不同糖對四種粕蛋白保護效果的研究
Study on the protective effect of treated protein meal with different sugar
摘要：本文以甲醛處理作為對照，研究4種不同的糖(戊糖、己酮糖、己醛糖、蔗糖)濃度3%，140℃加熱90min條件下對大豆粕、棉籽粕、菜籽粕、棉籽粕蛋白質(zhì)保護效果。試驗安排為單因素多水平試驗設計，共24個處理組。采用半體內(nèi)法(in situ) 和三步法分別評定各處理組產(chǎn)品的瘤胃蛋白降解率和小腸消化率。結(jié)果表明：在此試驗條件下，甲醛、戊糖、己醛糖、蔗糖、己酮糖加熱保護處理對大豆粕、棉籽粕、菜籽粕、花生粕都具有一定的保護作用，其中戊糖的保護效果最為理想，優(yōu)于甲醛處理組，其他各保護劑的效果均低于甲醛。大豆粕和菜籽粕對不同保護劑處理較為敏感，而棉籽粕和花生粕次之。
關鍵詞：糖及粕類資源;瘤胃蛋白保護;美拉德反應
Key words: sugar and meal resource;rumen protected protein; Maillard reaction;
Abstract：The protective effect of treated protein meal with different sugar under the condition of sugar dosage 3% heated for 90min(140℃),based on the formaldehyde treatment as positive control. The experience was examined in one-factor multy-level design, total 24 experimental treatments. The rumen degradable rate of protected protein and rate of small intestinal digestibility was estimated by nylon bag technique and the three-step procedure. The result suggest: there is certain protective effect for all protein meal by sugar treated. Protective effect of xylose treatment is better than formaldehyde, compare with other sugur treatment. The treatments of soybean meal and rapeseed meal which treated by the different sugar is more effective than Canola meal and Peanut meal.
前言
蛋白質(zhì)飼料是制約動物生產(chǎn)性能發(fā)揮的關鍵因素之一，在中國，大豆粕、棉籽粕、菜籽粕、花生粕是生產(chǎn)中常用的優(yōu)質(zhì)蛋白飼料，然而它們的蛋白質(zhì)在瘤胃中降解率較高，特別是豆粕的降解率高達60%(瘤胃12小時)以上 ，這一方面造成蛋白資源的浪費，同時也不能滿足高產(chǎn)奶牛及生長發(fā)育快的反芻動物對未降解蛋白的需要。因此，對于那些降解率較高的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，有必要采取適當?shù)谋Ｗo措施，在保證能滿足微生物對可降解氮源需要的前提下，增加小腸可利用蛋白質(zhì)數(shù)量，滿足高產(chǎn)奶牛對蛋白質(zhì)的需要，提高了蛋白質(zhì)飼料的利用效率，節(jié)約蛋白質(zhì)資源，緩解我國飼料蛋白資源缺乏的現(xiàn)狀。
對蛋白質(zhì)飼料進行保護處理，已有報道在蛋白質(zhì)飼料中添加甲醛可以有效的保護蛋白質(zhì)在瘤胃免受微生物的降解，盡管其保護效果得到公認，但是因為甲醛具有毒性且易在畜體內(nèi)殘留，有悖于綠色養(yǎng)殖的觀念，這使甲醛保護法受到質(zhì)疑，也限制了在實際生產(chǎn)中的應用。
