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2019-4-29 11:18 上傳
枯草芽孢桿菌是我國農(nóng)業(yè)部允許作為飼料添加劑的兩種芽孢桿菌之一,已被越來越多地研制成飼用微生態(tài)制劑。因其制劑是無毒、無殘留、無污染的“綠色”添加劑,故具有廣闊的發(fā)展前景,并已在畜牧業(yè)、飼料業(yè)廣泛應(yīng)用,顯示巨大的社會(huì)效益和生態(tài)效益。枯草芽孢桿菌具有很強(qiáng)的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性,能產(chǎn)生抗菌素,在動(dòng)物腸道內(nèi)具有較強(qiáng)生物奪氧能力。這些特性對(duì)促進(jìn)動(dòng)物營養(yǎng)的消化吸收、提高動(dòng)物的飼料轉(zhuǎn)化率、防病和促進(jìn)生長起到重要作用。鑒于此,國內(nèi)外專家學(xué)者對(duì)研究開發(fā)枯草芽孢桿菌制劑用于畜禽養(yǎng)殖日趨關(guān)注,從而也促進(jìn)了這一產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展,但在現(xiàn)階段的工業(yè)化生產(chǎn)中,存在著制約枯草芽孢桿菌發(fā)酵的諸多因素。
1、枯草芽孢桿菌的生物學(xué)特點(diǎn)
桿菌:一般(0.7~0.8)×(2.0~3.0)μm,電子顯微鏡測(cè)量為(0.5~0.6)×(1.1~3.5)μm,革蘭氏陽性,運(yùn)動(dòng),有長而又豐富的周生鞭毛。
芽孢:橢圓形,中生或偏中生,即使孢囊膨大也不顯著。
生長溫度:最高溫度45~55℃;最低溫度5~20℃。
陽性反應(yīng):接觸酶;V-P反應(yīng);在7%的氯化鈉中生長;pH5.7生長;分解葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇產(chǎn)酸;水解淀粉;利用檸檬酸作為碳源;還原硝酸鹽為亞硝酸鹽;分解酪素;石蕊牛奶產(chǎn)堿胨化。
陰性反應(yīng):厭氧生長;卵黃反應(yīng):在葡萄糖洋菜上或酪氨酸洋菜上形成可溶性黑色素;28℃4星期水解馬尿酸鹽;利用丙酸鹽并分解酪氨酸。在55℃生長的菌株被0.02%的疊氮化合物抑制。
變化的性質(zhì):在V-P液中產(chǎn)酸(pH5.0~8.0);對(duì)溶菌酶的抗性;在10%的氯化鈉中生長。
2、芽孢桿菌制劑的作用機(jī)理
2.1可產(chǎn)生酶類和營養(yǎng)物質(zhì)
研究表明芽孢桿菌能夠分泌大量的胞外酶,如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等,有助動(dòng)物對(duì)飼料的降解、消化,提高飼料利用率。飼料中未被消化的蛋白質(zhì)和一些含氮物質(zhì)在腸道中被大腸桿菌和其他細(xì)菌脫梭生成具有潛在的毒性的腐胺、吲哚、酚類等物質(zhì)。一些芽孢桿菌可產(chǎn)生氨基氧化、SOD酶、分解硫化氫的酶以及其他抗菌物質(zhì)如過氧化氫,起到殺菌作用,從而減少動(dòng)物體內(nèi)有害物質(zhì)的產(chǎn)生。研究表明一些芽孢桿菌產(chǎn)生SOD酶,SOD可以清除生物體內(nèi)活性氧自由基,減少其對(duì)細(xì)胞的毒害作用,使生物 體免受傷害。芽孢桿菌在生長繁殖過程中可以產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸,如乙酸、丙酸、丁酸等,一些脂肪酸可降低動(dòng)物腸道的pH,從而為乳酸菌的生長創(chuàng)造條件,并且抑制病菌的生長。其中丙酸還可以參與三梭酸循環(huán),為動(dòng)物的新陳代謝提供能量。同時(shí),能夠產(chǎn)生很高的維生素B和維生素C,為動(dòng)物提供維生素營養(yǎng)。1996年Ozols對(duì)106株腸道菌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌是維生素Bl和維生素B6的主要生產(chǎn)者;1998年倪學(xué)勤等研究表明芽孢桿菌產(chǎn)生有機(jī)酸為機(jī)體提供能量營養(yǎng)的同時(shí),還促進(jìn)動(dòng)物對(duì)鈣、磷、鐵的吸收利用。
