畜牧人

抗菌肽的基因工程表達（一）

  天然抗菌肽主要來自昆蟲，但其提取過程甚為復(fù)雜。一般需將蟲體研磨、離心，上清液再經(jīng)鹽析、葡聚糖凝膠層析等一系列步驟純化，才能去除其他雜蛋白，而產(chǎn)物濃度和回收率都不甚理想。用基因工程方法可以簡化上述步驟，且產(chǎn)量可獲明顯提高。

  基因的構(gòu)建及表達 ： 目的基因的獲得可以從動物體中提取RNA，將其反轉(zhuǎn)錄擴增后得到cDNA，利用此方法已經(jīng)得到豬抗菌肽PR-39基因；或根據(jù)抗菌肽氨基酸殘基種類和其殺菌活性的相關(guān)性，替換某幾個氨基酸或?qū)?/font>2種抗菌肽基因結(jié)合構(gòu)造雜合肽。如將cecropin Bl5和17等位點的氨基酸替換后，其抗菌活性明顯提高；cecropin A N端1～7位和Milittin N端5～12位氨基酸雜合后，其產(chǎn)物具有熱穩(wěn)定性和高抑菌活性。

大腸桿菌表達系統(tǒng)基于大腸桿菌的原核表達系統(tǒng)是迄今在基因工程領(lǐng)域中應(yīng)用最多、也最完善的系統(tǒng)，但運用該系統(tǒng)表達抗菌肽則遇到很多困難，主要表現(xiàn)在2個方面。一是抗菌肽的宿主細胞毒性。宿主細胞表達的抗菌肽會反饋性地抑制大腸桿菌等宿主細胞的增殖，從而影響抗菌肽的進一步表達；二是容易被降解。由于抗菌肽本身帶有大量正電荷，因而對蛋白酶非常敏感，在表達胞中容易被降解，難以實現(xiàn)大量表達。融合表達是解決上述問題的主要方法。xu等以pTRX為載體，在大腸桿菌BL21中以與硫氧還蛋白(TRX)融合的方式表達了38個氨基酸殘基的家蠅肽Mdmcec，目標蛋白用腸激酶切割下來，再用HPLC進行純化，最后獲得了11．2 mg／L的產(chǎn)量。但大腸桿菌表達產(chǎn)物均以包涵體的形式存在，需將細胞超聲破碎后透析純化，給后續(xù)處理帶來困難。