微生物發(fā)酵飼料生產(chǎn)關(guān)鍵因素的優(yōu)化及發(fā)酵過程成分變化分析

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　　微生物發(fā)酵飼料是一種利用乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌等有益微生物對一種或多種飼料原料進(jìn)行厭氧或好氧發(fā)酵，提高飼料原料營養(yǎng)物質(zhì)的利用率，消除抗?fàn)I養(yǎng)因子，同時有益微生物大量繁殖、富集，功能性初級、次級代謝產(chǎn)物大量生成的一種新型發(fā)酵生物飼料。近年來，隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展、腸道微生態(tài)研究的不斷深入和認(rèn)可，發(fā)酵飼料在畜牧業(yè)中的應(yīng)用越來越廣泛，其產(chǎn)量、質(zhì)量均得到了顯著的增長和提高。但相對于其他的如氨基酸、抗生素等發(fā)酵產(chǎn)品，發(fā)酵飼料的附加值還較低，從業(yè)人員多數(shù)無發(fā)酵專業(yè)背景，如何進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本，滿足動物不同生長階段產(chǎn)品細(xì)分和特異性營養(yǎng)需求是今后發(fā)酵飼料的重要發(fā)展方向。

　　目前，國內(nèi)外對發(fā)酵飼料的研究主要集中在發(fā)酵菌株類型、生理功能、飼喂效果上，但對其發(fā)酵基質(zhì)選擇的科學(xué)性、發(fā)酵眾多代謝物質(zhì)的活性成分分析缺乏研究，成為了阻礙微生物發(fā)酵飼料進(jìn)一步發(fā)展的壁壘。因此，筆者將著重研究水分、溫度、能量和蛋白等關(guān)鍵因素對發(fā)酵飼料生產(chǎn)的影響，對其進(jìn)行優(yōu)化選擇，并對發(fā)酵過程中各營養(yǎng)成分的變化進(jìn)行測定分析，以期能降低發(fā)酵飼料的生產(chǎn)成本，為其產(chǎn)品的細(xì)分、不同發(fā)酵階段的營養(yǎng)組成提供理論依據(jù)，最終將發(fā)酵飼料的生產(chǎn)技術(shù)推向生產(chǎn)實際。

　　01　材料與方法

　　1.1 材料

　　發(fā)酵菌株：復(fù)合發(fā)酵制劑，內(nèi)含乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌，以乳酸菌為主，總菌數(shù)108個/g，由北京某公司提供。
　　培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基（乳酸菌）、YPD培養(yǎng)基（酵母菌）、LB培養(yǎng)基（枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基）。
　　發(fā)酵設(shè)備及方式：帶有單向排氣呼吸閥的PE膜密封包裝，生料發(fā)酵，裝袋量2kg；包裝后堆積發(fā)酵，一堆6~8袋，夏天用大功率排氣扇通風(fēng)降溫，冬天用爐火或布簾遮蓋保溫。
　　試驗在福建省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，于2015年2-7月進(jìn)行。

　　1.2 方法

　　1.2.1 發(fā)酵物料組成對發(fā)酵效果的影響

　　配方1（常規(guī)飼料）組成（干物質(zhì)含量）：米糠13.0%、木薯粉9%、玉米粉37.5%、麩皮15.0%、棉粕23.0%、復(fù)合多維1.0%、紅糖1.5%。
　　配方2（高糖分飼料）組成（干物質(zhì)含量）：米糠13.0%、玉米粉42.5%、麩皮15.0%、棉粕12.5%、復(fù)合多維1.0%、玉米漿16%。
　　配方3（高蛋白飼料）組成（干物質(zhì)含量）：豆粕52.0%、玉米蛋白粉20.0%、麩皮13.0%、花生粕4.0%、玉米胚芽粕7.0%、復(fù)合多維1.0%、賴氨酸1.0%、紅糖2.0%。
　　各配方中設(shè)定比例的紅糖用37℃溫水?dāng)嚢枞芙?，加入總物?.1%的菌株混勻，再與其他原料組成混合，含水量最終控制在35%~36%、裝入發(fā)酵袋中進(jìn)行密封發(fā)酵（生料密封發(fā)酵），發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵12h后每隔12h取樣測定其乳酸菌含量和pH變化，分析不同發(fā)酵物料組成對發(fā)酵效果的影響。
　　發(fā)酵過程中菌種含量、營養(yǎng)成分變化復(fù)雜，由于發(fā)酵過程是各菌共同作用結(jié)果，其中又主要以乳酸菌為主，因此最終選定以總菌含量和pH變化為指標(biāo)考察發(fā)酵效果。

