植物有種類豐富的低分子量的次生代謝產(chǎn)物。一般來說這些化合物可能作為防御系統(tǒng)來抵御生理、環(huán)境、食物鏈上游和病原體的應(yīng)激壓力,使植物與周圍的環(huán)境保持和諧共存。除了少數(shù)有毒的化合物以外,幾種主要存在于藥用植物的次生代謝產(chǎn)物在食品和哺乳動(dòng)物代謝中有積極的有益作用。有關(guān)植物提取物添加劑的詞語非?;靵y,本文采用植物提取物添加劑(Phytogenic Feed Additive)一詞。 該類型添加劑定義為: 從植物中提?。ǚ腔ず铣桑?化工合成產(chǎn)品在歐洲也稱為:類似天然), 活性成分明確,可以測定,并且含量穩(wěn)定,對(duì)動(dòng)物和人類沒有任何毒副作用(GRAS,美國定義為公認(rèn)安全產(chǎn)品),并已通過動(dòng)物試驗(yàn)證明可以提高動(dòng)物生產(chǎn)性能的飼料添加劑。常見的詞語還有:草藥 (Herbs):藥用植物/植物性藥物(Phytoceuticles);中草藥添加劑(Chinese traditional medicine) ;陽生素(Phytobiotics)等。
人類對(duì)藥用植物的使用與探索的歷史源遠(yuǎn)流長,應(yīng)該始于人類的非常原始的時(shí)期。中國對(duì)藥用植物(中草藥)在人類和動(dòng)物上的應(yīng)用也有悠久的歷史(如《本草綱木》《元亨療馬集》等)。西方使用植物做為香料和藥物(稱為草藥,Herb)則始于兩千多年前的羅馬和希臘時(shí)期(Bauer et al., 2001);通常相信使用植物提取物相對(duì)較晚, 古時(shí)羅馬和希臘也只有松節(jié)油的文字記載(Guenther, 1948) 。然而,使用蒸餾法生產(chǎn)植物提取物則源于兩千多年前的東方國家(如埃及,印度,波斯等國)(Guenther, 1948);九世紀(jì)時(shí)阿拉伯人改進(jìn)了傳統(tǒng)的蒸餾方法(Bauer et al., 2001) 。 真正有可靠文字記載的通過蒸餾法提取的植物提取物是由維拉諾瓦(Villanova)醫(yī)生完成的(約1235–1311年) (Guenther, 1948). 到了13世紀(jì)植物提取物開始被用于藥物(Bauer et al., 2001) ,但直到16世紀(jì)才開始在歐洲普遍作為藥物使用。此時(shí)經(jīng)過提取的藥用植物相對(duì)較少。第一個(gè)實(shí)驗(yàn)來測定植物提取物的抗菌殺菌效果的是De la Croix在1881年完成的 (Burt 2004)。從此以后,科學(xué)界進(jìn)行了很多研究并發(fā)表了大量的科技論文探討植物提取物的活性成分及其抗菌殺菌機(jī)制等。
隨著近40年來化學(xué)分析手段和分析儀器的發(fā)展和改進(jìn),對(duì)植物提取物及其活性成分準(zhǔn)確分析成為現(xiàn)實(shí)。植物提取物的主要活性成分是通過氣相或液相色譜儀和質(zhì)譜儀的分析而得到 (Burt,2004)。研究發(fā)現(xiàn),植物提取物可以包含有多達(dá)60多種化學(xué)成分。有趣的是,盡管植物名稱相同,但其主要活性成分的含量可以從高達(dá)整個(gè)提取物的85%到接近零(Bauer et al., 2001;金立志 2007) (見表一)。其主要原因是植物品種不同,種植地方不同,收獲時(shí)間不同,從而導(dǎo)致其活性物質(zhì)含量差異很大 (Burt,2004)。舉例來說,經(jīng)過希臘亞里斯多得大學(xué)從1986年得到歐盟的研究項(xiàng)目立項(xiàng),經(jīng)過10年的雜交育種和分子育種,最后培育成功的止痢草(Origanum heracleoticum L. (Origanum vulgare ssp.hirtum),其活性物質(zhì)的產(chǎn)量就是普通品種的20-30倍;并且可以適應(yīng)惡劣的氣候保持一致的活性物質(zhì)產(chǎn)量(Gill 1999)。該植物提取物(Orego-Stim㊣)也是唯一獲得歐洲專利(專利號(hào):0835120)和美國專利(專利號(hào):6106838),并在歐洲和美國及中國農(nóng)業(yè)部注冊(cè)為飼料添加劑的純天然植物提取物。表一列出了一些在商業(yè)上有應(yīng)用前途的一些植物及其活性成分 (Bauer et al.2001)。
