排卵后卵的壽命以及能引起授精的足夠數(shù)量精子的壽命，決定了輸卵管中成功受精的排卵相對時期（Hunter,1994）。六十年代已經(jīng)開展的研究表明，發(fā)情周期中授精相對較早或較晚的母豬的受精率嚴(yán)重下降。（Hancock和Hoveu,1962），而且母豬產(chǎn)仔率和一窩產(chǎn)仔數(shù)下降亦很大。（Willemse和Boender，1967）。從這些實(shí)驗(yàn)看出，因?yàn)榕怕褧r間隨發(fā)情周期變化很大，因此對精子壽命和發(fā)情周期是很難下結(jié)論的（Soede和Kemp，1997）。所以在這些實(shí)驗(yàn)中，通常使用人工排卵的小母豬來研究受精過程（例如，Dziuk,1970;Hunter,1967;Hunter,1981;Hunter et al.,1987）。這些實(shí)驗(yàn)都表明：精液的運(yùn)輸、精子細(xì)胞的獲能和精液量的多少均對授精至關(guān)重要。
近幾年來，有關(guān)自然排卵的相對受精機(jī)會的研究已有報道。研究發(fā)現(xiàn)，在一些母豬中，當(dāng)在排卵前40小時到排卵后16小時之間進(jìn)行授精（30億精子細(xì)胞用量）時，受精效果理想（Soede et al.,1995a）。然而，要使多數(shù)母豬都取得理想的受精結(jié)果，授精則須在排卵前12小時（Waberski et al.,1994a）或24小時期間（Waberski et al,1994b;Soede et al.,1995ab;Steverink et al.,1997）進(jìn)行，見圖1。
以30億精子細(xì)胞做為一個授精劑量進(jìn)行授精后，受精率因排卵的可變間隔可分別為0%、1-20%、21-40%、41-60%、61-80%、81-99%和100%（摘自Soede et al.,1995ab和Steverink et al.,1997）。從以上結(jié)論可看出，當(dāng)在排卵之前進(jìn)行授精，受精結(jié)果最佳。在排卵前0~24小時內(nèi)，多數(shù)母豬受精率達(dá)100%，在這個時段之外，部分受精的母豬的百分比和沒有受精的母豬的百分比均有所升高?；谀肛i產(chǎn)仔率和一窩產(chǎn)仔數(shù)，授精和受精之間的最佳間隔可以更長一些，可在排卵前28小時至排卵后4小時之間進(jìn)行（Nissen et al.，1997）。而事實(shí)上大約24小時的間隔會導(dǎo)致受精率下降，這意味著多數(shù)母豬中，大多數(shù)精子的受精壽命被限制在24小時內(nèi)。在排卵之前進(jìn)行授精會導(dǎo)致受精率的下降，這就是說，卵母細(xì)胞的受精壽命大約和精子與之結(jié)合并到達(dá)受精位置的時間相近似。然而，即使是在最佳時期內(nèi)，仍有部分母豬受精不理想，甚至沒有受精（見圖1）。
除了運(yùn)動性，精子的一些體外因素也與體內(nèi)受精結(jié)果有關(guān)（Colenbrander,2000）。近來，研究發(fā)現(xiàn)，（公牛和公豬）精子細(xì)胞有與透明帶或透明帶蛋白結(jié)合的能力。Harkema et al (1998)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)3小時培養(yǎng)，血管內(nèi)液中與透明帶蛋白結(jié)合的公豬精子細(xì)胞（可能是獲能精子細(xì)胞）的比例達(dá)到最高峰。高峰的水平隨公豬個體而變化極大（Harkema et al,2002）。四頭公豬的精子經(jīng)3小時培養(yǎng)后，分別有31%、40%、45%和53%的精子與透明帶蛋白結(jié)合力增強(qiáng)，體內(nèi)卵母細(xì)胞受精率（排卵后用5億精子細(xì)胞立即授精）平均為77%、82%、87%和94%，有40%、62%、67%和83%的母豬的卵細(xì)胞與精子的受精率達(dá)100%。（Harkema et al,2002）。因此，公豬精子細(xì)胞體外獲能的差別與體內(nèi)受精結(jié)果密切相關(guān)。這種正相關(guān)性是否在排卵前而非排卵后授精時發(fā)生值得探討。如果體外透明帶結(jié)合率與體內(nèi)精子細(xì)胞受精壽命存在相關(guān)的話，公豬的平均受精率可能相近，這將使之不能成為公豬選種的有效工具。然而若將不同公豬精子進(jìn)行選擇性混合可能有助于受精。