2.2生物奪氧與生物拮抗作用
腸道原籍菌群是腸道的優(yōu)勢(shì)菌,大多厭氧,而致病菌多為需氧菌。人為引入的益生芽孢桿菌在腸道定植后,消耗大量的游離氧,造成厭氧環(huán)境,可減少需氧菌對(duì)腸道的定植,并有利于乳酸桿菌和雙歧桿菌等厭氧菌的生長,致使體內(nèi)的有益菌增加而致病菌減少,保持腸道微生態(tài)系統(tǒng)平衡。芽孢桿菌與有害菌競(jìng)爭基本營養(yǎng)物質(zhì)和腸道等黏膜結(jié)合位點(diǎn),抑制有害菌從而減少腸道疾病,提高機(jī)體抗病能力。
2.3提高機(jī)體的免疫能力
近年來研究表明,芽孢桿菌能分泌活性抗菌物質(zhì),使腸道相關(guān)淋巴組織處于高度反應(yīng)狀態(tài)。同時(shí)T、B淋巴細(xì)胞的數(shù)量增多,動(dòng)物體液和細(xì)胞免疫水平提高。1992年Jonsson等報(bào)道,芽孢桿菌分泌胞外酶系的同時(shí)還產(chǎn)生抗生素。
3、芽孢桿菌飼料添加劑的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)
乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌作為益生菌的3種主要菌種來源,各自具有不同的生物學(xué)特性,在生產(chǎn)上也是各有不同。相對(duì)于另外兩種微生物,尤其是應(yīng)用最為廣泛的乳酸桿菌,芽孢桿菌具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),主要體現(xiàn)在以下三個(gè)方面。
3.1安全性很多種類芽孢桿菌及其代謝產(chǎn)物已廣泛應(yīng)用于食品、飼料中,目前尚未發(fā)現(xiàn)毒副作用,是一種安全的菌種。許多芽孢桿菌及其代謝物很早就被人們有意無意地在食品、醫(yī)藥和飼料中使用,一些芽孢桿菌屬于“公認(rèn)安全(GRAs)”的菌種,芽孢桿菌代謝產(chǎn)生的多種酶,如纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶已在食品與飼料中廣泛應(yīng)用。芽孢桿菌作為益生菌對(duì)動(dòng)物無毒害,生產(chǎn)出的肉蛋類食品也是安全的。
3.2代謝速度快芽孢桿菌易于分離、培養(yǎng)與保存,一般對(duì)營養(yǎng)要求比較簡單,代謝速度比較快,對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)的要求不高。另外芽孢對(duì)熱、紫外線、電離輻射和某些化學(xué)藥品有很強(qiáng)的抗性,可忍受不良環(huán)境,比如可以在pH酸性環(huán)境生存,也可以在溫度高達(dá)80℃甚至更高的環(huán)境中生長。
3.3分子加工操作簡便目前芽孢桿菌的分子生物學(xué)研究已比較深入,可以利用分子生物學(xué)工具和知識(shí)研發(fā)高產(chǎn)性能的菌種,提高微生態(tài)制劑的飼喂效果,比如可以把蛋白酶、木聚糖酶的基因轉(zhuǎn)移到芽孢桿菌中進(jìn)行表達(dá)等,更大程度地發(fā)揮芽孢桿菌的益生作用。
4、枯草芽孢桿菌發(fā)酵研究
所謂發(fā)酵,是借助微生物大量生成積累特定的代謝產(chǎn)物的現(xiàn)象。發(fā)酵工程是指采用現(xiàn)代工程技術(shù)手段,利用微生物的某些特定功能,為人類生產(chǎn)有用的產(chǎn)品,或直接把微生物應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)過程的一種新技術(shù)。發(fā)酵工程的內(nèi)容包括菌種的選育、培養(yǎng)基的配制。滅菌、擴(kuò)大培養(yǎng)和接種、發(fā)酵過程和產(chǎn)品的分離提純等方面。
