纖維素酶酶解小麥麩皮技術初步研究

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　　纖維素酶酶解小麥麩皮技術初步研究

　　王在貴 劉朝良* 王云生

　　(安徽農(nóng)業(yè)大學生命科學學院)

　　摘要：本試驗采用還原糖法研究了不同酶解時間、溫度、pH及酶濃度條件對纖維素酶酶解小麥麩皮效果的影響。結果表明纖維素酶酶解小麥麩皮的最適條件為：酶解時間為15min，溫度為37℃，pH值為6，最適酶濃度為0.04IU/m。
　　關鍵詞：纖維素酶;小麥麩皮;酶解
　　Preliminary Study on Cellulase Enzymolysis Technology on Wheat bran
　　Wang zaigui Liu zhaoliang Wangyunsheng
　　(Life Sciences College，Anhui Agricultural Unmversity)
　　Abstract : The technology of wheat bran degradation with cellulose by DNS method was researched and the main reaction condition that included differential reaction time, temperature, pH and enzyme concentration influencing the effection of cellulase degrading wheat bran was researched.The results showed that the appropriate condition for cellulose activity degrading cellulose in wheat bran was that the reaction time was 15 min, the reaction temperature was 37 ℃, and pH 6.0, the enzyme concentration was 0.04 IU/mL.
　　Key word: Cellulase;Wheat bran;Cellulose degeneration
　　纖維素是世界上最豐富的可再生資源, 我國每年僅作物秸稈的纖維產(chǎn)量就達2億噸以上，開發(fā)和利用纖維素是促進我國畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有效途徑之一。除反芻動物瘤胃微生物可發(fā)酵利用纖維素外，其他家畜禽消化道缺乏纖維素酶，對纖維素不能有效利用或利用率低。小麥麩皮常被用作動物飼料，因含有較高的纖維素類物質(zhì)而限制了其在配方中的用量。利用纖維素酶酶解小麥麩皮中纖維素是解決這一問題的有效途徑之一。所以，對纖維素酶的研究開發(fā)是提高含纖維素類飼料資源利用效率的重要途徑。隨著菌種選育和發(fā)酵技術的快速發(fā)展，飼用纖維素酶將在畜牧業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生不可低估的作用。
　　1.材料與方法
　　1.1材料 纖維素酶(由某生物公司提供，于-30℃冰箱中保存);小麥麩皮(于電熱恒溫鼓風干燥箱中干燥24小時備用)。
　　1.2主要儀器和設備 電熱恒溫鼓風干燥箱;臺式電子天平;精密pH計;7220型分光光度計;恒溫水浴鍋。
　　1.3試劑 3,5-二硝基水楊酸(DNS);羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)。
　　1.4標準曲線的繪制與酶解反應體系
　　1.4.1標準曲線的繪制 分別吸取濃度為0.01mg/ml葡萄糖0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8ml于試管中(做3個平行)，以蒸餾水補加到1.5ml。再加入DNS試劑3ml，沸水浴10min，取出后用自來水冷卻，加入10ml蒸餾水稀釋混勻，測定吸光度OD550值，以葡萄糖毫克數(shù)為橫坐標， OD550為縱坐標繪制出標準曲線。
　　1.4.2酶解反應體系 稱取0.5g麩皮于試管中，加入纖維素酶液5ml，按照設定條件做酶解反應后，吸取酶解液1.5ml于試管中，同上方法測定OD550值，對照標準曲線即可換算出還原糖含量?？瞻讟硬贿M行酶解反應，反應樣設兩個平行樣。
　　1.5酶活力測定(吉爾鮑特，1983)
　　1.5.1酶活力單位定義。在一定的溫度和pH條件下，1min從底物溶液中分解產(chǎn)生1μmol還原糖(表示為還原糖當量)所需要的酶量為一個酶活力單位(IU)進行換算。
　　1.5.2底物。底物為1.5%CMC-Na。
　　1.5.3酶液制備。準確稱取取1.000g該酶制劑，用去離子水稀釋200倍待測定酶活力用。
