫組。 Dunca ， s 多重比較 ， A2 組與 A3 組無顯著性差異（ P >0.05 ），但于 A1 組間差異顯著（ P <0.05 ），免疫組與未免疫組差異顯著（ P <0.05 ）。 30d 之后到停止投喂，溶菌酶活性雖然稍有下降，但差異不顯著（ P>0.05 ）。且仍顯著高于 對照組 （ 45.32 u/mL-52.80 u/mL ）。由此可知：飼料中添加蘇云金芽胞桿菌 可提高黃河鯉的血清溶菌酶活性，添加濃度越高效果相對越好（ 3.0×1011 ； 5.0×1011 ）。
表 2 投喂蘇云金芽胞桿菌對受免和未免黃河鯉血清溶菌酶活性的影響 （ 單位 u/mL ）
Table 2 cyprinus carpio before and after feeding Bt. （ Mean ±SD ） ;( u/mL)
天數(shù)
Days
組別和溶菌酶活性（ Groups and lysozyme activity ）
A0 0
45.32±1.52a
15
52.32±1.41a b 106.10±1.21c a
30
52.80±2.42a
*
52.50±1.24a
* 表示停止投喂芽孢桿菌后 10d ; * 10 d after feeding without Bt
2.3 投喂蘇云金芽胞桿菌對黃河鯉凝集抗體效價的影響
免疫組（ A0 、 A1 、 A2 、 A3 ）的凝集抗體效價隨投喂天數(shù)逐漸上升，在 30d 時達到最高值。以 A2 組凝集抗體效價最高，達 1:120.56 ，其次為 A3 為 1:119.40 ，二者近似相等； A0 組最低為 1:101.32 。投喂?jié)舛雀撸?/font> 5.0×1011 cfu/kg ），所獲得的凝集抗體效價也高。而未 免疫組（ B0 、 B1 、 B2 、 B3 ）的凝集抗體效價在整個試驗期內(nèi)處于 1: ＜ 4- 8 之間 ，明顯低于免疫組。說明投喂蘇云金芽胞桿菌能提高受免黃河鯉的凝集抗體效價（ 見表 3 ） 。
表 3 投喂蘇云金芽胞桿菌后黃河鯉凝集抗體效價的變化
Table 3 cyprinus carpio before and after feeding Bt
組別 group
天數(shù)和凝集抗體效價 days and agglutination antibody titer
0
A0 ＜ 4 1 ， ( ＜ 4)2
A1 ＜ 4 ， ( ＜ 4)
A2 ＜ 4 ， ( ＜ 4)
A3 ＜ 4 ， ( ＜ 4)
B0 ＜ 4 ， ( ＜ 4) ＜ 4-8 (4.01) ＜ 4--8(4.75) ＜ 4-8(4.20)
B1 ＜ 4 ， ( ＜ 4) ＜ 4-8 (4.90) ＜ 4-8(5.21) ＜ 4-8(4.38)
B2 ＜ 4 ， ( ＜ 4) ＜ 4-8(5.01) ＜ 4-8(5.32) ＜ 4-8(4.21)
B3 ＜ 4 ， ( ＜ 4) ＜ 4-8(4.98) ＜ 4-8(5.17) ＜ 4-8(4.73)
* 表示停止投喂芽孢桿菌后 10d ； 1 表示凝集抗體效價的范圍； 2 表示凝集抗體效價的幾何平均數(shù)
*10 d after feeding without Bt; 1 indicate spectrum of agglutination antibody titer;2 indicate geometric mean of agglutination antibody titer 2.4 攻毒后的存活率
各組魚經(jīng)活菌攻毒后，死亡情況見表 4 。從表 5 可以看出，經(jīng)過免疫接種后的鯉魚均獲得了一定的免疫保護率，且蘇云金芽胞桿菌能提高受免鯉魚的存活率。當蘇云金芽胞桿菌在飼料中的添加濃度為 5.0×1011cfu/kg 飼料時，受免鯉魚獲得了最高的免疫保護率（ >70% ）。而未免疫組攻毒試驗結(jié)果，其死亡率大于 60% 。
表 4 活菌攻毒后鯉的死亡率和免疫保護率
