畜牧人

標(biāo)題: 請(qǐng)大家?guī)臀铱纯疵富畹驮蛟谀?[打印本頁(yè)]
作者: wy0351    時(shí)間: 2011-2-14 09:56
標(biāo)題: 請(qǐng)大家?guī)臀铱纯疵富畹驮蛟谀?br />
請(qǐng)教大家，幫我看看為什么我5000U的植酸酶測(cè)出來(lái)總是2000多一些，我用的挑戰(zhàn)的植酸酶。
1、溶液配制：
1.1.乙酸緩沖液(1)：稱取20.52g無(wú)水乙酸鈉于1000 ml燒杯中，加入900ml蒸餾水溶解，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至5.50±0.01，移至1000ml容量瓶中，蒸餾水定容至刻度。室溫下存放2個(gè)月有效。
1.2.乙酸緩沖液(2)：稱取20.52g無(wú)水乙酸鈉，0.5 ml TritonX-100, 0.5g牛血清白蛋白于1000ml燒杯中，加入900ml蒸餾水溶解，用冰乙酸調(diào)pH至5.50±0.01，移至1000ml容量瓶中，蒸餾水定容至刻度，室溫下存放2個(gè)月有效。

1.3.硝酸溶液：1+2水溶液。

1.4.鉬酸銨溶液：稱取10g鉬酸銨于100ml容量瓶中，加蒸餾水溶解（微加熱），加入1ml氨水(25％)，用蒸餾水定容至刻度。

1.5.偏釩酸銨溶液：稱取0.235 g偏釩酸銨于100mL棕色容量瓶中，加50ml蒸餾水微加熱溶解，待溶液冷卻后加入2 mL硝酸溶液(1.3)，用蒸餾水溶解定容至刻度。避光條件下保存一周有效。
1.6.顯色終止液：移取2份硝酸溶液(1.3)，1份鉬酸銨溶液(1.4)，1份偏釩酸銨溶液(1.5)混合后使用，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.7．植酸鈉溶液：（sigmaP0109）稱取0.69g肌醇六磷酸鈉(C6H6O24P6Na12)于100mL容量瓶中，用乙酸緩沖液(2)溶解并定容至刻度，現(xiàn)用現(xiàn)配(實(shí)際反應(yīng)液中的最終濃度為5.0 mmol／L)。


1.8基準(zhǔn)物：準(zhǔn)確稱取0.6804g在105℃烘至恒重的基準(zhǔn)磷酸二氫鉀于100ml容量瓶中，用乙酸緩沖液（1）溶解，準(zhǔn)確定容至刻度（濃度為50.0µmol/ml）。
2、測(cè)定步驟：
2.1.標(biāo)準(zhǔn)曲線：
按下列圖表用乙酸緩沖液(2)稀釋成不同濃度，與待測(cè)試樣一起反應(yīng)測(cè)定
標(biāo)準(zhǔn)稀釋比例
標(biāo)液序號(hào)
稀釋倍數(shù)
濃度/（µmol/ml）
1
0.5→16
1.5625
2
0.5→8
3.125
3
0.5→4
6.25
4
1→4
12.5
5
1→2
25





