枯草芽孢桿菌對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒肉雞生長(zhǎng)性能和腸道健康的影響

畜牧編輯

　　摘要: 本試驗(yàn)旨在研究飼糧中添加枯草芽孢桿菌對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒肉雞生長(zhǎng)性能和腸道健康的影響。選用480只1日齡肉公雞（Ross 308）隨機(jī)分為5組，分別為對(duì)照組（CON組）、產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒組（CP組）、CP+10 mg/kg恩拉霉素組（ENRA組），CP+10 mg/kg枯草芽孢桿菌（1010 CFU/g）組（BS組）和CP+5 mg/kg恩拉霉素+10 mg/kg枯草芽孢桿菌組（ENRA+BS組），每組8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12只，試驗(yàn)期42 d。所有攻毒組肉雞在第14天時(shí)口服混合型艾美爾球蟲懸浮液[11 000孢子/（mL·只）]，第16~18天時(shí)口服產(chǎn)氣莢膜梭菌懸浮液[108 CFU/（mL·只）]。結(jié)果表明：1）與CP組相比，ENRA組、BS組和ENRA+BS組肉雞第1~21天料重比有降低的趨勢(shì)（P=0.051）；與CON組相比，ENRA組和ENRA+BS組肉雞第1~42天料重比顯著降低（P < 0.05）。2）與CP組相比，ENRA組、BS組和ENRA+BS組肉雞第28天空腸病變計(jì)分極顯著降低（P < 0.01）。3）第21天和第42天時(shí)，ENRA組隱窩深度極顯著低于CP組、BS組和ENRA+BS組（P < 0.01）。第42天時(shí)，與CP組相比，ENRA組絨毛高度/隱窩深度（VH/CD）顯著增加（P < 0.05），BS組和ENRA+BS組VH/CD有提高趨勢(shì)（P > 0.05）。4）第21天時(shí)，與CP組相比，ENRA+BS組空腸黏膜分泌型免疫球蛋白A（SIgA）含量顯著增加（P < 0.05）；第28天時(shí)，與CP組相比，BS組和ENRA+BS組空腸黏膜免疫球蛋白G（IgG）含量顯著增加（P < 0.05）。5）與CP組相比，ENRA組、BS組和ENRA+BS組第21天肉雞大腸桿菌數(shù)量極顯著降低（P < 0.01）；ENRA組、BS組和ENRA+BS組第28天肉雞產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量極顯著降低（P < 0.01）。由此得出，枯草芽孢桿菌可在一定程度上改善肉雞腸道健康和生長(zhǎng)性能，當(dāng)與恩拉霉素（5 mg/kg）合用時(shí)，其效果更好，從而起到減少抗生素使用的作用。

　　關(guān)鍵詞: 枯草芽孢桿菌    產(chǎn)氣莢膜梭菌    肉雞    生長(zhǎng)性能    腸道健康    球蟲

　　壞死性腸炎(necrotic enteritis，NE)是家禽常見病，會(huì)影響家禽生長(zhǎng)性能，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在全球范圍內(nèi)，由NE造成的經(jīng)濟(jì)損失約20億美元/年[1]。產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種厭氧性革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌，是造成家禽NE的主要病原菌。目前，防治NE的主要措施是在飼糧中添加桿菌肽鋅等抗生素，在飼糧中添加恩拉霉素可抑制腸道產(chǎn)氣莢膜梭菌[2]。隨著越來(lái)越多國(guó)家限制使用抗生素，家禽養(yǎng)殖業(yè)中若爆發(fā)NE，會(huì)給食品安全和動(dòng)物福利帶來(lái)更大的危害?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)是一種綠色、無(wú)污染的好氧性益生菌，耐壓、抗酸堿，通過(guò)胃酸后進(jìn)入腸道，腸道內(nèi)能以孢子形式迅速萌芽繁殖，消耗掉腸道內(nèi)的氧，抑制有害菌，促進(jìn)有益菌的增殖，改善飼料效率和腸道黏膜結(jié)構(gòu)，對(duì)防治疾病、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)有積極作用。研究表明，健康的雞胃腸道中產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量較少，患NE雞產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量相對(duì)較多[3]，添加枯草芽孢桿菌可顯著降低雞群產(chǎn)氣莢膜梭菌的感染程度[4]。本研究旨在研究枯草芽孢桿菌對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒肉雞生長(zhǎng)性能和腸道健康的影響，旨在為NE疾病的防治和抗生素的替代品研究提供理論依據(jù)。