Table4 Mortality and relative percent survival of the experiment and control Cyprinus carpio after challenged with live A.hydrophila
組別
groups
攻毒魚尾數(shù)
No. of fish challenged
死亡魚尾數(shù)
No. of dead fish
死亡率
Mortality （％）
免疫保護率
RPS(%)
A0
20
15
75
16.67
B0
20
18
90
A1
20
11
55
31.25
B1
20
16
80
A2
20
5
25
61.54
B2
20
13
65
A5
20
3
15
75.00
B3
20
12
60
3 討論
3.1 蘇云金芽胞桿菌對黃河鯉魚白細胞吞噬活性、溶菌酶活性的影響
近年來，微生態(tài)制劑在畜禽飼料中應(yīng)用較多，主要能提高其免疫應(yīng)答能力，但在水產(chǎn)動物飼料以及預(yù)防疫病研究較少。在本試驗應(yīng)用蘇云金芽胞桿菌投喂黃河鯉魚，觀察鯉魚的血液免疫應(yīng)答能力，效果明顯。 這與 劉克林、何明清（ 2000 ）用益生菌對鯉魚免疫功能影響研究 結(jié)果一致；同時證實 蠟樣芽孢桿菌對肉雞 血中 L 細胞值有明顯提高 。溫俊、孫東巖（2008）應(yīng)用合生素對鯉魚抗病力研究，取得較好的保護率。 陳昌福 （ 1998 ） 利用細菌脂多糖對鯉魚淋巴細胞培養(yǎng)結(jié)果也表明有明顯的激活作用，使淋巴細胞數(shù)量的增強。 溶菌 酶是動物非特異性免疫物質(zhì)之一，在動物防御機制中同樣起著重要作用。 王宏田等（ 2000 ）、 王雄等（ 2004 ） 報道微生態(tài)制劑對水產(chǎn)動物溶菌酶活性有增強作用。 Marja 和 Antti （ 1992 ）研究表明，在一定程度上，血漿中的溶菌酶水平變化是與循環(huán)系統(tǒng)中的白細胞數(shù)目變化是一致的。本實驗研究結(jié)果，添加蘇云金芽胞桿菌顯著提高鯉魚血液中細胞吞噬活性、溶菌酶活性以及免疫保護力。其中當芽孢桿菌濃度為 5.0×1011cfu/kg 時 效果最為明顯 。
3.2 蘇云金芽胞桿菌對黃河鯉凝集抗體效價及免疫效果的影響
高等動物通過檢測抗體和依據(jù)抗體滴度反映免疫應(yīng)答水平。 Inooka 和 Kimura （ 1983 ）報道用納豆芽孢桿菌飼喂雛雞后，能夠增強雛雞對抗綿羊紅細胞的凝集抗體的產(chǎn)生；盧勝明（ 2002 ）報道益生芽孢桿菌制劑能顯著提高雛雞的新城疫血凝抑制效價，對雛雞具有免疫調(diào)節(jié)作用。但關(guān)于微生態(tài)制劑對魚類凝集抗體效價的作用的報道并不多見。楊先樂等（ 1990 ）研究草魚出血病發(fā)現(xiàn)免疫保護力較高時，血清中抗體水平也較高。從本試驗研究發(fā)現(xiàn)，受免疫鯉的血清凝集抗體效價隨著芽孢桿菌濃度的增加而升高。在 4 個免疫組中，第 30d 時， A2 組凝集抗體效價最高，平均為 1:120.56 ，其次是 A3 組，平均凝集抗體效價為 1:119.40 ，這說明芽孢桿菌可以提高鯉的特異性免疫機能。但也有文獻報道免疫保護力與血清中抗體水平不一致的現(xiàn)象。 Toranzo 等（ 1995 ）用腸球菌的二價疫苗免疫鱒魚，血清凝集抗體效價非常低，但對攻毒表現(xiàn)了良好的免疫保護效果。這種現(xiàn)象被認為可能是受免疫魚類對菌苗的免疫應(yīng)答中，所產(chǎn)生的特異性抗體不全是保護性抗體的緣故。
作者: flyfish01 時間: 2009-8-4 17:37
歡迎光臨 畜牧人 (http://ffers.com.cn/)
Powered by Discuz! X3.5
感谢您访问我们的网站，您可能还对以下资源感兴趣：
台湾佬娱乐