養(yǎng)殖前沿 | 酒石酸泰萬菌素抑制高致病性PRRSV在體外的復(fù)制

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養(yǎng)豬職業(yè)經(jīng)理人，微信ID：YZZYJLR2016  

導(dǎo)讀

　　豬繁殖與呼吸綜合征（PPR）是豬的一種傳染性疾病，可造成母豬的生殖障礙及年幼豬的呼吸紊亂，該病是一種全球范圍內(nèi)具有重要經(jīng)濟(jì)意義的豬病。這種疾病以造成各階段豬41℃以上高溫、厭食、耳部（藍(lán)耳）和身體變紅及高死亡率為主要特征?，F(xiàn)有疫苗僅能提供針對(duì)HP-PRRSV毒株的部分保護(hù)力。近年來有報(bào)道稱大環(huán)內(nèi)酯類抗生素具有抗PRRSV的抗病毒效果，因此疫苗及藥物的聯(lián)合使用可能會(huì)更有效地預(yù)防PRRS。

　　本研究對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素--酒石酸泰萬菌素（乙酰異戊酰泰樂菌素）抑制HP-PRRSV體外復(fù)制及誘導(dǎo)生產(chǎn)的細(xì)胞線粒體超氧化物的抗病毒活力進(jìn)行了測(cè)定。

1.材料和方法

　　將各種濃度（0.1、1、10及100 μg/ml）的酒石酸乙酰異戊酰泰樂菌素（API of Aivlosin®, Ecopharma Inc.）加入至MARC145細(xì)胞，于37℃作用4小時(shí)后，用PBS洗滌5次。

　　在間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）中，將HP-PRRSV 越南分離株100186-614接種至細(xì)胞后培養(yǎng)24至48小時(shí)，病毒的接種濃度為102及103 TCID50/ml。使用80%的丙酮固定細(xì)胞，使用感染100186-614的豬血清及FITC標(biāo)記的抗豬IgG進(jìn)行IFA檢測(cè)，使用熒光顯微鏡進(jìn)行熒光觀察。

　　在流式細(xì)胞檢測(cè)（FCM）中，使用酒石酸乙酰異戊酰泰樂菌素處理細(xì)胞，接種5x10~5 TCID50/ml 100186-614分離毒株后培養(yǎng)48小時(shí)。使用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞后，0.5%皂苷進(jìn)行細(xì)胞的透化，采用IFA類似方法法進(jìn)行細(xì)胞染色。

　　通過EPICS XL ADC及XPO32軟件對(duì)10000個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，從而計(jì)算得出總的HP-PRRSV抗原陽性細(xì)胞數(shù)。檢測(cè)細(xì)胞中線粒體超氧化物時(shí)，使用100 μg/ml的酒石酸乙酰異戊酰泰樂菌素處理細(xì)胞后，加入5 μM 的MitoSOX (Molecular Probes, Invitrogen,Eugene, OR, USA)，37℃作用30分鐘，用含鈣、鎂離子的Hank’s溶液洗滌2次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞。

　　使用488nm FCM激光激活MitSOX，測(cè)定并收集FCM 575nm（FL2）數(shù)據(jù)，以檢測(cè)細(xì)胞中的細(xì)胞中線粒體超氧化物。數(shù)據(jù)以MitoSOX熒光平均亮度直方圖的方式呈現(xiàn)。

2.結(jié)果

　　結(jié)果表明：細(xì)胞經(jīng)濃度為100μg/ml的酒石酸乙酰異戊酰泰樂菌素處理后，在IFA檢測(cè)時(shí)表達(dá)HP-PRRSV抗原的細(xì)胞數(shù)量減少。然而，使用其余濃度進(jìn)行細(xì)胞處理時(shí)，呈病毒陽性的細(xì)胞數(shù)并未減少，其結(jié)果與對(duì)照相同。

　　在FCM檢測(cè)中，當(dāng)使用100 μg/ml濃度處理細(xì)胞時(shí)，HP-PRRSV的復(fù)制減少將近20%（表1）。經(jīng)其他濃度酒石酸乙酰異戊酰泰樂菌素病毒處理后的陽性細(xì)胞比例與對(duì)照組差異不顯著。在檢測(cè)細(xì)胞中線粒體超氧化物時(shí)，F(xiàn)CM直方圖表明，100μg/ml酒石酸乙酰異戊酰泰樂菌素處理4小時(shí)后，MitoSOX熒光強(qiáng)度減少2.1± 0.3倍。

表1 FCM檢測(cè)時(shí)HP-PRRSV陽性細(xì)胞比例

	酒石酸乙酰異戊酰泰樂菌素
	未處理	100 μg/ml	10 μg/ml
第一次檢測(cè)	51.64%	39.86%	43.62%
第二次檢測(cè)	38.82%	28.08%	43.02%

3.結(jié)論與討論

　　本研究中，經(jīng)酒石酸乙酰異戊酰泰樂菌素處理后表達(dá)HP-PRRSV抗原的細(xì)胞數(shù)量減少。結(jié)果證實(shí)，酒石酸乙酰異戊酰泰樂菌素具有抑制HP-PRRSV體外復(fù)制的抗病毒活性。這種抗病毒活性與細(xì)胞中線粒體超氧化物的增加有關(guān)。還需對(duì)酒石酸乙酰異戊酰泰樂菌素的抗病毒機(jī)制進(jìn)行闡明并對(duì)其在體內(nèi)的效果進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

（資料來源于世界豬病大會(huì)論文集，邱文英  譯）