楊威試驗結(jié)果(楊威，2007)[1]表明：利用美拉德反應在140℃-90min-3%的條件下大豆粕可以獲得最低的瘤胃蛋白降解率及較高的小腸可吸收蛋白，具有較好的保護作用。美拉德反應是氨基酸和蛋白之間的反應，那么用其他糖處理保護大豆粕是否也可以獲得同樣的保護作用及這些不同的糖對其他粕類蛋白是否具有保護效果都值得我們進一步研究。目前，國內(nèi)在此方面的研究還尚未見報道，本試驗擬從美拉德反應的原理入手，研究不同糖對不同餅粕的保護效果，為拓展蛋白保護方法開拓思路，提供參考。
1.材料與方法：
1.1試驗材料與設備：
保護劑 戊糖：食品級，含量99%;
己酮糖、己醛糖、蔗糖，甲醛 (甲醛濃度為38%)
蛋白質(zhì)飼料原料：
大豆粕：飼料級，CP44.39%;
棉籽粕：飼料級，CP 44.48%
菜籽粕：飼料級，CP 36.79%
花生粕：飼料級，CP 45.20%
試劑及儀器：
胃蛋白酶(sigma7012，活性在2500-3500u/mgCP);
胰液素(sigma7545)，成分：淀粉酶、胰島素、脂肪酶、核糖核酸酶、蛋白酶;
凱氏定氮儀KJ2300(瑞士FOSS公司);
CR226型10000g冷凍離心機(日本日立公司);
DSHZ恒溫水域搖床(江蘇太倉試驗儀器公司);
50ml離心管、實驗室常規(guī)試劑及分析儀器;
尼龍袋等。
1.2試驗設計：
用戊糖(X)、己酮糖(F)、己醛糖(G)、蔗糖(S)、甲醛分別保護處理大豆粕(SM)、棉籽粕(CM) 、菜籽粕(RM)、花生粕(PM)，共得到24個處理組，每處理6個重復，共144個樣品,試驗設計見表1
表1 三因素隨機試驗安排| 保護劑粕類 | X | S | F | G | 甲醛 | CK |
| SM | X-SM | S-SM | F-SM | G-SM | 甲醛-SM | SM |
| CM | X-CM | S-CM | F-CM | G-CM | 甲醛-CM | CM |
| RM | X-RM | S-RM | F-RM | G-RM | 甲醛-RM | RM |
| PM | X-PM | S-PM | F-PM | G-PM | 甲醛-PM | PM |
1.3 試驗方法：
半體內(nèi)法(in situ): 用尼龍袋測定保護處理大豆粕2h、6h、12h、24h、48h瘤胃降解率，(參照馮仰廉,1989)[2];
體外法 (in vitro): 用三步法(Calsamiglia,1995方法)[3]測定小腸消化率，計算小腸可吸收蛋白，綜合評定各處理組的蛋白保護效果。小腸可吸收蛋白=(1-12h瘤胃蛋白降解率%)*12h殘渣的小腸消化率%。
粗蛋白質(zhì)含量分析采用GB/T 6432—94
樣品處理：大豆粕粉碎過20目篩，按糖保護劑：大豆粕(DM)=3：100的比例進行配制。然后140℃加熱90min，室溫回潮，備用;甲醛保護樣品的制備：按100g大豆粕蛋白質(zhì)稱甲醛0.6g用水稀釋10倍后噴霧，與大豆粕混合均勻，密封24小時后備用。
1.4試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析
采用SPSS13.0一般線性分析單因變量多因素方差分析，用Duncan進行顯著性檢驗。用平均值 ± MSD表示。為了對所有處理組進行篩選，通過T檢驗得出處理組之間平均值的差異顯著性。
2.試驗結(jié)果與分析：
2.1各因素對DM瘤胃降解率的影響
用甲醛、戊糖、蔗糖、己酮糖、己醛糖對大豆粕、棉籽粕、菜籽粕和花生粕進行保護處理，其瘤胃DM降解率見圖1-圖4。圖2所示棉籽粕與圖4所示的花生粕DM降解率中戊糖處理各時間點均顯著低于對照組，其他糖的保護處理與對照組較為相似。從圖1，圖3可以看出，在菜籽粕中的各保護劑在各時間點的DM降解率與大豆粕相似，即各保護劑處理組的DM降解率在各時間點的DM降解率都按一定的順序依次下降，戊糖處理組最低。
不同保護劑處理對大豆粕瘤胃DM降解率的影響
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不同保護劑處理對棉籽粕瘤胃DM降解率的影響