2．減少精子細(xì)胞吞噬量？
精子授精后1小時內(nèi)不能到達(dá)輸卵管，主要是由于細(xì)胞的吞噬作用。Rozeboom et al (1999)發(fā)現(xiàn)授精過程中精漿的摻入引起白細(xì)胞流入子宮腔的比率改變。資料進(jìn)一步表明，授精方式影響白細(xì)胞對精子的吞噬作用。（Woelders,2001）。因此，對白細(xì)胞的流入量和其對精子細(xì)胞的吞噬進(jìn)行調(diào)控可以改變到達(dá)受精部位的精子數(shù)和受精比率。
3．授精過程：進(jìn)行子宮的（深部位）授精？
特別是在精液昂貴的時候，由于精子數(shù)量較少，因此授精過程非常重要。（例如，有特定遺傳基因組成的公豬精液）。在西班牙（Martinez et al.,2001）和德國（Rath et al.,1999）實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)研究出了子宮深部位授精程序。用5千萬精子進(jìn)行授精，成功引起母豬懷孕。農(nóng)場試驗(yàn)中，在子宮頭蓋部進(jìn)行授精（非子宮深部）。這表明此項(xiàng)技術(shù)允許精液量減少到10億（Waston 2001）。然而，目前的子宮授精技術(shù)的弱點(diǎn)在于僅對老的同等母豬的限制性使用和缺乏技術(shù)熟練的授精人員不易掌握。
排卵基本上開始于發(fā)情后35到45小時之間（公豬出現(xiàn)后的靜立反應(yīng)）。然而，母豬間的差異是很大的。比如在10~85小時之間（Weitze et al.,1994）或10~58小時之間（Soede et al.,1995a），即使有時沒發(fā)現(xiàn)差別。另外陰道的溫度和陰道內(nèi)粘液潤滑性也不是排卵時間的理想預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)（Soede et al.,1997;Stokhof et al.,1996）。
在發(fā)情期間，母豬對所采取的促進(jìn)發(fā)情的刺激所作出的反應(yīng)先增強(qiáng)后降低（Willemse和Boender,1967）。這就是說，發(fā)情的早晚期，母豬對強(qiáng)烈刺激（如交配區(qū)探查或公豬的緊密接觸）作出反應(yīng)。當(dāng)處于發(fā)情中期時，其對較低強(qiáng)度的刺激也能作出反應(yīng)。（如公豬不在時進(jìn)行壓背法）。在發(fā)情期間，通過不同強(qiáng)度的刺激，可以區(qū)分出不同的敏感期（如公豬不在時對壓背法的敏感性，公豬與其以柵欄相隔時對壓背法的敏感性，或進(jìn)行交配區(qū)探查時對壓背法的敏感性）。Langendijk et al.,（2000b）進(jìn)行了發(fā)情探查時不同強(qiáng)度的刺激可否區(qū)分更多的反應(yīng)時期和是否能用于更精確的排卵預(yù)測兩方面的研究，但結(jié)果并不理想。大多數(shù)母豬在發(fā)情期對低強(qiáng)度刺激根本不表現(xiàn)出靜立反應(yīng)。因此，不能區(qū)分發(fā)情期不同的反應(yīng)時期。而且，即使發(fā)情時母豬表現(xiàn)出更多的反應(yīng)時期，這些時期也與排卵時間聯(lián)系甚少。