　　1 材料與方法
　　1.1 試驗(yàn)材料

　　恩拉霉素購(gòu)自先靈葆雅(上海)貿(mào)易有限公司，雞球蟲病四價(jià)活疫苗(柔嫩艾美爾球蟲PTM株+毒害艾美爾球蟲PNHZ株+巨型艾美耳球蟲PMHY株+堆型艾美爾球蟲PAHY株)由佛山市正典生物技術(shù)有限公司提供，每羽份含有1 100孢子囊。產(chǎn)氣莢膜梭菌購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏中心，菌種編號(hào)CVCC2017 type A，按照Forder等[5]試驗(yàn)中所提到的方法培養(yǎng)，細(xì)菌濃度為1×108 CFU/mL?？莶菅挎邨U菌(B.subtilis DSM29784)由安迪蘇(中國(guó)，上海)提供，含菌量為1×1010 CFU/g。

　　1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

　　采用單因子隨機(jī)分組設(shè)計(jì)，選用480只1日齡健康的肉公雞(Ross 308)隨機(jī)分為5組，分別為對(duì)照組(CON組)、產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒組(CP組)、CP+10 mg/kg恩拉霉素組(ENRA組)，CP+10 mg/kg枯草芽孢桿菌(1010 CFU/g)組(BS組)和CP+5 mg/kg恩拉霉素+10 mg/kg枯草芽孢桿菌組(ENRA+BS組)，每組8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12只雞，試驗(yàn)期42 d，分2個(gè)階段：第1~21天為前期，第22~42天為后期。在試驗(yàn)第14天，攻毒肉雞灌喂10倍免疫劑量的混合型艾美爾球蟲懸浮液[11 000孢子/(mL·只)]，對(duì)照組灌喂相同劑量的生理鹽水；第16~18天，攻毒肉雞每日灌喂產(chǎn)氣莢膜梭菌懸浮液[108CFU/(mL·只)]，連續(xù)灌喂3 d，對(duì)照組灌喂相同劑量的培養(yǎng)液。

　　1.3 試驗(yàn)飼糧

　　試驗(yàn)飼糧為玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，參照《雞的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》 (NY/T 33—2004)并結(jié)合課題組前期研究結(jié)果配制[6], 其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表 1。試驗(yàn)飼糧制成顆粒料形式飼喂。

　　1.4 試驗(yàn)管理

　　試驗(yàn)在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所試驗(yàn)場(chǎng)進(jìn)行。試驗(yàn)肉雞均網(wǎng)上平養(yǎng)(高0.5 m×寬1.0 m×長(zhǎng)1.0 m)，雛雞前3天圈舍溫度33 ℃，第4~7天逐漸降低至32~30 ℃，之后每周降低2 ℃，直到保持在22~24 ℃至試驗(yàn)結(jié)束。肉雞采用連續(xù)光照、自然通風(fēng)、自由采食和充足飲水，按正常免疫程序接種。

　　1.5 指標(biāo)測(cè)定
　　1.5.1 生長(zhǎng)性能

　　試驗(yàn)期內(nèi)觀察試驗(yàn)雞生長(zhǎng)和健康狀況，以重復(fù)為單位，記錄耗料量，并于試驗(yàn)期第21、28和42天時(shí)，提前12 h斷料，計(jì)算各組試驗(yàn)雞的階段體增重(BWG)、料重比(F/G)和階段采食量(FI)。

　　1.5.2 腸道形態(tài)

　　分別于試驗(yàn)期第21、28和42天時(shí)，每重復(fù)選取1只接近平均體重的肉雞稱重，頸靜脈放血處死，分離空腸，取腸段中部約1.5 cm固定于10%的福爾馬林溶液，將固定好的腸段用乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，用蘇木精-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。測(cè)量腸段絨毛高度、隱窩深度，計(jì)算絨毛高度/隱窩深度(VH/CD)。

　　1.5.3 腸道黏膜免疫球蛋白含量

　　取肉雞空腸中部靠前約5 cm長(zhǎng)，刮取空腸黏膜，置液氮中保存，測(cè)定分泌型免疫球蛋白A(SlgA)和免疫球蛋白G(IgG)含量。采用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定。