植物提取物抗菌的主要活性成分是酚類物質(zhì)(Burt,2004)。但提取物中的一些少量物質(zhì)在抗菌中也起到非常重要的作用,并可能與主要活性物質(zhì)起協(xié)同作用。這種協(xié)同作用已經(jīng)在鼠尾草 (Marino et al.,2001), 百里香的一些品種 (Marino et al.1999) 和止痢草/牛至(Paster et al., 1995)等植物提取物中被證明。
表 1 主要研究的植物提取物及其主要抗菌活性成分
植物名稱 植物拉丁學(xué)名 主要有效成分 主要有效成分含量(%) 參考文獻(xiàn)
芫荽
(葉子) Coriandrum sativum 芳樟醇 26% (Delaquis et al., 2002)
E-2-癸醛 20%
芫荽(種子) Coriandrum sativum 芳樟醇 70% (Delaquis et al., 2002)
E-2-癸醛 -
肉桂 Cinnamomum zeylandicum 肉桂醛 65% (Lens-Lisbonne et al., 1987)
止痢草/牛至草 Origanum vulgare 香芹酚 微量-80% (Lawrence, 1984; Prudent et al., 1995;
百里香酚 微量-64% Charai et al., 1996; Sivropoulou et al., 1996;
g-萜品烯 2 –52% Kokkini et al., 1997; Russo et al., 1998
p-百里香素 微量-52% Daferera et al., 2000; Demetzos and
Perdetzoglou, 2001; Marino et al., 2001)
迷迭香 Rosmarinus officinalis a-蒎烯 2 –25% (Daferera et al., 2000, 2003; Pintore et al., 2002)
乙酸龍腦酯 0 –17%
樟腦 2 –14%
1,8-桉樹腦 3 –89%
鼠尾草 Salvia officinalis L. 樟腦 6 –15% (Marino et al., 2001)
a-蒎烯 4 –5%
h-蒎烯 2 –10%
1,8-桉樹腦 6 –14%
a-tujone 20–42%
丁香
(bud) Syzygium aromaticum 丁子香酚 75–85% (Bauer et al., 2001)
乙酸丁子香酚 8 –15%
百里香 Thymus vulgaris 百里香酚 10–64% (Lens-Lisbonne et al., 1987;
香芹酚 2 – 11% McGimpsey et al., 1994;
g-萜品烯 2 –31% Cosentino et al., 1999; Marino et al., 1999;
p-百里香素 10–56% Daferera et al., 2000; Juliano et al., 2000)
(資料來源:Burt 2004)
3.植物提取添加劑抗菌作用及其作用機(jī)制的研究
3.1.植物提取添加劑抗菌作用研究
迄今為止已經(jīng)研究的植物提取物的種類包括蔬菜、水果、綠茶、洋蔥、大蒜、丁香、槐樹葉、刺柏、麥芽、萬壽菊、桃類、熊霉葉、薊草、黃連、鼠尾草、肉豆寇、月桂、止痢草/牛至、海澡、蘑菇及其它類植物的提取物或精油等。澳大利亞科學(xué)家Hammer、Carson 和Riley(1999)比較了茶樹、檸檬、百里香、生姜、芫妥、馬郁蘭、蘭草莓、艾灌、三葉草、止痢草/牛至等 10 種植物提取物對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果。結(jié)果表明,茶樹、芫妥、馬郁蘭和止痢草/牛至的提取物對(duì)3 種致病性細(xì)菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌能力,尤其是止痢草/牛至提取物的抑菌性最強(qiáng)。表二列出了主要植物提取物的最小抑菌濃度(MIC),在所列出的所有植物種類中,止痢草/牛至和百里香草的提取物對(duì)大腸桿菌,金黃色葡萄球菌,沙門氏菌,和李氏桿菌的MIC是最小的, 換句話說,止痢草/牛至和百里香草的提取物的抗菌抑菌能力是最強(qiáng)的。近年來,對(duì)止痢草提取物對(duì)真菌的殺滅作用的研究表明,止痢草提取物可以有效的抑制白色念珠菌)的生長(Manohar et al.2001),該項(xiàng)研究結(jié)果發(fā)表在著名科學(xué)雜志上《Molecular and Cellular Biochemistry》。Adams(2008)也研究了對(duì)止痢草提取物對(duì)幾種抑制動(dòng)物和人類免疫能力的真菌的殺菌實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)對(duì)止痢草提取物對(duì)新生隱球菌, 紅色青霉菌和白色念珠菌有很強(qiáng)的抗菌殺菌能力。