早在1975年,美國用蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensisBerliner)發(fā)酵制各種殺蟲劑,以后各種芽孢桿菌被應(yīng)用進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)各種產(chǎn)物。如應(yīng)用地衣芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶;利用耐堿性芽孢桿菌制備堿性淀粉酶;以枯草芽孢桿菌為出發(fā)菌株發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶、木聚糖酶、D-核糖、A-乙酰乳酸脫羧酶、B2甘露聚糖酶、肌苷、堿性果膠裂解酶。枯草芽孢桿菌可以以內(nèi)生芽孢的形式發(fā)揮其功能。當(dāng)前,研究人員已經(jīng)開始對(duì)以芽孢作為發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵體系進(jìn)行摸索和優(yōu)化。張根偉等對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的組分和其他發(fā)酵條件進(jìn)行研究構(gòu)建了枯草芽孢桿菌BS-6的液體發(fā)酵體系,使該菌的最后發(fā)酵水平為1.66×109CFU/mL??紤]到發(fā)酵培養(yǎng)基原料成本及獲得途徑便利等因素,麩皮、玉米粉、豆米粉等材料已經(jīng)用于該類細(xì)菌的發(fā)酵生產(chǎn),并獲得較高的芽孢產(chǎn)量。
4.1影響芽孢桿菌發(fā)酵的因素芽孢桿菌產(chǎn)生的對(duì)熱、紫外線、電磁輻射和某些化學(xué)藥品有強(qiáng)抗性的芽孢,可忍受各種不良環(huán)境,能防治多種植物病害,易定殖在植物表面。其芽孢可以制成粉劑、可濕性粉劑等各種劑型的生防制劑而應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn),此制劑具有與化學(xué)農(nóng)藥混用而不失活的特性。因此,有必要對(duì)芽孢桿菌的產(chǎn)孢特性進(jìn)行研究,以期獲得最佳產(chǎn)孢條件,最終獲得商品化芽孢制劑。微生物發(fā)酵的生產(chǎn)水平不僅取決于生產(chǎn)菌種本身的性能,而且要提供合適的發(fā)酵條件,才能使它的生產(chǎn)能力充分發(fā)揮出來。優(yōu)化發(fā)酵工藝可以充分發(fā)揮菌種的潛在能力,提高發(fā)酵過程的生產(chǎn)效率,降低生產(chǎn)成本。因此,工藝優(yōu)化的研究尤其重要。
發(fā)酵工藝的研究可從以下兩方面入手:(1)培養(yǎng)基組分的影響:包括碳源、氮源、維生素和輔酶、無機(jī)鹽及微量元素等。
(2)發(fā)酵條件的影響:包括溫度、初始pH、初始接種量、裝液量、轉(zhuǎn)速等。
4.1.1 培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵的影響
培養(yǎng)基是人們提供微生物生長繁殖和生物合成各種代謝產(chǎn)物所需要的按一定比例配制的多種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基的組成對(duì)菌體生長繁殖、產(chǎn)物的生物合成、產(chǎn)品的分離精制乃至產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量都有重要影響。發(fā)酵工藝可分為斜面種子培養(yǎng)、種子擴(kuò)大培養(yǎng)、發(fā)酵罐內(nèi)菌體培養(yǎng)、和產(chǎn)物合成等幾個(gè)培養(yǎng)過程。