多參數(shù)（體質(zhì)和行為方面）的結(jié)合對排卵時間的估計(jì)可能比單一參數(shù)效果好。Langendijk et al （1999b）最近進(jìn)行了一次嘗試，他把母豬內(nèi)陰的潮紅溫度與發(fā)情行為特征結(jié)合起來。母豬開始發(fā)情時，陰部變紅的母豬大約占60%，其一般在排卵前18小時由潮紅變?yōu)榉奂t，并且始終在排卵前36小時和排卵后2小時之間變動。在研究中，雖然沒有檢測到激素，但陰部由潮紅到粉紅的變化可能與發(fā)情變化有關(guān)。如果這些結(jié)果正確，那么那些在發(fā)情開始內(nèi)陰戶就潮紅的母豬沒有必要在陰部潮紅消退前進(jìn)行授精，這樣精子就得到合理的利用。
發(fā)情行為的變化以及相關(guān)的排卵時間的低預(yù)測性使得在排卵前最佳時期母豬的一次性授精更為困難。因此，大多數(shù)母豬在發(fā)情期間要重復(fù)多次授精。目前的問題是重復(fù)授精是否應(yīng)在12~24小時之間進(jìn)行。Lemberson和Safranski（2000）結(jié)合每天1~2次發(fā)情檢查的結(jié)果對不同授精計(jì)劃做過經(jīng)濟(jì)上的比較。在他們的模型中，懷孕的幾率大于90%（排卵期間進(jìn)行授精），而在排卵前24小時和排卵后6小時進(jìn)行授精時，幾率降低到62%，發(fā)情后40±12h，發(fā)生排卵，從斷奶到排卵的時間在136±18h左右。應(yīng)用這些參數(shù)，在12小時期間進(jìn)行授精，經(jīng)濟(jì)回報最高。在發(fā)情后12、24和36小時，每天進(jìn)行2次發(fā)情檢查，在發(fā)情后0、12、24和36小時，每天進(jìn)行一次檢查。這些都是在排卵前的12小時內(nèi)進(jìn)行授精所見到的受精率邏輯上的結(jié)果（相對較低）。德國豬場的調(diào)查結(jié)果表明，每12小時進(jìn)行一次授精的畜群，其繁殖力并不比每24小時授精一次的畜群好。（VFV，1999）。相似的是，Castagna et al.,（2001）和Thorup（2001）也從他們的試驗(yàn)中得出結(jié)論，認(rèn)為，每隔12小時和24小時進(jìn)行授精，其繁殖力相近。后來的結(jié)果比以前提及的授精試驗(yàn)的結(jié)果（Waberski et al.,1994b;Soede et al.,1995；Nissen et al.,1996;Steverink et al.,1997）更清楚反映了每24小時進(jìn)行授精是充分的。可是，諸如技術(shù)不熟的授精人員（Flowers,1994）或精子老化（Waberski et al,1997）等因素可能會縮短授精間隔時間。
過頻的授精不僅浪費(fèi)精子、勞動力和金錢，還有很多負(fù)面影響。Rozeboom et al（1997）在發(fā)情前后進(jìn)行再次授精降低了母豬產(chǎn)仔率和每窩產(chǎn)仔數(shù)。De Winter et al.，（1992）認(rèn)為在發(fā)情前后進(jìn)行授精，其子宮受感染機(jī)會遠(yuǎn)大于發(fā)情早期和中期。這種現(xiàn)象與發(fā)情率有關(guān)，影響血流量和白細(xì)胞匯集以及子宮的收縮。
因?yàn)榕怕演^為固定的發(fā)生在發(fā)情的2/3時期，因此，發(fā)情周期的推斷既是排卵的間接推斷，又是授精最佳時間的推斷。可是發(fā)情周期變化異常，受多方面因素的影響，例如，畜舍的條件，緊張程度，季節(jié)，平等性，基因背景等（Soede和Kemp,1997）。不過在一定范圍內(nèi)，發(fā)情周期的推測是可能的。首先，雖然不同的豬場平均發(fā)情周期變化很大（31~65小時），但對同一豬廠，月與月之間是一致的（Steverink et al.,1999a）。這表明，發(fā)情期授精的最佳時間因豬場的不同而有變化。再次，發(fā)情周期與斷奶—發(fā)情間隔（WOI）密切相關(guān)。（Rojkittikhun et al.,1992,Weitze et al.,1994;Kemp和Soede,1996）。通常WOI短的（3-4天）母豬發(fā)情周期長。