嗜高溫酶及其耐熱機(jī)制

saturnbio

　　除了核酶及脫氧核酶以外,其他酶的化學(xué)本質(zhì)都是蛋白質(zhì)。酶蛋白的一個(gè)重要性質(zhì)就是遇熱變性并失去催化活性?？墒怯行┟改茉?0 ℃以上的條件下發(fā)揮功能,這類(lèi)酶叫做嗜高溫酶。嗜高溫酶主要存在于嗜熱菌與超嗜熱古生菌中, 它們之所以能在70 ～
110 ℃的溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng),關(guān)鍵在于這類(lèi)細(xì)菌的類(lèi)脂、蛋白質(zhì)、酶及核酸等生物大分子的熱穩(wěn)定性。由于嗜高溫酶在高溫發(fā)酵、PCR 技術(shù)以及鉆井采油等方面具有廣泛的應(yīng)用前景與開(kāi)發(fā)潛力,所以研究它們的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其耐熱機(jī)制,尋找或設(shè)計(jì)新的嗜高溫酶是生產(chǎn)與科研共同關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。雖然現(xiàn)在還沒(méi)有徹底闡明嗜高溫酶的耐熱機(jī)制,但是從目前的研究結(jié)果來(lái)看,嗜高溫酶的抗熱性是由于酶本身穩(wěn)定的天然結(jié)構(gòu)以及嗜熱菌胞內(nèi)含有的熱穩(wěn)定因子對(duì)酶蛋白的保護(hù)作用。此外,鈣、鋅等金屬離子對(duì)嗜高溫酶也有熱穩(wěn)定作用。
1 　嗜高溫酶的結(jié)構(gòu)及其耐熱機(jī)制
由于早期地球是高熱缺氧的極端環(huán)境,故只有嗜熱的專(zhuān)性厭氧生物才能生存。超嗜熱古生菌的耐熱及專(zhuān)性厭氧等特點(diǎn)符合早期地球地質(zhì)的化學(xué)條件,因此這類(lèi)細(xì)菌很可能是地球早期的生命形式。如果生命開(kāi)始于生存在熱環(huán)境中的嗜高溫微生物,進(jìn)化過(guò)程則是使嗜高溫酶轉(zhuǎn)變成嗜常溫酶及嗜低溫酶。研究引起嗜高溫酶變化的因素,比較同源酶的結(jié)構(gòu)差別,對(duì)于了解生命起源與進(jìn)化,設(shè)計(jì)新酶以及認(rèn)識(shí)嗜高溫酶的耐熱機(jī)制都會(huì)提供重要的啟示。
人們對(duì)嗜高溫酶和嗜常溫酶的氨基酸序列差異進(jìn)行了大量的研究,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)嗜高溫酶與同源嗜常溫酶的氨基酸序列同源性很大,只有某些關(guān)鍵區(qū)域少數(shù)氨基酸的變化,但也有些同源酶的氨基酸序列同源性較小,出現(xiàn)大量的氨基酸取代或插入。不管屬于哪種情況,酶蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)都對(duì)其本身的抗熱性具有重要作用。因?yàn)榫S持蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵(氫鍵、離子鍵及疏水鍵等) 都是由氨基酸序列中的側(cè)鏈基團(tuán)參與形成的,故嗜高溫酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)改變就會(huì)引起這些次級(jí)鍵變化或者增加了次級(jí)鍵的數(shù)量,從而使酶分子的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定,因而也更具抗熱性。
Tesfay HS 分析比較了嗜熱脂肪芽孢桿菌( Bacil2lus stearothermophilus) 的熱穩(wěn)定性3 - 磷酸甘油醛脫氫酶- GPDH - ST ( 80 ℃保溫10min 仍保持活性) 和Bacillus coagulans 的熱不穩(wěn)定的3 - 磷酸甘油醛脫氫酶- GPDH - CO(55 ℃保溫5min 就失去95～100%的活性) 的氨基酸序列,這兩種酶都含有335 個(gè)氨基酸殘基,其序列同源性高達(dá)91. 6 %。這就暗示酶的耐熱性是由少數(shù)氨基酸的變化而引起的。GPDH - ST 與GPDH - CO 的氨基酸序列的差別體現(xiàn)在28 個(gè)氨基酸殘基上,它們主要分布在肽鏈中間的三分之一處。其中有5 個(gè)是GPDH - ST 中的脯氨酸代替了GPDH -CO 中的丙氨酸。脯氨酸的結(jié)構(gòu)熵比其他氨基酸小且更容易折疊,但是一旦折疊就需要更多的能量才能解開(kāi)。每個(gè)脯氨酸代替丙氨酸后能為折疊提供約1Kcal/mol 的自由能,故5 個(gè)脯氨酸代替的加合作用就極大地提高了酶的抗熱性。
