畜牧人

摘要：本試驗(yàn)選用六和預(yù)混料樣品，添加定量的KDN自產(chǎn)全細(xì)胞酶或植酸酶，利用DNS法檢測(cè)比較不同方法測(cè)得的酶活。結(jié)果表明，在稀釋酶緩沖液中添加6%的DETA·2Na可以明顯提高預(yù)混料中木聚糖酶或植酸酶的酶活測(cè)定值，采用一次性稀釋到位酶樣品比分級(jí)稀釋測(cè)得的木聚糖酶或植酸酶的酶活值明顯提高。

關(guān)鍵詞：預(yù)混料 木聚糖酶酶活 植酸酶酶活

飼用酶制劑的應(yīng)用效果現(xiàn)已毋庸置疑，它既能提高飼料的消化率和利用率，提高畜禽生產(chǎn)性能，又能減少畜禽排泄物中的氮、磷的排泄量，保護(hù)水體和土壤免受污染，因而飼用酶制劑作為一類高效、無(wú)毒副作用和環(huán)保型的“綠色”飼料添加劑，在21世紀(jì)將有著十分廣泛的應(yīng)用前景。然而酶制劑在飼料中的應(yīng)用還面臨一些問(wèn)題，其中對(duì)于飼料、預(yù)混料中的酶活測(cè)定方法還不成熟，有些酶由于添加劑量小及飼料中各種干擾因子如重金屬離子等影響，實(shí)驗(yàn)室測(cè)定非常困難，酶活測(cè)定結(jié)果變異較大。本試驗(yàn)在預(yù)混料中添加以木聚糖酶為主的全細(xì)胞復(fù)合酶或植酸酶，通過(guò)不同方法分別測(cè)定預(yù)混料中的木聚糖酶酶活和植酸酶酶活，目的是探討比較預(yù)混料中酶活測(cè)定優(yōu)化條件，從而為預(yù)混料中酶活檢測(cè)方法提供新思路，為建立一種相對(duì)統(tǒng)一的檢測(cè)方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試酶制劑

木聚糖酶：由康地恩集團(tuán)以黑曲霉固體發(fā)酵生產(chǎn)的以木聚糖酶為主的全細(xì)胞復(fù)合酶;

植酸酶：由康地恩集團(tuán)生產(chǎn)的顆粒植酸酶制劑5000u/g。

1.2 預(yù)混料：由山東六和青島和美飼料有限公司提供。分別為青島和美 LC633P蛋雞5%、LC15蛋雞5%、BC15肉小雞5%、BC35肉大雞5%、SB345豬4%、SB44P豬4%、LH660豬4%、EV24雞4%、BV15肉雞0.4%、DV14鴨0.4%、BV24肉雞0.4%。

1.3 木聚糖酶酶活定義

山東六和農(nóng)牧科技園企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)Q/SLH002-2006：酶樣品于40℃，pH5.0條件下，1min水解木聚糖生成相當(dāng)于1μg木糖還原物質(zhì)，即為1個(gè)酶活力單位。

1.4 植酸酶酶活定義

國(guó)標(biāo)GB/T6682-1992：樣品在植酸鈉濃度為5.0 mmol/L、溫度37℃、pH值5.5的條件下，每分鐘從植酸鈉中釋放1μmol無(wú)機(jī)磷，即為一個(gè)植酸酶活性單位。

1.5試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)分兩部分，一部分選擇預(yù)混料添加KDN全細(xì)胞酶采用不同優(yōu)化辦法進(jìn)行木聚糖酶酶活比較，另一部分選擇預(yù)混料添加植酸酶采用不同優(yōu)化辦法進(jìn)行植酸酶酶活比較。試驗(yàn)設(shè)常規(guī)對(duì)照，即直接測(cè)定酶制劑樣品的木聚糖酶酶活或植酸酶酶活，作為100%絕對(duì)酶活與在預(yù)混料中測(cè)定酶活進(jìn)行比較。

簡(jiǎn)要試驗(yàn)方案如下：

常規(guī)(對(duì)照組)：1g酶→溶解定容至100ml(稀釋緩沖液)容量瓶……;

試驗(yàn)組：0.1g酶+5g預(yù)混料混勻(LC633P、LC15、BC15、BC35)→溶解定容……;

試驗(yàn)組：0.1g酶+4g預(yù)混料混勻(SB34、SB44P、LH600、EV24)→溶解定容……;