這與排卵時間提前有關(guān)（Weitze et al 1994;Kemp和Soede,1996）。Steverink et al（1999a）發(fā)現(xiàn)在54家豬場中，有43家WOI和發(fā)情周期的關(guān)系非常密切，約占80%。因此，在多數(shù)豬場，WOI為6天的母豬應(yīng)在發(fā)情剛剛開始后不久就進(jìn)行授精，以確保在排卵之前進(jìn)行初次授精。表1闡述了平均發(fā)情周期不同的兩家豬場，其發(fā)情周期與最佳授精時間的關(guān)系（Steverink et al 1999b）。這些數(shù)據(jù)均來自豬授精方案模型（PIGSIS；Steverink 1999）。模型證實(shí)了初次授精時間很容易太晚，特別是在發(fā)情周期短，母豬WOI為5-6天的豬場。初次授精過早并不是個大問題，可以再次授精，但應(yīng)避免在發(fā)情過后授精。因此，為了深入了解授精方案的有效度（以及發(fā)情檢查的質(zhì)量），場主們應(yīng)建立發(fā)情周期表，還應(yīng)把WOI對發(fā)情周期的影響考慮在內(nèi)，以便對母豬個體授精時間安排的最佳化進(jìn)行檢測。
2．PIGSIS：PIG Simulation model for Insemination Strategies (Steverink,1999)。
定時人工授精：
為了提高排卵時間的預(yù)測準(zhǔn)確性以及定時人工授精的可行性，可采用異種激素（eCG,hCG或GnRH）。但是否成功主要取決于管理措施（Brussow et al.,1996）。激素的應(yīng)用可能掩蓋了管理上的不善，而且耗費(fèi)大，在不久的將來，一些國家（歐盟）會相繼取締促排卵激素的使用。
同大多數(shù)哺乳動物一樣，母豬在發(fā)情期子宮肌收縮加強(qiáng)（圖3，Langendijk,et al.,2001a）。雖然在Langendijk et al(2002a)研究中，所有母豬在發(fā)情中子宮收縮加劇，但母豬個體間的差異是存在的。收縮頻率在6-40h-1之間，收縮幅度在16-57mmHg之間變動。這些不同在發(fā)情斯持續(xù)存在。例如，發(fā)情前幾天中，子宮運(yùn)動較差的母豬，因?yàn)榫舆\(yùn)動不佳而致使受精率降低。從Soede（1993）的文章中可以看出，授精時公豬的刺激，可以影響繁殖過程，例如精子運(yùn)動進(jìn)而影響受精，除外界的刺激（例如嗅覺和觸覺刺激），內(nèi)部刺激（精漿或其組成成分）也同樣重要。本文僅討論外界公豬刺激對母豬受精的影響。有關(guān)精漿成分或精子對受精的影響可參見Laus（1990）和Waberski（1997）的文章。
不管是否使用公豬外激素噴灑，壓背法對催產(chǎn)素的釋放毫無影響，但公豬的刺激可引起催產(chǎn)素急劇釋放（Langendijk,2001）。自Mattioli et al（1986）發(fā)現(xiàn)用公豬外激素噴灑可引起催產(chǎn)素釋放以來，其可行性就從未被懷疑過。Mathiasen（2001）在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，盡管公豬與母豬僅一墻之隔，但若僅靠壓背法，仍不能促進(jìn)催產(chǎn)素釋放。他進(jìn)一步指出，再用與公豬鄰舍的母豬作研究，人工刺激（壓背法結(jié)合腹股溝及溝下區(qū)刺激）可以促進(jìn)催產(chǎn)素的釋放，但低強(qiáng)度的刺激（較少刺激）對催產(chǎn)素釋放作用并不明顯。Langendijk（2001）也研究了發(fā)情期間，不同公豬刺激對子宮收縮運(yùn)動的影響。公豬的出現(xiàn)和觸覺刺激僅僅引起收縮頻率和幅度的輕微增強(qiáng)。子宮自發(fā)收縮運(yùn)動較弱（50%母豬收縮頻率小于26h-1），同觸覺刺激和外激素刺激相比，公豬的出現(xiàn)明顯增強(qiáng)了子宮收縮頻率(<0.05)。因此可以認(rèn)為授精時，公豬出現(xiàn)可以使未接觸刺激前運(yùn)動較差的子宮收縮加強(qiáng)。