由熱球菌( Thermcoccus litoralis ) 產(chǎn)生的Vent TMDNA 聚合酶和水生棲熱菌( Tnermus aqustics) 產(chǎn)生的Taq DNA 聚合酶都是嗜高溫酶。它們不僅為PCR 技術(shù)大量體外擴(kuò)增DNA 提供了條件,而且也使PCR 技術(shù)得到了迅速發(fā)展與廣泛應(yīng)用。將Taq 聚合酶的大片段( Klentaq1) 與大腸桿菌( Escherichia coli ) DNA 聚合酶I 的Klenow 片段( Klenow pol I) 進(jìn)行比較,其序列同源性只有49. 6 %。進(jìn)一步分析它們的結(jié)構(gòu)后證明,兩·4 · 生物學(xué)教學(xué)2002 年(第27 卷)第4 期者C - 末端的折疊結(jié)構(gòu)相似,而N - 末端的結(jié)構(gòu)不同。Klentap1 N - 末端功能區(qū)的氨基酸序列與構(gòu)象重排形成了一個(gè)疏水性更強(qiáng)的核心,同時(shí)消除了不利于熱穩(wěn)定的靜電相互作用。其原因是Klentaq1 N - 末端功能區(qū)含有13 個(gè)脯氨酸,占總氨基酸數(shù)目的10 % ,大量地代替了Klenow pol I 中的丙氨酸。這種一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化使Klenraq1 中形成了一個(gè)富含脯氨酸的袢結(jié)構(gòu)代替了Klenow Pol I 中的A 螺旋。Klenow Pol I 中的有靜電相互作用的殘基被Klentaq1 中的疏水或芳香殘基代替。盡管維持蛋白質(zhì)三、四級(jí)結(jié)構(gòu)的力有各種次級(jí)鍵,但是疏水力是最主要的力,故增加疏水有利于穩(wěn)定酶蛋白的結(jié)構(gòu)并提高了耐熱性。
現(xiàn)已從嗜高溫原生細(xì)菌( Pyrococcus f uriosus Pf ) 中分離出了紅氧還蛋白,醛鐵氧還蛋白及鐵氧還蛋白,并且測(cè)定了紅氧還蛋白和醛鐵氧還蛋白的晶體結(jié)構(gòu),確定了鐵氧還蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。雖然因缺乏與之對(duì)應(yīng)的嗜常溫酶而無(wú)法通過(guò)比較而得知醛鐵氧還蛋白在100 ℃時(shí)穩(wěn)定的確切原因,但是通過(guò)比較與醛鐵氧還蛋白分子大小相近的30 種嗜常溫酶后發(fā)現(xiàn),醛鐵氧還蛋白的表面積相對(duì)較小。說(shuō)明它的分子結(jié)構(gòu)比較緊密,同時(shí)這種形態(tài)可減少溶劑反應(yīng)并增加酶的熱穩(wěn)定性,嗜高溫細(xì)菌Thermotoga 的3 - 磷酸甘油醛脫氫酶與嗜常溫酶的分子大小相近且結(jié)構(gòu)相似,可是表面積與體積的比也比較小。
由于酶的熱變性是因破壞次級(jí)鍵而引起構(gòu)象破壞并失去生物活性的過(guò)程,故人們?cè)噲D通過(guò)研究嗜高溫酶的構(gòu)象與次級(jí)鍵來(lái)了解其耐熱機(jī)制。到目前為止,還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)嗜高溫酶中有維持構(gòu)象的特殊鍵,只是這些鍵的數(shù)量與嗜常溫酶不同。Pf 的紅氧還蛋白和鐵氧還蛋白特別耐熱,在118～125 ℃時(shí)才發(fā)生熱變性。通過(guò)核磁共振與晶體結(jié)構(gòu)圖分析表明,嗜高溫的紅氧還蛋白與已知的嗜常溫紅氧還蛋白的晶體結(jié)構(gòu)很相似。
由此看來(lái)蛋白質(zhì)的耐熱性不是因?yàn)榭傮w結(jié)構(gòu)的差別,而是與其分子表面幾個(gè)氨基酸的置換有關(guān)。與嗜常溫的鐵氧還蛋白相比,嗜高溫鐵氧還蛋白有三股β- 折疊而不是二股β- 折疊,還有較短的環(huán),較長(zhǎng)的α- 螺旋,在肽鏈兩端的氨基酸之間有特異的離子反應(yīng),這些反應(yīng)有助于防止溫度升高引起的肽鏈末端開(kāi)鏈并提高了酶的穩(wěn)定性。