　　1.2.2 發(fā)酵物料含水量、溫度對發(fā)酵效果的影響

　　在配方1（常規(guī)飼料）條件下，設(shè)定控制發(fā)酵物料含水量為24%~40%，30℃生料密封發(fā)酵7天，從第3天開始取樣測定其總菌含量和pH，分析不同含水量對發(fā)酵效果的影響。
　　在配方1（常規(guī)飼料）、選定的最優(yōu)發(fā)酵物料含水量條件下，在夏天、春天、冬天庫房環(huán)境溫度下進(jìn)行生料密封發(fā)酵，對應(yīng)發(fā)酵溫度和取樣時間分別為：夏天25~35℃，發(fā)酵7天，每天取樣1次；春天15~25℃，發(fā)酵14天，每2天取樣1次；冬天5~15℃，發(fā)酵21天，每3天取樣1次。同樣測定各取樣樣品的總菌含量和pH，分析不同環(huán)境溫度對發(fā)酵效果的影響。

　　1.2.3 發(fā)酵過程菌株生長、營養(yǎng)成分變化分析

　　在配方1（常規(guī)飼料）、選定的最優(yōu)發(fā)酵物料含水量，夏天25~35℃庫房環(huán)境溫度下，發(fā)酵8天，定時取樣，測定各取樣時間的乳酸菌、酵母菌等微生物含量和主要生成物乳酸的含量，并對發(fā)酵過程中pH、水分、纖維、能量、蛋白、氨基酸、維生素、異硫氰酸酯等指標(biāo)的變化進(jìn)行分析，試驗重復(fù)3次，取平均值。樣品取樣除乳酸菌、蛋白濃度、維生素含量等需原樣外，其余樣品均是原樣70~75℃干燥粉碎后過100目篩待用。

　　1.2.4 各指標(biāo)測定分析方法

　　各微生物及總菌數(shù)含量：平板菌落計法；pH：梅特勒FE.20pH計測定；水分：105℃烘箱干燥，GB/T6435-2006；能量：KT-R4300全自動量熱儀測定，ISO9831：1988；纖維：ANKOM220纖維分析儀測定，GB/T6434-2006；粗蛋白測定：Tecator1035全自動定氮儀測定，GB/T6432-1994；異硫氰酸酯：氣相色譜法，GB/T13087-91；維生素、氨基酸測定采用島津LC-20AHPLC檢測；乳酸：乳酸脫氫酶法，試劑盒購買于南京某公司。

　　02　結(jié)果與分析

　　2.1 發(fā)酵物料組成對發(fā)酵效果的影響結(jié)果

　　不同發(fā)酵物料組成對發(fā)酵效果的影響結(jié)果見圖1所示，在3個不同配方中，菌株生長曲線和pH變化基本一致。發(fā)酵開始時，菌株大量生長，主要發(fā)酵菌株乳酸菌分泌乳酸，pH下降；發(fā)酵120~132h左右以后，發(fā)酵趨于成熟，大量的乳酸產(chǎn)生抑制了菌株的生長，發(fā)酵菌株部分死亡、裂解，數(shù)量有所下降。高糖分的配方2其菌株的生長速度要明顯高于其余2組，其玉米漿所含的高糖分給菌株的生長提供了大量的能量。高蛋白的配方3其菌株的生長速度明顯小于其余2組，表明隨著蛋白含量的增加，微生物生長速率下降。但實際畜禽飼養(yǎng)中，畜禽的生長不僅需要足夠量的活菌，同時一定濃度的蛋白也是必須的，綜合考慮，配方1中蛋白含量和糖分含量適中，更有益于發(fā)酵菌株生長和滿足畜禽生長的蛋白需求。