種子培養(yǎng)基是供菌體生長繁殖用的,營養(yǎng)成分應(yīng)是易被菌體吸收利用,比較豐富和完整,其中氮源和維生素的含量應(yīng)略高些,但總濃度略低為宜,以便菌體的生長繁殖。發(fā)酵培養(yǎng)基是供菌體生長繁殖和合成大量代謝產(chǎn)物用的。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成要考慮菌體在發(fā)酵過程中的各種生化代謝的協(xié)調(diào),在產(chǎn)物合成期,使發(fā)酵液的pH不出現(xiàn)大的波動(dòng)。采用的原材料質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定,同時(shí)不影響產(chǎn)品的分離精制,不影響產(chǎn)品的質(zhì)量。每個(gè)過程都有其培養(yǎng)基組成和制備工藝條件的要求。因此必須按照不同培養(yǎng)階段的微生物生理學(xué)特性提供適宜的培養(yǎng)基配方。
4.1.1.1 碳源對(duì)發(fā)酵的影響
碳源是組成培養(yǎng)基的主要成分之一,其主要作用是供給菌種生命活動(dòng)所需要的能量和構(gòu)成菌體細(xì)胞成分和代謝產(chǎn)物中的碳素來源。一般的微生物可以在含各種碳水化合物的培養(yǎng)基上良好生長,但它們產(chǎn)物的生產(chǎn)能力和碳源的種類有很大關(guān)系。碳源的種類及濃度,主要是由菌種耐滲透壓高低和調(diào)節(jié)細(xì)胞膜滲透性的方法來決定,所以枯草芽孢桿菌發(fā)酵采用的碳源主要有葡萄糖、糖蜜、淀粉、玉米粉等。目前,國內(nèi)外主要選用玉米粉。
4.1.1.2 氮源對(duì)發(fā)酵的影晌
氮源的主要作用是微生物細(xì)胞物質(zhì)和含氮代謝物的氮素來源的營養(yǎng)物質(zhì)。氮源作為枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的另一個(gè)主要因素,在芽孢的形成上也發(fā)揮著重要作用??莶菅挎邨U菌在生產(chǎn)中常用豆餅粉、魚粉以及(NH4)2S04等一些試劑作氮源。C/N直接影響菌體的生長和代謝,碳源轉(zhuǎn)化為微生物自身的細(xì)胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物,并且是能源物質(zhì)。氮源是構(gòu)成微生物細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸的主要元素,而蛋白質(zhì)和核酸是微生物原生質(zhì)的主要組成部分。如果C/N偏小,會(huì)導(dǎo)致菌體生長過剩,易造成菌體提前衰老自溶;C/N過大,菌體繁殖數(shù)量少,發(fā)酵密度低,細(xì)菌代謝不平衡,不利于產(chǎn)物的積累;C/N合適,但C、N源濃度過低,則會(huì)影響菌體的繁殖,C、N濃度過高,則發(fā)酵起始導(dǎo)致菌體大量繁殖,代謝廢物過多而增加發(fā)酵液的黏度,使溶解氧降低,引起菌體代謝異常,最終也影響產(chǎn)物的合成。
4.1.1.3 無機(jī)鹽對(duì)發(fā)酵的影響
工業(yè)發(fā)酵中應(yīng)用微生物的生長繁殖和產(chǎn)物合成中都需要無機(jī)鹽和微量元素,如磷、硫、鐵、錳、鈣、鎂等。許多金屬離子對(duì)微生物生理活性的作用與其濃度相關(guān),低濃度往往呈現(xiàn)刺激作用,高濃度卻表現(xiàn)出抑制作用。錳是枯草芽孢桿菌生長的必需元素,當(dāng)培養(yǎng)基中缺少M(fèi)n2+時(shí),不適合枯草芽孢桿菌的生長,促進(jìn)芽孢的生成。提高M(jìn)n2+濃度將會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基成分比例失調(diào),滲透壓升高等一系列變化,從而誘導(dǎo)芽孢生成。