試驗(yàn)組：0.1g酶+0.4g預(yù)混料混勻(BV14、DV鴨、BV肉雞)→溶解定容……。

2.結(jié)果與分析

2.1各種預(yù)混料中添加KDN全細(xì)胞酶后木聚糖酶酶活測(cè)定結(jié)果(見(jiàn)表1)

表1 各種預(yù)混料中添加KDN全細(xì)胞酶后測(cè)定木聚糖酶酶活

樣品木聚糖酶酶活u/g%

KDN全細(xì)胞酶+LC633P蛋雞5%61049379.4

KDN全細(xì)胞酶+LC15蛋雞5%65556185.3

KDN全細(xì)胞酶+BC15肉小雞5%67256887.5

KDN全細(xì)胞酶+BC35肉大雞5%66491486.5

KDN全細(xì)胞酶+SB34豬4%68957489.7

KDN全細(xì)胞酶+SB44P豬4%73889496.1

KDN全細(xì)胞酶+LH600豬4%72869094.8

KDN全細(xì)胞酶+EV24雞4%76610599.7

KDN全細(xì)胞酶+BV14肉雞0.4%73719395.9

KDN全細(xì)胞酶+DV鴨0.4%66661586.7

KDN全細(xì)胞酶+BV肉雞0.4%68277288.8

KDN全細(xì)胞酶768656100

由表1測(cè)定酶活結(jié)果可知，大多數(shù)預(yù)混料中木聚糖酶活實(shí)際測(cè)定值都集中在655561～766105u/g之間，實(shí)際測(cè)定酶活表明仍有0.3～15%的酶活沒(méi)有測(cè)定出來(lái)。

2.2 LC633P蛋雞5%預(yù)混料中添加KDN全細(xì)胞酶酶稀釋緩沖液中是否添加EDTA·2Na對(duì)木聚糖酶酶活的測(cè)定比較(見(jiàn)表2)

表2 LC633P蛋雞5%預(yù)混料中添加KDN全細(xì)胞酶木聚糖酶酶活測(cè)定結(jié)果

樣品酶活u/g%是否添加EDTA·2Na

KDN全細(xì)胞酶+LC633P蛋雞5%57028385.12是

KDN全細(xì)胞酶+LC633P蛋雞5%55778383.84否

KDN全細(xì)胞酶665283100否

由表2可知，預(yù)混料LC633P蛋雞5%添加KDN全細(xì)胞酶，在測(cè)定過(guò)程中添加6%的EDTA·2Na，使得測(cè)定的木聚糖酶活提高了12500u/g，即提高了1.3%。

2.3LC633P蛋雞5%預(yù)混料中添加全細(xì)胞酶是否一次性稀釋到位測(cè)定木聚糖酶酶活比較(見(jiàn)表3)

表3 LC633P蛋雞5%預(yù)混料中添加KDN全細(xì)胞酶木聚糖酶酶活測(cè)定結(jié)果

樣品酶活u/g%是否一次性稀釋

KDN全細(xì)胞酶+LC633P蛋雞5%60611691.11是

KDN全細(xì)胞酶+LC633P蛋雞5%55778383.84否

KDN全細(xì)胞酶665283100否

由表3可知，預(yù)混料LC633P蛋雞5%添加KDN全細(xì)胞酶，在測(cè)定過(guò)程中一次性稀釋到位測(cè)定，使得測(cè)定的木聚糖酶酶活提高了48333u/g，即提高了7.27%。

2.4各種預(yù)混料中添加植酸酶后植酸酶酶活測(cè)定結(jié)果(見(jiàn)表4)

表4 各種預(yù)混料中添加植酸酶后測(cè)定植酸酶酶活

樣品植酸酶酶活u/g%

植酸酶+LC633P蛋雞5%393365.17

植酸酶+LC15蛋雞5%538789.26

植酸酶+BC15肉小雞5%549991.11

植酸酶+BC35肉大雞5%581396.3

植酸酶+SB34豬4%468177.56

植酸酶+SB44P豬4%558092.46

植酸酶+LH600豬4%582096.43

植酸酶+EV24雞4%591197.94

植酸酶+BV14肉雞0.4%564693.55

植酸酶+DV鴨0.4%571594.7

植酸酶+BV肉雞0.4%558392.51

植酸酶5000u/g6035100

由表4測(cè)定酶活結(jié)果可知，大多數(shù)預(yù)混料中植酸酶活實(shí)際測(cè)定值都集中在4681～5911u/g之間，實(shí)際測(cè)定酶活表明仍有2.06～22.44%的酶活沒(méi)有測(cè)定出來(lái)。