表2 主要植物提取物的活性成分及其最小抑菌濃度(MIC)
植物名稱 病菌名稱 MIC,
(μl/ml) 參考文獻(xiàn)
迷迭香 大腸桿菌 4.5–>10 (Farag et al., 1989; Smith-Palmer et al., 1998;Hammer et al., 1999; Pintore et al., 2002)
沙門氏菌 >20 (Hammer et al., 1999)
蠟狀芽孢桿菌 0.2 (Chaibi et al., 1997)
金黃色葡萄球菌 0.4– 10 (Farag et al., 1989; Smith-Palmer et al., 1998;
Hammer et al., 1999; Pintore et al., 2002)
李斯特菌 0.2 (Smith-Palmer et al., 1998)
止痢草/牛至草 大腸桿菌 0.5– 1.2 (Prudent et al., 1995; Hammer et al., 1999;
Burt and Reinders, 2003)
沙門氏菌 1.2 (Hammer et al., 1999)
金黃色葡萄球菌 0.5– 1.2 (Prudent et al., 1995; Hammer et al., 1999)
檸檬香茅草 大腸桿菌 0.6 (Hammer et al., 1999)
沙門氏菌 2.5 (Hammer et al., 1999)
金黃色葡萄球菌 0.6 (Hammer et al., 1999)
鼠尾草 大腸桿菌 3.5– 5 (Farag et al., 1989; Smith-Palmer et al., 1998;
Hammer et al., 1999)
沙門氏菌 10– 20 (Shelef et al., 1984; Hammer et al., 1999)
金黃色葡萄球菌 0.75–10 (Shelef et al., 1984; Farag et al., 1989;
Smith-Palmer et al., 1998; Hammer et al., 1999)
李斯特菌 0.2 (Smith-Palmer et al., 1998)
丁香 大腸桿菌 0.4– 2.5 (Farag et al., 1989; Smith-Palmer et al., 1998;
Hammer et al., 1999)
沙門氏菌 >20 (Hammer et al., 1999)
金黃色葡萄球菌 0.4– 2.5 (Farag et al., 1989; Smith-Palmer et al., 1998;
Hammer et al., 1999)
李斯特菌 0.3 (Smith-Palmer et al., 1998)
百里香 大腸桿菌 0.45–1.25 (Farag et al., 1989; Smith-Palmer et al., 1998;Cosentino et al., 1999; Hammer et al., 1999;Burt and Reinders, 2003)
沙門氏菌 0.450–>20 (Cosentino et al., 1999; Hammer et al., 1999)
金黃色葡萄球菌 0.2– 2.5 (Farag et al., 1989; Smith-Palmer et al., 1998;Cosentino et al., 1999; Hammer et al., 1999)
李斯特菌 0.156–0.45 (Firouzi et al., 1998; Smith-Palmer et al., 1998;Cosentino et al., 1999)
姜黃
大腸桿菌 >0.2 (Negi et al., 1999)
蠟狀芽孢桿菌 0.2 (Negi et al., 1999)
茶樹 大腸桿菌 2.5–>80 (Bassole et al., 2003)
痢疾志賀氏菌 5–>80 (Bassole et al., 2003)
金黃色葡萄球菌 0.6– 40 (Bassole et al., 2003)
蠟狀芽孢桿菌 5–10 (Bassole et al., 2003)