磷在菌體生長、繁殖和代謝活動(dòng)中起著極其重要的作用。一方面,磷是構(gòu)成核酸、磷脂、許多輔酶或輔基(輔酶Ⅰ、輔酶Ⅱ、輔酶A、NAD和NADP等)以及高能磷酸化合物的重要原料,另一方面,磷在代謝調(diào)節(jié)方面也起著重要的作用,磷能促進(jìn)糖代謝的進(jìn)行,促進(jìn)微生物的生長。因此,磷源是枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中另一個(gè)重要的組成成分,它的濃度直接影響著枯草芽孢桿菌菌體的生長和芽孢的形成。
鉀雖不參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分,但它是許多酶作用的激活劑,鉀還對(duì)細(xì)胞原生質(zhì)的膠體狀態(tài)和細(xì)胞膜的透性起調(diào)控作用。
鈣主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理狀態(tài),如:維持細(xì)胞的膠體狀態(tài),降低細(xì)胞膜的通透性,調(diào)節(jié)pH等。
4.1.2 其他發(fā)酵參數(shù)對(duì)發(fā)酵的影響
4.1.2.1初始pH對(duì)發(fā)酵的影響
pH是微生物生長和產(chǎn)物合成的非常重要的狀態(tài)參數(shù),是代謝活動(dòng)的綜合指標(biāo)。為了達(dá)到微生物的充分繁殖,培養(yǎng)基必須保持適當(dāng)?shù)膒H。初始pH的變化對(duì)于枯草芽孢桿菌的生產(chǎn)發(fā)酵過程影響是非常顯著的。因此,決定最佳初始pH對(duì)于細(xì)菌發(fā)酵液含菌量就顯得尤為重要。
pH影響菌量的原因:1)pH會(huì)影響微生物的細(xì)胞原生質(zhì)膜的電荷,使細(xì)胞原生質(zhì)膜發(fā)生變化,引起原生質(zhì)膜對(duì)個(gè)別離子滲透性的改變,從而影響到微生物對(duì)培養(yǎng)基中的一些營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用以及代謝物的滲漏,進(jìn)而影響微生物的生長和新陳代謝的正常進(jìn)行。2)pH會(huì)直接影響到微生物細(xì)胞內(nèi)的酶活性,在合適的pH下,微生物細(xì)胞內(nèi)的酶才能發(fā)揮最大的活性;在不合適的pH下,微生物細(xì)胞內(nèi)的某些酶的活性受到抑制,從而影響微生物的生長繁殖和新陳代謝。3)pH會(huì)影響到培養(yǎng)基中某些重要的營養(yǎng)物質(zhì)和中間代謝產(chǎn)物的離解,從而影響微生物對(duì)這些物質(zhì)的吸收和利用。
4.1.2.2溫度對(duì)發(fā)酵的影響在發(fā)酵過程中需要維持生產(chǎn)菌的生長和生產(chǎn)的適當(dāng)發(fā)酵條件,其中之一就是溫度。溫度對(duì)微生物生長的影響,是綜合影響各種代謝反應(yīng)的結(jié)果。溫度通過影響微生物膜的液晶結(jié)構(gòu)、酶和蛋白質(zhì)的合成與活性,以及RNA的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄,從而進(jìn)一步的影響微生物的生理活動(dòng)。高溫會(huì)使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)發(fā)生變性或凝固,同時(shí)還破壞了微生物細(xì)胞內(nèi)的酶活性,從而殺死微生物;而低溫又能抑制微生物的生長。任何微生物的生長都有一個(gè)最適生長溫度范圍,在此溫度范圍內(nèi),微生物生長繁殖最快。溫度過高過低,芽孢桿菌生長代謝緩慢,營養(yǎng)體都難以形成,芽孢則更難以在營養(yǎng)體內(nèi)產(chǎn)生。
4.1.2.3溶氧對(duì)發(fā)酵的影響