　　1.5.2酶活力測定體系。反應體系添加1.4ml底物，預熱10min后加0.1ml酶液，反應10min后按照標準曲線方法測定還原糖生成量，即可換算出酶活力值。以上均為靜止恒溫水浴體系，分別設置1下空白樣和2個平行樣?？瞻坠芟燃?.4ml底物，10分鐘后加3mlDNS試劑，再加酶樣0.1ml，沸水浴顯色10min，其余同前。
　　2. 結果
　　2.1溫度對酶解效果的影響 上述反應體系中，設定初始條件為pH6.0、反應時間15分鐘，分別于30、35、40、50℃分別測定還原糖釋放量。結果(圖1)顯示，纖維素酶酶解小麥麩皮的最適溫度為37℃，從30℃到37℃還原糖釋放量上升較快，37℃后趨于下降。
　　
　　2.2反應時間對酶解效果的影響 上述反應體系(pH6.0、溫度為37℃)分別設定反應時間為10、15、20、30、40min。測定還原糖釋放量，結果(圖2)顯示，纖維素酶酶解小麥麩皮隨著反應時間的延長還原糖釋放量逐漸增加，15分鐘后增加緩慢。
　　
　　由圖2可看出，纖維素酶水解小麥麩皮的最佳時長約為17min，因為反應時間越長，實際生產(chǎn)成本也會越大，所以選定反應時長17min作為最佳。
　　2.3 pH值對酶解效果的影響 上述反應體系(其他條件為最適條件)分別設定pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0測定還原糖釋放量，結果(圖3)顯示，纖維素酶水解小麥麩皮的最適pH為 6.0，由于此pH值接近生活用水的pH值，所以在實際生產(chǎn)中應用較為方便。
　　
　　2.4 酶濃度對酶解效果的影響 將反應體系中的纖維素酶濃度設定為0.01、0.02、0.04、0.08IU/ml，測定還原糖釋放量，結果(圖4)顯示，隨著酶濃度的增加，還原糖釋放量也逐漸增加，但從0.04-0.08IU/ml范圍增加幅度放緩。最佳酶濃度在0.04IU/ml左右。
　　 4.討論與結論
　　小麥麩皮中纖維素類物質(zhì)主要為纖維素、木聚糖和木質(zhì)素等，其中纖維素可被最終降解成葡萄糖供動物吸收利用。而木聚糖和木質(zhì)素的最終降解產(chǎn)物能否被動物吸收利用目前尚無明確報道。纖維素被酶解成低聚糖對動物腸道具有保護作用，而且酶作為蛋白質(zhì)本身安全無毒，在飼料中適量添加是不會對動物產(chǎn)生有害影響的。這些都為纖維素酶在飼料中的應用提供理論和實際依據(jù)。
　　全價顆粒飼料的生產(chǎn)常伴有調(diào)質(zhì)和擠壓制粒過程，雖然飼料中含有的纖維素對酶具有保護作用，但高溫造粒仍然會造成一定程度的酶活力損失，影響該酶的實際使用效果。而體外酶解小麥麩皮可將條件控制得較溫和，減少酶活力損失，有利于該酶發(fā)揮最大潛力，且酶在隨飼料進入動物消化道后仍然發(fā)揮作用，可見體外酶解小麥麩皮方法可產(chǎn)生較為廣泛的作用。通過王在貴等(2006)對該酶的研究可以看出，該酶在動物消化道可以發(fā)揮最大酶活力。
　　本實驗中使用的纖維素酶最適溫度比常溫稍高，特別是夏季酶解條件比較易于達到和控制。最適酶解時間較短，有利于縮短生產(chǎn)周期，提高生產(chǎn)效率。最適作用pH在5.0~6.0，這和我國南方某些地方的自來水pH值比較接近，酶解條件比較容易控制。從實驗2.2結果可以看出，隨著反應時間的延長，產(chǎn)物還原糖生成的量逐漸增加，對反應速度產(chǎn)生了限制作用，但如果在動物消化道內(nèi)，新產(chǎn)生的葡萄糖和二糖可被迅速吸收，酶解反應得以繼續(xù)維持，可見在體外可以適當控制酶解時間，提高生產(chǎn)效率。從實驗2.4結果可以看出，酶和其作用底物的相對濃度都可對反應速度產(chǎn)生較大的影響，可見在實際生產(chǎn)中合理控制酶的添加濃度有利于節(jié)約成本，提高生產(chǎn)效率。
　　目標酶的選擇也十分關鍵，一般情況下，應選擇在體外能夠高效酶解小麥麩皮且穩(wěn)定性好、到體內(nèi)仍可發(fā)揮作用的酶，所以生產(chǎn)前往往需要研究酶的特性，評價酶的使用效果，以便做合理取舍，這樣才能夠達到較好的酶解效果。
　　參考文獻
　　[1]吉爾鮑特(美).酶法分析手冊[M].上?？茖W技術出版社,1983,第1版
　　[2]武漢大學主編.分析化學[M].北京：高等教育出版社，2000,第3版
　　[3]王在貴，張莉，張宏福等.纖維素酶的酶學性質(zhì)研究[J] .中國飼料，2006(1)：12~14.
　　[4]鄒國林，朱汝潘編著.酶學[M].武漢：武漢大學出版社,第1版

ququ51

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saturnbio

謝謝分享！

鄭旭陽

體外生物學效率實驗,一個關鍵問題是如何模擬動物的消化道環(huán)境,
1. 大家將焦點聚集在溫度,PH, 時間, 胃蛋白酶和小腸液處理,
2. 但是嚴重忽視了試管內(nèi)的酶制劑,底物濃度要和酶制劑在全價飼料中的劑量基本相符,
3.也許,相符后,有些酶制劑根本得不到降解產(chǎn)物, 原封未動,

lilyyang

體外生物學效率實驗,一個關鍵問題是如何模擬動物的消化道環(huán)境.
是呀，體內(nèi)與休外實驗相差很大的。