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不同保護劑處理對菜籽粕DM降解率的影響
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不同保護劑處理對花生粕瘤胃DM降解率的影響
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綜上所述，甲醛和各種醣類保護劑對大豆粕、菜籽粕、棉籽粕、花生粕在瘤胃的DM降解率都有影響，經(jīng)過保護處理四種粕DM瘤胃降解率都有明顯下降，特別是瘤胃發(fā)酵6小時以后效果比較顯著。在五種保護劑中戊糖的作用最為明顯，其次是甲醛，己醛糖、己酮糖和蔗糖。
2.2不同保護劑對四種蛋白質(zhì)飼料的保護效果
以瘺管牛為試驗動物，用尼龍袋(in situ)法測得了經(jīng)過不同保護劑處理的蛋白質(zhì)飼料在瘤胃12h的蛋白質(zhì)降解率，用三步法測定了處理樣品在小腸的消化率并推導出了小腸可吸收蛋白率。
2.2.1不同保護劑處理對大豆粕蛋白質(zhì)保護效果
表2 大豆粕的瘤胃蛋白降解率(%)、小腸消化率(%)及小腸可吸收蛋白(%)
Table 2 RDP,ID and IADP of SBM| | 12h蛋白降解率(RDP) | 小腸消化率(ID) | 小腸可吸收蛋白(IADP) |
| 對照 | 73.04±2.61f | 75.63±1.88b | 20.39±2.33a |
| 戊糖 | 15.72±1.81a | 64.92±1.51a | 54.71±1.18d |
| 蔗糖 | 61.85±2.94d | 75.05±3.17b | 28.63±6.53b |
| 己酮糖 | 67.38 ± 6.63e | 74.07±3.10b | 26.22±5.23b |
| 己醛糖 | 40.49±1.11c | 73.27±3.15b | 43.88±5.82c |
| 甲醛 | 28.28±2.72b | 74.95±1.42b | 53.75±3.49d |
注：1.同列相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同表示差異顯著(P<0.05)(n=6)
由表2可以看出，各保護劑處理組的蛋白降解率都顯著低于對照組，不同保護劑對蛋白降解率的影響差異顯著，其中戊糖-大豆粕蛋白降解率下降最為劇烈為15.72%，比對照組蛋白降解率73.04%低57.32個百分點，其次是甲醛，己醛糖、蔗糖、己酮糖。各處理組之間依次下降約10-20個百分點?？梢钥闯霾煌菍档痛蠖蛊傻鞍捉到饴实男Ч町愝^大。
各保護劑處理組的小腸可吸收蛋白均顯著高于對照組(P<0.05)，這表明各保護劑處理均對蛋白有保護作用。其中保護效果最好的是戊糖，小腸可吸收蛋白是對照組的1.68倍，其次是甲醛、己醛糖，而己酮糖和蔗糖也有保護效果，但效果次之。
但值得注意的是，大豆粕經(jīng)過戊糖處理在小腸消化率比較低，然而小腸可吸收蛋白(IADP)則比較高。
2.2.2不同保護劑處理對棉籽粕蛋白質(zhì)的保護效果
表3 棉籽粕的瘤胃蛋白降解率(%)、小腸消化率(%)及小腸可吸收蛋白(%)
Table 3 RDP,ID and IADP of CM| | 12h蛋白降解率(RDP) | 小腸消化率(ID) | 小腸可吸收蛋白(IADP) |
| 對照 | 68.00± 3.43d | 65.39±1.39c | 20.92±3.26a |
| 戊糖 | 52.85±6.20a | 60.02±4.37b | 28.30±3.72d |
| 蔗糖 | 64.29±5.70c | 58.26±5.19b | 20.80±1.78a |
| 己酮糖 | 63.81±6.57c | 53.45±2.47a | 19.34±2.46a |
| 己醛糖 | 62.56±8.14c | 64.65±1.22c | 24.20±2.08b |
| 甲醛 | 58.96±1.89b | 65.25±0.96c | 26.78±1.70c |
注:同列相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同表示差異顯著(P<0.05)(n=6)