溶氧(Dissolve Oxygen,DO)是需氧微生物生長所必需的??莶菅挎邨U菌是好氧細(xì)菌,它產(chǎn)孢需要有氧氣的存在。MohamedIsmail等研究過的球形芽孢桿菌(Bacillusphaerlcus)芽孢形成與溶解氧的關(guān)系一樣,發(fā)現(xiàn)隨著溶解氧的濃度升高,芽孢形成量越高。但溶解氧濃度過高,反而使產(chǎn)孢量下降,這是因?yàn)閷?duì)于好氧枯草芽孢桿菌來說,在其他發(fā)酵條件一定的情況下,特別是在對(duì)數(shù)生長期和芽孢形成期,保證足夠的通氣量有利于芽孢的產(chǎn)生,培養(yǎng)基中的溶解氧水平越高越有利于芽孢的產(chǎn)生。但通氣量過大,溶解氧過量時(shí),由于菌體自溶反而使芽孢數(shù)下降。這與Youset的觀點(diǎn)相同。研究發(fā)現(xiàn),芽孢大量出現(xiàn)的時(shí)間均在枯草芽孢桿菌的對(duì)數(shù)生長末期和衰亡期以后的一段時(shí)間,但時(shí)間過長,芽孢數(shù)便會(huì)穩(wěn)定在一個(gè)水平之上,符合芽孢形成規(guī)律。
4.1.2.4初始接種量對(duì)發(fā)酵的影響
接種量是指待接種的液體培養(yǎng)基與接入的培養(yǎng)液的體積百分比。由于各級(jí)種子培養(yǎng)時(shí)間較短,因此采用大接種量有利于菌體形成群體優(yōu)勢(shì)而縮短延遲期。接種量過小則可能使延遲期延長,不利于縮短發(fā)酵周期,但接種量過大也沒有必要,因?yàn)檫^大的接種量不但不能縮短延遲期,反而會(huì)帶進(jìn)較多的代謝廢物而不利于培養(yǎng)物的生長。不同的微生物由于其生理特性的不同,要求的最適接種量大小也不同。就某種特定的微生物而言,接種量的大小既取決于其自身生理特性,同時(shí)也與培養(yǎng)物中微生物所處的生長時(shí)期相關(guān)。
4.1.2.5裝液量對(duì)發(fā)酵的影響
裝液量的多少直接影響到菌體在生長過程中對(duì)氧的獲得能力;同樣搖床轉(zhuǎn)速下,裝液量少,菌體獲得氧的含量高;裝液量多,則菌體獲得氧的含量低。氧是好氧性微生物不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)之一,它參與某些物質(zhì)代謝中的加氧反應(yīng)。另外,氧是物質(zhì)有氧降解最終的電子受體,在這個(gè)過程中,產(chǎn)生出微生物進(jìn)行生命活動(dòng)所需要的能量。對(duì)好氧性微生物來說,必須生長在有氧的環(huán)境中,供氧量的多少會(huì)直接影響到其生長或代謝作用。
總之,枯草芽孢桿菌的發(fā)酵過程中,上述的每一個(gè)因素都至關(guān)重要。其中,培養(yǎng)基除具備微生物必要的營養(yǎng)要素外,還應(yīng)具有合適的比例,所以應(yīng)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。培養(yǎng)基優(yōu)化方法多是在單因素水平試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)或是在正交試驗(yàn)基礎(chǔ)上應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)理論,或者采用通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì),均能對(duì)培養(yǎng)基優(yōu)化取得較好的效果。在工業(yè)化生產(chǎn)中,還需要對(duì)接種量、pH、溫度、轉(zhuǎn)速、通風(fēng)比、溶氧、以及消泡劑用量等一系列因素進(jìn)行嚴(yán)格控制,才能保證枯草芽孢桿菌發(fā)酵活菌數(shù)達(dá)到最高、發(fā)酵效果最好、在動(dòng)物飼料里的添加效果最理想。
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