　　2.2 發(fā)酵物料含水量、溫度對發(fā)酵效果的影響結(jié)果

　　不同發(fā)酵物料含水量、溫度對發(fā)酵效果的影響結(jié)果見圖2~5所示，結(jié)果表明：物料的含水量越高，菌株生長越快，發(fā)酵效果越好，但在實踐操作中，水分含量越高，其包裝、運輸、保持等操作成本越高，市場的接受度也越小。圖2結(jié)果顯示當(dāng)含水量在32%~40%時，其總菌數(shù)含量差別不大，因此，綜合考慮選定34%~36%為最適含水量，既能保證菌株快速生長，又能適當(dāng)?shù)慕档蜕a(chǎn)操作成本。

　　圖3~5結(jié)果顯示，溫度對發(fā)酵菌株的生長有著重要的影響，溫度越高，菌株生長越快，其發(fā)酵成熟所需時間越段。在最優(yōu)發(fā)酵條件下，夏天發(fā)酵5天，春天發(fā)酵12天，冬天發(fā)酵18天，發(fā)酵菌株的總菌數(shù)達(dá)到平衡為2.20×109個/g，物料pH4.0~4.1。

　　2.3 發(fā)酵過程菌株生長及乳酸生成的變化分析

　　發(fā)酵8天，其菌株生長及乳酸生成的變化如圖6~7所示，發(fā)酵菌株由乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌組成，但各菌株的生長時間、速度不同。在密閉袋裝發(fā)酵過程中，發(fā)酵前36h，發(fā)酵袋中所含殘留氧供酵母菌和枯草芽孢桿菌生長，大量繁殖，乳酸菌基本不生長，乳酸生成量很少。發(fā)酵96h，發(fā)酵袋內(nèi)氧氣逐漸耗盡，酵母菌和枯草芽孢桿菌基本不再生長，數(shù)量達(dá)到頂峰，分別為5.14×107、4.05×108個/g。厭氧環(huán)境條件下，乳酸菌開始大量生長，開始大量產(chǎn)生乳酸。發(fā)酵144h，發(fā)酵趨于成熟，乳酸菌生長達(dá)到頂峰1.86×109個/g，乳酸含量最高達(dá)到0.89%。隨后隨著乳酸的大量產(chǎn)生，乳酸菌、芽孢桿菌不再適合生長，部分菌株開始裂解，總菌數(shù)下降。圖6中總菌數(shù)的變化曲線與乳酸菌的變化曲線一致，表明發(fā)酵過程主要以乳酸菌為主，酵母菌和枯草芽孢桿菌的生長為乳酸菌提供了厭氧環(huán)境。

　　2.4發(fā)酵過程營養(yǎng)變化分析

　　發(fā)酵過程中能量、水分、異硫氰酸酯的變化分析如圖8~9所示，隨著發(fā)酵時間的延長，物料的總能、纖維、異硫氰酸酯含量緩慢減少，水分和蛋白含量略有增加。原因可能是酵母菌進(jìn)行厭氧發(fā)酵，產(chǎn)生CO2和乙醇，CO2能從氣孔溢出，物料總重量降低，水分、蛋白含量相對增加，物料總能相對下降；纖維、異硫氰酸酯含量降低可能是發(fā)酵菌株中產(chǎn)生相應(yīng)的酶降解所致。發(fā)酵飼料中水分、蛋白含量增加，乙醇的生成，纖維、異硫氰酸酯含量的降低對于減少畜禽飼喂致害、提高適口性具有一定的益處。