不同保護劑處理棉粕的效果見表3，可以看出各保護劑處理均使棉籽粕的蛋白降解率顯著低于對照組(P<0.05)，其各處理組與對照組的差異沒有同等條件下對大豆粕的影響顯著。其中和大豆粕相同的是：戊糖處理組的蛋白降解率最低，其次為甲醛處理組及己醛糖、己酮糖、蔗糖處理組。從小腸消化率來看，保護處理對棉籽粕的小腸消化率有很大的影響，己酮糖、蔗糖、戊糖處理使棉籽粕小腸消化率降低。各保護劑處理組的小腸可吸收蛋白差異不大，都在20-30%之間;戊糖組小腸可吸收蛋白最高為28.3%，比對照組提高了38%，而己酮糖、蔗糖處理可以使棉籽粕有更多的UIP到達小腸但因為其在小腸的消化率降低而使在小腸中的可吸收蛋白沒有增加，沒有保護作用。
2.2.3不同保護劑處理對菜籽粕蛋白質(zhì)保護效果
表4菜籽粕的12h瘤胃蛋白降解率(%)、小腸消化率(%)及小腸可吸收蛋白(%)
Table4 RDP,ID and IADP of RM| | 12h蛋白降解率(RDP) | 小腸消化率(ID) | 小腸可吸收蛋白(IADP) |
| 對照 | 71.90 ± 3.47e | 69.55±0.30c | 19.54±1.96a |
| 戊糖 | 28.93±1.70a | 65.52±1.07b | 46.56±1.11f |
| 蔗糖 | 55.16±3.23c | 68.56±1.32c | 30.74±2.22d |
| 己酮糖 | 63.22±4.74d | 60.93±1.19a | 22.41±2.89b |
| 己醛糖 | 56.18±5.93c | 62.13±4.40a | 27.22±3.69c |
| 甲醛 | 46.50±0.59b | 68.95±1.42c | 37.18±0.41e |
注:同列相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同表示差異顯著(P<0.05)(n=6)
菜籽粕中各保護劑處理組的12h瘤胃蛋白降解率均顯著降低了對照組(P<0.05)，其中降幅最大的是戊糖處理組(見表4)。各保護劑處理組的小腸消化率，己酮糖、己醛糖和戊糖組顯著低于對照組，形成了過保護。戊糖的小腸可吸收蛋白最高，其次是甲醛、蔗糖、己醛糖、己酮糖，分別是對照組的2.38，1.90，1.57，1.39、1.14倍，保護效果顯著(P<0.05)。
2.2.4不同保護劑處理對花生粕蛋白質(zhì)保護效果
表5花生粕瘤胃蛋白降解率(%)、小腸消化率(%)及小腸可吸收蛋白(%)
Table5 RDP,ID and IADP of PM| | 12h蛋白降解率(RDP) | 小腸消化率(ID) | 小腸可吸收蛋白(IADP) |
| 對照 | 44.53±5.53d | 86.73±2.74b | 48.11±4.67a |
| 戊糖 | 25.57±1.45a | 86.55±0.55b | 64.42±1.28d |
| 蔗糖 | 45.35±2.39d | 85.11±2.32ab | 46.51±2.04a |
| 己酮糖 | 43.54±5.54d | 84.92±4.83ab | 47.55±4.80a |
| 己醛糖 | 31.44±7.55b | 86.07±0.35ab | 59.01±6.50c |
| 甲醛 | 38.85±5.69c | 83.40±0.96a | 51.00±4.75b |
注:同列相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同表示差異顯著(P<0.05)(n=6)
如表5，蔗糖、己酮糖處理花生粕的瘤胃蛋白降解率與對照組差異不顯著(P>0.05)，沒有提供更多的UIP到達小腸，所以在此試驗條件下蔗糖、己酮糖組對花生粕沒有蛋白保護作用，而戊糖、己醛糖、甲醛處理組瘤胃降解率顯著低于對照組(P<0.05)。各保護處理對小腸消化率沒不良影響(甲醛處理除外)。戊糖、己醛糖、甲醛處理組的小腸的可吸收蛋白均顯著高于對照組，具有保護作用。
3. 討論：
3.1醣類對蛋白飼料保護效果的影響