人工授精能促進(jìn)子宮收縮嗎？Claus和Schams（1990）發(fā)現(xiàn)，授精導(dǎo)管插入后，無催產(chǎn)素釋放，Langendijk et al（2002a）研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)注射生理鹽水也不能促進(jìn)子宮收縮。但最近研究表明，用80ml的授精量進(jìn)行授精可使子宮收縮頻率增加50%。在交配中用交配夾模擬刺激母豬肋部，也不能促進(jìn)子宮收縮。在子宮頸內(nèi)有規(guī)律地移動導(dǎo)管5分鐘，也同樣不能促進(jìn)子宮收縮?？傊Y料表明，授精時公豬出現(xiàn)對子宮收縮較差的母豬來說，可以起到積極的作用。壓背法，交配夾模擬法或壓背外加公豬外激素噴灑均不如公豬出現(xiàn)效果好。因此，用公豬刺激母豬是明智的選擇。
表2. 授精（40ml，5億精子量）前10分鐘，40ml鹽水加1mg前列腺素進(jìn)行宮內(nèi)注射對精液回流量和受精結(jié)果的影響。（引自Langendijk et al 2002b）
鹽水（n=16）
前列腺素（n=18）
回流量1
無
11(69%)
3(17%)
少量
3(19%)
9(50%)
大量
2(13%)
6(33%)
平均受精率
81a(0~100)
21b(0~100)
精子平均進(jìn)入量
2.1a(1~21)
0~8b(1~19)
1 動物回流類型的分布因處理方法不同而存在差別（P<0.05）
ab P<0.05
除了催產(chǎn)素，前列腺素也可刺激子宮肌運(yùn)動。田間試驗(yàn)中，特別是當(dāng)條件不太理想時，例如授精人員操作不熟練（Flowers,1995）或精液老化（Flowers,1996）或夏季不育時（Pena et al 1998a,b），授精時注射催產(chǎn)素或前列腺素，可提高繁殖力（Levis,2000）。
但子宮收縮刺激過度也會降低繁殖力（Langendijk et al 2000b，見表2）試驗(yàn)中，用40ml鹽水或外加1mg前列腺素的40ml鹽水在授精（40ml，5億精子量）前10分鐘進(jìn)行宮內(nèi)注射。排卵用促性腺激素釋放激素（斷奶后85小時，50ug）計(jì)算時間，在預(yù)期排卵（一般為促性腺激素釋放激素注射后40小時）前20小時進(jìn)行授精。表2體現(xiàn)了對精液回流和受精結(jié)果的影響。前列腺素對子宮收縮作用出現(xiàn)的早，但目前發(fā)現(xiàn)其致使回流量增加，從而降低了受精率。顯然在不過分影響精子運(yùn)動和受精結(jié)果的基礎(chǔ)上控制了宮收縮的刺激是可行的。研究發(fā)現(xiàn)，前列腺素對所有母豬都有子宮收縮促進(jìn)作用，而與其自發(fā)的子宮運(yùn)動無關(guān)（Langendijk,et al 2002a），但催產(chǎn)素（注射（5IU）或公豬出現(xiàn)）對自發(fā)運(yùn)動較差的母豬特別有促進(jìn)作用。因此，只要刺激量不過度，對子宮收縮還是有所幫助的。在這方面，公豬出現(xiàn)和低水平催產(chǎn)素刺激是促進(jìn)子宮收縮的安全途徑。
許多事實(shí)證明了母豬發(fā)情期間公豬出現(xiàn)的作用（Soede和Kemp，1997）。至少幾月齡大小的公豬可以引起小母豬的發(fā)情（Kirkwood和Hughes，1980）。在行為方面，公豬比母豬更主動，熱情。Turner et al（1996）發(fā)現(xiàn)，公豬的性行為水平不影響對切除卵巢的小母豬進(jìn)行壓背法誘導(dǎo)發(fā)情檢測的效果。公豬性沖動可以用交配試驗(yàn)中的交配次數(shù)和交配前的反應(yīng)時間來計(jì)算。那么，人們也許會問這個參量是否是發(fā)情檢測中公豬選擇的一個確切的指標(biāo)？這還有待于進(jìn)一步的研究。