2 　熱穩(wěn)定因子的保護(hù)作用
在體外,大多數(shù)有機(jī)溶劑可降低酶的熱穩(wěn)定性或使酶變性失活,可是甘油、蔗糖及乙二醇溶液往往可增加酶的熱穩(wěn)定性。在體內(nèi),超嗜熱古生菌通過(guò)代謝過(guò)程合成的高濃度的2 ,3 —二磷酸甘油酸可溶性物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)、酶及核酸都有保護(hù)作用,可防止高熱條件下的變性失活過(guò)程。對(duì)于DNA 來(lái)說(shuō),它們還能合成與真核細(xì)胞組蛋白密切相關(guān)的DNA 結(jié)合蛋白。這種蛋白質(zhì)與DNA 結(jié)合后能保護(hù)并防止DNA 在高溫條件下的解鏈變性過(guò)程。
超嗜熱古生菌中的熱網(wǎng)菌屬( Pyrodictium) 的細(xì)菌最高能在110 ℃的條件下生長(zhǎng)。在這種溫度條件下,它們能合成占細(xì)胞蛋白質(zhì)總量80 %的一種蛋白質(zhì)。這種蛋白質(zhì)具有兩種酶活性:一種是催化合成ATP 的活性,另一種是具有分子伴侶的活性。當(dāng)環(huán)境溫度達(dá)到最高生長(zhǎng)溫度并接近胞內(nèi)蛋白質(zhì)與酶的變性溫度時(shí),這種分子伴侶通過(guò)重新折疊來(lái)保護(hù)其它蛋白質(zhì)及酶對(duì)高熱的穩(wěn)定性。但是在接近熱網(wǎng)菌的最適生長(zhǎng)溫度105 ℃的100 ℃時(shí),細(xì)胞僅合成少量分子伴侶。說(shuō)明在一定溫度條件下,細(xì)菌能主動(dòng)調(diào)節(jié)代謝并使合成分子伴侶的量隨著溫度的升高而增加。只有在最高生長(zhǎng)溫度時(shí)才能合成大量的分子伴侶,用于保護(hù)蛋白質(zhì)與酶的活性,從而使自身適應(yīng)高溫環(huán)境。
3 　金屬離子
C2 +a 能提高許多熱穩(wěn)定性酶的耐熱性。在C2 +a 存在的條件下,幾乎一半以上的堿性蛋白酶能在65 ℃的條件下維持15min。嗜高溫中性蛋白酶的熱穩(wěn)定性更加依賴(lài)于C2 +a 。從云南西雙版納分離篩選的菌號(hào)為HY- 69 的耐熱菌株產(chǎn)生的含鈣中性蛋白酶特別耐熱,最適活性溫度為85 ℃,且80 ℃保溫3h 仍保持63 %的活性。如用透析法完全除去該酶中的C2 +a ,80 ℃保溫10min 就完全喪失活性。嗜熱菌蛋白酶( ther2molysin) 也是一種耐熱的含鈣中性蛋白酶。它含有4個(gè)C2 +a ,從酶分子中除去3 個(gè)或4 個(gè)C2 +a ,不影響酶的催化活性,但熱穩(wěn)定性明顯降低。盡管還不了解C2 +a提高酶抗熱性的作用機(jī)制,但是推測(cè)C2 +a 對(duì)穩(wěn)定酶分子的三維結(jié)構(gòu)有重要作用。此外,鋅離子與鉀離子對(duì)某些耐熱酶也有熱穩(wěn)定作用。根據(jù)嗜熱古生菌特殊的生活條件與地球生命起源初期的環(huán)境條件有許多相似之處,推測(cè)嗜常溫酶可能起源于同源的嗜高溫酶。隨著環(huán)境條件的變化,又迫于保持功能與自然選擇的壓力,因此在不影響功能的前提下,酶分子中可變區(qū)的氨基酸發(fā)生變化,致使構(gòu)象與熱穩(wěn)定性也發(fā)生變化,但是仍保持原來(lái)的功能。當(dāng)然可能有其他的進(jìn)化途徑。
    綜上所述,盡管人們對(duì)嗜高溫酶進(jìn)行了大量的研究并取得了一些成果,但是還不足以說(shuō)明嗜高溫酶的結(jié)構(gòu)與耐熱機(jī)制之間的詳細(xì)關(guān)系,有許多問(wèn)題還有待于進(jìn)一步探討。相信隨著研究的不斷深入,會(huì)逐步加深了解嗜高溫酶的耐熱機(jī)制,同時(shí)也會(huì)為設(shè)計(jì)與表達(dá)新的嗜高溫基因重組酶提供理論依據(jù)。

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也就是說(shuō)，如果我們的技術(shù)足夠發(fā)達(dá)的話(huà)，每一種酶都是可以改進(jìn)成為耐熱的！