醣的種類：美拉德反應是糖的羰基和氨基酸的氨基之間發(fā)生的反應，糖是參與反應的主要物質(zhì)也是影響美拉德反應的主要因素，研究表明：五碳糖褐變速度是六碳糖的10倍，還原性單糖中五碳糖比六碳糖更容易反應;單糖比雙糖較容易反應。這與本試驗中保護效果戊糖>己醛糖的結(jié)論相一致。Cleale(1987) [4]用戊糖、己醛糖、己酮糖按1、3、5mol/mol大豆粕賴氨酸的比例150℃加熱30、60、90min后的研究結(jié)果表明：隨著糖濃度的增加，瘤胃蛋白降解率直線下降，戊糖是反應最活躍的糖。戊糖處理組瘤胃氨釋放最低，依次是己醛糖、己酮糖，這與本試驗的結(jié)論一致。
K. Stanford (1995) [5]用木質(zhì)磺化鹽(95℃加熱1小時)保護大豆粕、棉籽粕，結(jié)果表明，戊糖保護處理顯著的降低了大豆粕、棉籽粕的瘤胃降解率。K. A. Beauchemin (1995)[6]用5%木質(zhì)磺化素保護棉籽粕，100℃加熱1小時，測得(尼龍袋法)瘤胃降解率為26.7%，顯著低于對照組的55.1%。Harstad(2000)[7]均發(fā)現(xiàn)木質(zhì)磺化鹽和甲醛處理對大豆粕蛋白的小腸消化率沒有影響。這些都與本試驗的數(shù)據(jù)相似。
表2表明，用戊糖處理的大豆粕在瘤胃的降解率明顯低于其他處理(P<0.05)，而在小腸的消化率也是最低，可能的原因是本試驗選用的反應條件使大豆粕蛋白質(zhì)的氨基酸殘基和戊糖的羰基化合物之間發(fā)生了過多的美拉德，導致反應形成了不容易被小腸酶分解的產(chǎn)物，從而使小腸消化率較低。
醣類的添加量：A.Can(2002)[8]用己醛糖作為非酶褐變劑保護對大豆粕進行保護處理加熱30和60min，進行瘤胃降解率的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加6%己醛糖水平處理組2h、16h、24h、48h的蛋白質(zhì)降解率比0%己醛糖的降低，即提高己醛糖水平增加了UIP%。這證明一定條件下的添加一定的己醛糖對于大豆粕蛋白在瘤胃中的降解有保護作用，本試驗中醣類的添加量為3%，所得出的結(jié)果基本和所報道的試驗結(jié)論一致。
3.2不同的蛋白質(zhì)飼料對保護效果的影響
美拉德反應(Maillard reaction)是氨基化合物(如胺、氨基酸、蛋白質(zhì)等)和羰基化合物(如還原糖、脂質(zhì)以及由此而來的醛、酮、多酚、抗壞血酸、類固醇等)之間發(fā)生的非酶反應，也稱為羰氨反應，所以提供氨基化合物的蛋白質(zhì)飼料特性及其與還原糖的比例也是影響美拉德反應的主要因素。KariLjkΦjel(2003)[9]用5mol己醛糖/mol大豆粕賴氨酸保護大麥和豌豆，100、125、150℃加熱5、15、30min加熱，結(jié)果表明：添加己醛糖對大麥中瘤胃蛋白降解率沒有影響，但使豌豆的降低。這可能是大麥中還原糖的量和其他碳水化合物的還原殘片可能足夠與游離賴氨酸殘基連接，相反，豌豆中碳水化合物：蛋白比例較低，其賴氨酸：蛋白也較大麥高，所以添加己醛糖促進了美拉德反應的進行，使豌豆的瘤胃蛋白降解率下降。另外，在美拉德反應中，含ε-氨基的氨基酸最易起反應，堿性氨基酸其次，在所有的氨基酸中，富含賴氨酸的食品易于產(chǎn)生褐變反應?；谝陨显?，可以解釋本試驗中，相同的保護條件下，己酮糖使豆粕、棉籽粕、菜籽粕瘤胃蛋白降解率下降(P<0.05)，卻對花生粕的瘤胃降解率沒有影響(P>0.05);以及戊糖處理對豆粕的瘤胃蛋白降解率下降較為顯著，而對棉粕的蛋白降解率影響相對較小的原因。
采用美拉德反應原理對粕類蛋白保護是一種全新的方法，雖然本試驗中不同糖對大豆粕等粕類蛋白具有一定的保護作用，但是因為試驗條件的限制，對溫度、加熱時間及保護劑條件還需要進一步的篩選才能獲得更為理想的結(jié)果。還需要對其中的更多因素展開試驗研究，方能取得最佳的保護效果，為實際應用提供參考。
4.結(jié)論：
在本試驗條件下，戊糖、甲醛、己醛糖、蔗糖、己酮糖加熱保護處理對大豆粕、棉籽粕、菜籽粕、花生粕都具有一定的保護作用：不同糖的保護效果因粕類的不同而各有差異，其中戊糖的保護效果最為理想，經(jīng)過戊糖處理的蛋白質(zhì)飼料的小腸可吸收蛋白IADP最高;大豆粕對不同保護劑處理較為敏感，其他蛋白質(zhì)飼料依次為菜粕、棉籽粕和花生粕。
參考文獻：
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