Analysis of influence factors not included in definition during enzyme activity test
Tang Haiou, Wang Yong, Li Fuwei
飼用酶制劑是應(yīng)用現(xiàn)代生物工程技術(shù)，選用特殊的微生物菌株經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的具有催化活性的生物制劑。近年來，因其具有改善畜禽消化道功能、降低食糜粘度和抗?fàn)I養(yǎng)性、提高飼料利用率和減少環(huán)境污染等特點(diǎn)，已作為環(huán)保型飼料添加劑廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)。但因飼用酶制劑應(yīng)用開發(fā)較晚，當(dāng)前飼用酶制劑酶活測定方法除了植酸酶外其它酶制劑都還沒有一個全國通用的標(biāo)準(zhǔn)方法。雖然隨著酶制劑工業(yè)的發(fā)展，酶活檢測水平已得到了相應(yīng)的提高，對于酶活檢測中的一些重要因素人們在酶活定義中已經(jīng)進(jìn)行了明確的規(guī)定，例如其中的溫度、pH值、時間、底物等，并且對于這些因素在酶活測定過程中對結(jié)果的影響程度以及這些因素不同值下的對比關(guān)系，廣大科研工作者已經(jīng)進(jìn)行了大量而深入的研究。但是酶活檢測過程中除了這些定義中規(guī)定的因素對酶活檢測結(jié)果影響很大以外，許多非定義因素對酶活的檢測結(jié)果影響也極其顯著。因此，對于酶制劑酶活大小的判斷和對比，不能僅僅從定義中規(guī)定的因素進(jìn)行分析，那些非定義因素的分析也至關(guān)重要。有鑒于此，筆者就酶制劑酶活測定中一些影響酶活測定值的非定義因素進(jìn)行了分析，并對其中有些不確定的影響因素進(jìn)行了對比試驗，以便為廣大的酶制劑應(yīng)用者更好的把握酶制劑的質(zhì)量提供參考。
1 緩沖液的配置
飼用酶制定義中的pH值的確定都是根據(jù)動物的胃腸內(nèi)最佳作用pH值得來，一般在5.0～5.5左右。為了達(dá)到酶活定義所要求的pH值范圍，酶制劑檢測時都應(yīng)用一定的緩沖液調(diào)配使反應(yīng)體系達(dá)到相應(yīng)的pH值。反應(yīng)體系中緩沖液的離子強(qiáng)度影響酶制劑的蛋白空間結(jié)構(gòu)，從而影響其催化能力，所以測定酶活時應(yīng)盡可能統(tǒng)一反應(yīng)緩沖液的種類和離子強(qiáng)度。但是在pH相同的條件下如果緩沖液的離子對和緩沖溶液的摩爾濃度不相同，則測定出來的酶活差別很大。乙酸緩沖液在酶制劑檢測中最常使用，但也有方法使用檸檬酸和硼酸等緩沖液。緩沖液摩爾濃度國內(nèi)方法一般用0.1和0.2M的居多，在國外也有使用0.05M的方法。Nelson等(2007)試驗證明，使用檸檬酸緩沖液測定真菌性植酸酶的活性僅相當(dāng)于使用乙酸緩沖液的65～70%。然而，在緩沖液使用上的差異并不對所有植酸酶都產(chǎn)生相同的影響。Dalsgaard等(2007)發(fā)現(xiàn)，乙酸緩沖液和檸檬酸緩沖液對兩種大腸桿菌植酸酶的相對酶活影響區(qū)別很大，用檸檬酸緩沖液分析得到的植酸酶活性只相當(dāng)于用乙酸緩沖液的1/3左右。我們應(yīng)用相同測定方法不同的兩種的緩沖液測定同一種木聚糖酶樣品，結(jié)果表明使用乙酸緩沖液測定的酶活僅相當(dāng)于使用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液的60～70%。
2 底物的配置
底物的差別對酶活測定結(jié)果具有很大影響。底物的選擇最好應(yīng)用酶制劑實際應(yīng)用時所對應(yīng)的酶解底物為好，但是在實際檢測時因為考慮到底物穩(wěn)定性以及酶活檢測的方便性等問題，底物的性質(zhì)和型號往往有很大的區(qū)別。對于沒有統(tǒng)一國標(biāo)規(guī)定的測定方法，在底物的性質(zhì)上存在許多不同，其中多以鹽的形式居多，例如纖維素酶的底物以用羧甲基纖維素鈉為多，但也有直接用微晶體纖維素進(jìn)行測定的方法。即便是植酸酶的底物植酸鈉也存在不同種型號的情況，應(yīng)用不同型號的植酸鈉進(jìn)行測定，結(jié)果之間差別也很顯著。我們采用試驗的方式考察了不同pH條件下二種底物(SigmaP8810和P3168)檢測不同酶活水平的植酸酶時其檢測值之間的差別。結(jié)果表明：不同pH條件下，P8810與P3168的檢測結(jié)果之間差異都極顯著(見表1)。
表1 不同pH下三種底物對不同酶活水平的植酸酶檢測結(jié)果及分析