(資料來源:Hammer 1999; 金立志 2007)
植物提取物及其活性成分一個(gè)重要的特點(diǎn)是其疏水性(hydrophobicity), 這使得植物提取物及其效有成分可以讓細(xì)胞膜和線粒體上的磷脂結(jié)構(gòu)分開,破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu),增強(qiáng)細(xì)胞膜通透性,從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)離子和其他物質(zhì)的泄露 (Helander et al., 1998; Ultee et al., 2002)。盡管胞內(nèi)有些物質(zhì)的泄露細(xì)胞仍然可以存活,但大量細(xì)胞內(nèi)容物或者重要離子或分子的泄露會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。也有研究發(fā)現(xiàn),利用茶葉提取物對(duì)大腸桿菌的抑菌實(shí)驗(yàn)中,細(xì)菌在裂解之前就已經(jīng)死亡(Bert 2004);利用肉桂提取精油及其活性成分的研究也發(fā)現(xiàn),肉桂提取精油及其活性成分可以抑制產(chǎn)氣腸桿菌的氨基酸代謝中的脫羧酶的活性(Wendakoon and Sakaguchi,1995)。
圖 1,植物提取物抗菌作用機(jī)制示意圖 (adapted from Burt,2004)
3.3.止痢草提取物及其活性成分(香芹酚和百里香酚)的作用機(jī)制研究
研究發(fā)現(xiàn),凡是抗菌性強(qiáng)的植物提取物中都含有比較高的酚類化合物,例如香芹酚,百里香酚和丁子香酚等(Farag et al., 1989; Dorman and Deans, 2000)。這樣看起來有理由相信,這些酚類物質(zhì)的抗菌機(jī)制是相似的,盡管單個(gè)組份的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同其準(zhǔn)確的抗菌的作用機(jī)制也有略有不同 (Dorman and Deans,2000)。研究者對(duì)止痢草/牛至中的兩個(gè)主要成分-香芹酚和百里香酚的作用機(jī)制研究報(bào)道最多。香芹酚和百里香酚化學(xué)結(jié)構(gòu)相似,但羥基在苯環(huán)上的位置不同。膜穿孔和膜粘合被認(rèn)為是首要作用模式(Stiles,1995),導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜滲透性提高及胞內(nèi)生命物質(zhì)外泄,從而損害細(xì)菌酶系統(tǒng)(Farag等,1989),導(dǎo)致微生物死亡。一致的研究結(jié)果表面,香芹酚可以通過擠壓開鱗脂的脂肪酸鏈,在細(xì)菌細(xì)胞膜上形成很多小管道,從而讓細(xì)胞質(zhì)中的離子從細(xì)胞質(zhì)流出細(xì)胞外(Ultee,2000)。 已經(jīng)證實(shí),止痢草/牛至中的主要成分香芹酚可以使金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌細(xì)胞中的磷酸分子子泄漏 (Lamburt et al., 2001). Helander 等(1998)研究了止痢草/牛至中的香芹酚和百里香酚如何對(duì)大腸桿菌O157和沙門氏菌產(chǎn)生殺滅作用時(shí)發(fā)現(xiàn),這些酚類活性物質(zhì)可以使細(xì)胞膜破裂,胞內(nèi)物質(zhì)外溢。這表明萜類和苯丙素類能因它們的親脂特性而穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞(Helander 等,1998)。另外研究發(fā)現(xiàn),止痢草/牛至中的 的抑制或殺滅微生物的特性與其親脂性質(zhì)(如:存在功能團(tuán))和芳香族的化學(xué)結(jié)構(gòu)(Farag 等,1989)有關(guān)。