2.5在LC633P蛋雞5%預(yù)混料中添加植酸酶酶稀釋緩沖液中是否添加EDTA·2Na對(duì)植酸酶酶活的測(cè)定比較(見(jiàn)表5)

表5 LC633P蛋雞5%預(yù)混料中添加植酸酶后植酸酶酶活測(cè)定結(jié)果

樣品酶活u/g%是否添加EDTA·2Na

植酸酶+LC633P蛋雞5%516293.06是

植酸酶+LC633P蛋雞5%426176.8否

植酸酶5000u/g5548100否

由表5可知，預(yù)混料LC633P蛋雞5%添加植酸酶，在測(cè)定過(guò)程中添加6%的EDTA·2Na，使得測(cè)定的植酸酶酶活提高了901u/g，即提高了16.26%。

2.6在LC633P蛋雞5%預(yù)混料中添加植酸酶是否一次性稀釋測(cè)定植酸酶酶活比較(見(jiàn)表6)

表6 LC633P蛋雞5%預(yù)混料中添加植酸酶后植酸酶酶活測(cè)定結(jié)果

樣品酶活u/g%是否一次性稀釋

植酸酶+LC633P蛋雞5%536696.71是

植酸酶+LC633P蛋雞5%426176.8否

植酸酶5000u/g5548100否

由表3可知，預(yù)混料LC633P蛋雞5%添加植酸酶，在測(cè)定過(guò)程中一次性稀釋到位測(cè)定，使得測(cè)定的植酸酶酶活提高了1105u/g，即提高了19.91%。

3.小結(jié)與討論

預(yù)混料中添加KDN全細(xì)胞酶和植酸酶后對(duì)預(yù)混料中木聚糖酶酶活、植酸酶酶活測(cè)定結(jié)果表明，測(cè)定過(guò)程中緩沖液添加6%的EDTA·2Na、一次性稀釋到位直接測(cè)定可以明顯提高預(yù)混料中木聚糖酶或植酸酶酶活的測(cè)定值，可以更為客觀的反映預(yù)混料中添加酶制劑的酶活含量。選用LC633P蛋雞5%預(yù)混料作為實(shí)驗(yàn)材料，是由于該預(yù)混料測(cè)得的木聚糖酶酶活、植酸酶酶活最低，選擇此預(yù)混料進(jìn)行酶活測(cè)定方法的優(yōu)化，更能說(shuō)明添加6% EDTA·2Na或一次性稀釋到位可以明顯提高酶活在預(yù)混料中的酶活實(shí)測(cè)值這個(gè)現(xiàn)象。添加6% EDTA·2Na使預(yù)混料中酶活實(shí)測(cè)值得到提高，原因是預(yù)混料中的一些重金屬離子與EDTA生成螯合物，減少了對(duì)酶蛋白的毒性影響;一次性稀釋到位法避開(kāi)了分步稀釋法中的第一步稀釋中重金屬離子濃度太高對(duì)酶的毒性失活作用，可以提高預(yù)混料中酶活的測(cè)定值，而且添加酶進(jìn)入飼料進(jìn)入消化道也是一種一次性稀釋狀態(tài)，因此一次性稀釋到位測(cè)定酶活更加真實(shí)的反映了酶在動(dòng)物消化道內(nèi)的實(shí)際情況，比較其它處理辦法而言，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)更具有實(shí)際意義。此外，通過(guò)以上試驗(yàn)表明，酶制劑添加到預(yù)混料中測(cè)定酶活值變化較大，并不能說(shuō)明酶制劑在預(yù)混料中失活，而是測(cè)定方法需要不斷的改進(jìn)和完善。本試驗(yàn)為預(yù)混料中檢測(cè)酶活的測(cè)定方法建立提供了一種新的思路，完善了酶活測(cè)定方法。添加6% EDTA·2Na或一次性稀釋到位測(cè)定預(yù)混料中的酶活，是否也可以應(yīng)用到其它酶的酶活測(cè)定方法當(dāng)中，有待于進(jìn)一步試驗(yàn)和研究。