　　發(fā)酵過程中維生素的變化分析如圖10示，發(fā)酵飼料中各維生素含量的高低順序為：VB>VE>VK>VA>VD，不同的發(fā)酵時間，各維生素含量基本保持穩(wěn)定，到達(dá)降解和合成的相對平衡。

　　發(fā)酵過程中，各氨基酸含量也基本不變，僅4種氨基酸發(fā)生了較明顯的變化，如圖11所示，谷氨酸、脯氨酸的含量緩慢下降，甘氨酸、苯丙氨酸的含量緩慢增加，表明畜禽生長必需氨基酸含量增加，發(fā)酵飼料中氨基酸組成在向優(yōu)質(zhì)化方向轉(zhuǎn)化。

　　03　結(jié)論

　　本研究對發(fā)酵飼料生產(chǎn)中的關(guān)鍵因素水分、溫度、能量和蛋白等進(jìn)行了優(yōu)化研究，并對發(fā)酵過程中各營養(yǎng)成分的變化進(jìn)行測定分析，結(jié)果表明：高糖分、低蛋白的飼料配方、34%~36%含水量、較高的發(fā)酵溫度更有利于菌株生產(chǎn)和實際生產(chǎn)需求。酵母菌和枯草芽孢桿菌發(fā)酵先行開始，其大量生長為乳酸菌提供了厭氧環(huán)境，隨著時間的延長，發(fā)酵144h后，各菌株生長達(dá)到頂峰。發(fā)酵過程中，乳酸、乙醇等物質(zhì)生成，水分、蛋白含量增加，纖維、異硫氰酸酯含量降低，維生素含量動態(tài)穩(wěn)定，氨基酸優(yōu)質(zhì)轉(zhuǎn)變。因此，發(fā)酵飼料有利于提高畜禽飼養(yǎng)的腸道平衡、適口性和安全性。

　　04　討論

　　目前，國內(nèi)外對微生物發(fā)酵飼料在畜禽飼養(yǎng)中的應(yīng)用和理論研究較多，也取得了一定的成果，但對發(fā)酵飼料眾多代謝產(chǎn)物的有效成分缺乏較深入的研究，同時發(fā)酵飼料由于原材料、發(fā)酵菌株、保存等問題引發(fā)的產(chǎn)品穩(wěn)定性問題還亟待進(jìn)一步解決。因此，筆者對發(fā)酵生產(chǎn)的關(guān)鍵因素、發(fā)酵過程各菌株生長變化，發(fā)酵過程各營養(yǎng)成分變化情況的深入分析是十分必要的，對降低生產(chǎn)成本、滿足不同生長階段畜禽生長的產(chǎn)品細(xì)分和特異性營養(yǎng)需求，對將來完善發(fā)酵飼料品質(zhì)鑒定、建立行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、促進(jìn)微生物發(fā)發(fā)酵飼料的進(jìn)一步研究發(fā)展均有著重要的參考依據(jù)。此外，發(fā)酵菌株的來源、種類、作用機(jī)理對發(fā)酵飼料的適應(yīng)動物種類、添加劑量的選擇十分重要。筆者對各發(fā)酵菌株之間的協(xié)同作用機(jī)理進(jìn)行了探討，對各菌株生長順序、相互作用進(jìn)行了相關(guān)分析，但對其穩(wěn)定性、耐受性、拮抗性、有益菌株變異性及發(fā)酵菌株在畜禽中的腸道定植部位、機(jī)理還需進(jìn)一步的深入研究，也是發(fā)酵飼料尚未解決和將來探索的重要方向。


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　　責(zé)編：馬維軍；審閱：陳達(dá)博士
　　來源：中國農(nóng)學(xué)通報；生物飼料工程研究中心 作者：林標(biāo)聲,羅建,李益明,楊小燕


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