除去抑制細(xì)菌自身細(xì)胞的生長之外,香芹酚也有可能抑制細(xì)菌內(nèi)毒素的分泌。體外試驗(yàn)結(jié)果表明,香芹酚可以抑制蠟狀芽孢桿菌(B. cereus)分泌導(dǎo)致腹瀉的內(nèi)毒素。對(duì)于香芹酚抑制細(xì)菌內(nèi)毒素分泌的機(jī)制有兩種可能:一是如果內(nèi)毒素分泌是一個(gè)主動(dòng)過程,那么香芹酚有可能導(dǎo)致細(xì)胞沒有足夠的ATP或PMF把內(nèi)毒素轉(zhuǎn)運(yùn)到體外;另一可能是, 香芹酚抑制細(xì)菌生長使其速度減慢意味著,細(xì)菌細(xì)胞使用了所有的可利用的能量為了存活,而沒有能力再產(chǎn)生內(nèi)毒素(Ultee and Smid, 2001) 。
有趣的是,如果使用完整的植物提取物,其抗菌功能要比用主要成分的混合物要大的多(Gill et al., 2002; Mourey and Canillac, 2002)。這種結(jié)果也說明了非主要活性成分也起到重要的作用,并可能與主要活性成分有疊加效應(yīng)。止痢草提取物中的兩種主要活性成分,香芹酚和百里香酚在殺滅金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌方面有疊加效應(yīng) (Burt 2003)。已經(jīng)證明,香芹酚和它的合成前體p-百里香素在抗菌方面也有協(xié)同作用。研究發(fā)現(xiàn),提純的p-百里香素抗菌作用很微弱, 但是它比香芹酚更能夠讓細(xì)菌的細(xì)胞膜膨脹,通過這種機(jī)制,p-百里香素能夠幫助香芹酚更容易進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi),所以香芹酚和它的合成前體p-百里香素在抗菌方面通過這種機(jī)制達(dá)到協(xié)同疊加作用(Ultee et al., 2000)。
4.植物提取物的抗氧化作用
Deans等(1993)研究了從不同植物提取物添加劑中提取的精油的抗氧化活性(表3)。止痢草/牛至草提取物(OEO )抗氧化作用的體外試驗(yàn)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明,OEO 的百里香酚和香芹酚有很強(qiáng)的抗氧化性質(zhì)(Baratta 等,1998)。在評(píng)估OEO 的抗氧化性質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn),與其它植物提取物如:百里香、薄荷、和熏衣草比較,OEO 對(duì)75C豬油的穩(wěn)定保存最有效(Economou 等,1991)。
很多植物提取物本來在人類食品中作用香料使用。例如,止痢草主要成分之一百里香酚也被用作食品調(diào)味劑(Furia and Bellanca,1975)。止痢草提取物的的香料功能可以用于對(duì)仔豬斷奶階段的原料變化引起味道和氣味進(jìn)行統(tǒng)一(Ariza-Nieto, 2006)。止痢草作為香料在豬營養(yǎng)中的使用可以刺激豬的舌咽神經(jīng)從而提高唾液分泌及提高豬的食欲(Lee 等,2004)。英國艾伯丁大學(xué)的研究結(jié)果表明,飼料中添加植物提取物28天后能有效促進(jìn)斷奶仔豬的生長和提高斷奶仔豬的日增重。與對(duì)照組相比,添加組斷奶仔豬增重提高12%,采食量提高4%,飼料報(bào)酬改善6.7%(表4)。在該項(xiàng)研究中也發(fā)現(xiàn),即使在斷奶后第一周飼料中含有抗生素,植物提取物也能增加斷奶仔豬增重,研究者認(rèn)為其主要原因可能與植物提取物增加可仔豬的采食量,以及部分病源微生物對(duì)抗生素產(chǎn)生抗藥性等因素有關(guān)。
表 5 植物提取物添加劑對(duì)斷奶仔豬增重,采食量和飼料報(bào)酬的影響
對(duì)照族 抗生素組 專利植物提取物組 專利植物提取物+抗生素組 標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)
動(dòng)物頭數(shù) 96 96 96 96
始重, kg 6.1 6.1 6.1 6.0 0.09
末重, kg 18.1 b 19.5 a 19.2 a 19.4 a 0.32
平均日增重, g 341 b 382 a 374 ab 381 a 11.4
平均日采食量, g 633 642 660 662 9.8
采食量/增重(FCR) 0.54 b 0.60 a 0.57 ab 0.58 ab 0.011
注:抗生素=卡巴多(Carbadox); 植物提取物=好力高;同行不同字母標(biāo)記表示統(tǒng)計(jì)差異顯著(P<0.05)。
資料來源: Ariza Neito (2006) University of Minnesota (博士論文)