2.2.樣品溶液制備：
準(zhǔn)確稱取植酸酶試樣1g，置于100ml容量瓶中，加入乙酸緩沖液（2）搖勻并定容至刻度，放入磁力棒，在磁力攪拌器上高速攪拌40min，將提取后的試樣在離心機(jī)上以4000r/min離心15min，取上清液1ml于100ml容量瓶中，用乙酸緩沖液（2）定容至刻度，使樣液濃度保持在0.5U/ml左右，待反應(yīng)。
2.3．反應(yīng)步驟：
取9支刻度試管，按下面順序進(jìn)行操作，標(biāo)準(zhǔn)空白加0.2ml乙酸緩沖液(2)，
反應(yīng)順序
樣品、標(biāo)準(zhǔn)
樣品空白（標(biāo)準(zhǔn)空白）
1、乙酸緩沖液1（ml）
1.8
1.8
2、待反應(yīng)液（ml）
0.2
0.2
3、混合
√
√
4、37℃水浴預(yù)熱5min
√
√
5、依次加入底物溶液（ml）
4
4（第二步）
6、混合
√
√
7、37℃水浴水解30min
√
√
8、依次加入終止液（ml）
4
4（第一步）
9、混合
√
√
2.4．樣品測(cè)定
反應(yīng)后將試樣在常溫下靜置10min，出現(xiàn)渾濁，然后在離心機(jī)上以4000r/min離心15min，取上清液以標(biāo)準(zhǔn)空白調(diào)零，在分光光度計(jì)波長(zhǎng)為415nm處測(cè)出各個(gè)吸光值。
以吸光值為橫坐標(biāo)，摩爾量為縱坐標(biāo)作圖。Y=kx+b
3.計(jì)算公式：
    U=yn/0.2mt
U——試樣中植酸酶的活性，U／g；
y——根據(jù)實(shí)際樣液的吸光值由直線回歸萬(wàn)程計(jì)算出的無(wú)機(jī)磷的量，（μmol）
n——試樣溶液反應(yīng)前的總稀釋倍數(shù),10000；
m——試樣質(zhì)量g；
t——反應(yīng)時(shí)間min。30min
作者: 海上龍卷風(fēng)    時(shí)間: 2011-2-14 10:24
不同測(cè)定方法下酶活表現(xiàn)不一樣
作者: liyunhuddt    時(shí)間: 2011-2-14 10:48
要看你是不是和對(duì)方提供的檢驗(yàn)方法一樣
作者: xyy169    時(shí)間: 2011-2-14 14:37
植酸酶是有國(guó)標(biāo)方法的，你這個(gè)好像就是國(guó)標(biāo)。
但酶制劑的檢測(cè)，不僅只是檢測(cè)方法的問(wèn)題，更要注重的是操作細(xì)節(jié)，一個(gè)細(xì)節(jié)可能就是上幾倍，十幾倍的差距。
注意一下以下幾個(gè)方面：1、酶的溶出過(guò)程，包括時(shí)間，方法；2、緩沖液2中的牛血清白蛋白等是否有加（對(duì)有些植酸酶的影響非常大）；3、確定一下反應(yīng)溫度，可另用溫度計(jì)測(cè)試；4、加底物量是否一致，包括間隔時(shí)間等細(xì)節(jié)多注意一下。
另外你拿一個(gè)你可以檢測(cè)到5000單位的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，以確定你的操作和儀器是否正確等。
作者: wy0351    時(shí)間: 2011-2-14 16:50
回復(fù) xyy169 的帖子

樓上的，您好，我測(cè)的是直接的植酸酶，高速磁力攪拌40min，不加熱的。緩沖液2中的牛血清白蛋白，去痛100我也都加了。水浴鍋溫度控制在37.0℃。加底物和終止液都是用的1~5ml量程移液槍加的。唯一一個(gè)間隔的時(shí)間我沒(méi)有太在意。我感覺(jué)連續(xù)加，時(shí)間不會(huì)差多少吧。難道就是這個(gè)在影響嗎？
作者: tianfangxu    時(shí)間: 2011-2-15 21:13
您好，我也是做酶制劑檢驗(yàn)的，上次我也做了植酸酶，沒(méi)做出來(lái)，我把做曲線和做樣的曲線加的緩沖溶液加的搞錯(cuò)了，我做曲線不是加的緩沖液，我加的蒸餾水。我希望我們可以多多交流酶制劑方面的問(wèn)題。我最近又在糾結(jié)糖化酶......



補(bǔ)充內(nèi)容：
您稀釋的是10000倍吧，您測(cè)的植酸酶活性是多大的？
作者: wy0351    時(shí)間: 2011-2-16 09:33
回復(fù) tianfangxu 的帖子

我測(cè)的是5000U的植酸酶，稀釋10000倍
作者: wy0351    時(shí)間: 2011-2-16 11:36
回復(fù) tianfangxu 的帖子

我前一段做一幾天糖化酶。。。
作者: hxz001    時(shí)間: 2011-2-16 14:11
4樓的意見(jiàn)比較客觀
作者: akenuma    時(shí)間: 2011-6-23 17:09
我們檢測(cè)稀釋800倍



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