　　1.5.4 腸道損傷計(jì)分

　　取肉雞空腸中部靠后約7 cm的腸段，將腸段剪開，用生理鹽水清洗干凈，用濾紙將水吸干，肉眼觀察腸道病變并計(jì)分。

　　計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：0=無(wú)肉眼可見的損傷；1=腸壁薄或易碎(充血)；2=小的局灶壞死或潰瘍(1~5灶)；3=局灶性壞死或潰瘍。

　　1.5.5 腸道微生物數(shù)量

　　分離盲腸，收集盲腸食糜，置液氮中保存，測(cè)定腸道微生物，包括總菌、乳酸桿菌、大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量。提取DNA試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。使用RT-PCR Taqman探針法測(cè)定盲腸微生物數(shù)量。參照鐘麗梅等[6]方法測(cè)定，試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。結(jié)果用每克內(nèi)容物中細(xì)菌數(shù)量的常用對(duì)數(shù)表示[lg(拷貝數(shù)/g)]。

　　1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

　　數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2013整理，SPSS 19.0軟件分析，采用one-way ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，Duncan氏法進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P < 0.05為顯著差異，P < 0.01為差異極顯著。

　　2 結(jié)果

　　2.1 枯草芽孢桿菌對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒肉雞生長(zhǎng)性能的影響

　　從表 2可以看出，第1~21天，各組間體重、體增重和采食量沒有顯著差異(P > 0.05)，產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒后，各組F/G有升高趨勢(shì)(P=0.051)，CP組F/G在數(shù)值上高于其他各組(P > 0.05)。第22~28天和第29~42天，各組間生長(zhǎng)性能差異均不顯著(P > 0.05)，從數(shù)值上來(lái)看，ENRA組、BS組和ENRA+BS組的F/G較CP組有所降低，但差異不顯著(P > 0.05)。全期，各組間體增重和采食量均沒有顯著差異(P > 0.05)，ENRA組和ENRA+BS組的F/G顯著低于CP組(P < 0.05)。

　　2.2 枯草芽孢桿菌對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒肉雞空腸病變計(jì)分的影響

　　從表 3可以看出，第21天，CP組計(jì)分最高，CON組最低，ENRA組、BS組和ENRA+BS組的計(jì)分低于CP組。第28天，CP組的計(jì)分最高，極顯著高于其余各組(P < 0.01)。第42天，各組計(jì)分沒有顯著差異(P > 0.05)。

　

　　2.3 枯草芽孢桿菌對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒肉雞空腸形態(tài)的影響

　　從表 4可以看出，第21天和第42天時(shí)，ENRA組隱窩深度極顯著低于CP組、BS組和ENRA+BS組(P＜0.01)。第42天時(shí)，與CP組相比，ENRA組VH/CD顯著增加(P＜0.05)，BS組和ENRA+BS組VH/CD有提高趨勢(shì)(P > 0.05)。第28天時(shí)，組間各項(xiàng)指標(biāo)沒有顯著差異(P＞0.05)。

　　2.4 枯草芽孢桿菌對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒肉雞空腸黏膜IgG和SIgA含量的影響

　　從表 5可以看出，第21天時(shí)，與CP組相比，ENRA+BS組SIgA含量顯著增加(P < 0.05)；第28天時(shí)，與CP組相比，BS組和ENRA+BS組IgG含量顯著增加(P < 0.05)；第42天時(shí)，各組IgG和SIgA含量差異均不顯著(P > 0.05)。

　　2.5 枯草芽孢桿菌對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒肉雞盲腸微生物數(shù)量的影響

　　從表 6可以看出，與CP組相比，ENRA組、BS組和ENRA+BS組第21天大腸桿菌數(shù)量極顯著降低(P < 0.01)，ENRA組乳酸桿菌數(shù)量顯著增加(P < 0.05)，BS組和ENRA+BS組乳酸桿菌數(shù)量有所增加(P > 0.05)，ENRA組、BS組和ENRA+BS組第28天產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量極顯著降低(P < 0.01)。各組間總菌數(shù)量差異不顯著(P > 0.05)。

　　3 討論
     3.1 枯草芽孢桿菌對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒肉雞生長(zhǎng)性能的影響

　　臨床上NE會(huì)引起肉雞嚴(yán)重的腸道損傷和死亡，而亞臨床癥狀會(huì)降低屠宰時(shí)肉雞的體重、采食量和飼料轉(zhuǎn)化效率[7]。本試驗(yàn)表明，產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒后，肉雞第1~21天F/G有增加趨勢(shì)，與李慧賢等[8]的研究結(jié)果一致，該研究表明產(chǎn)氣莢膜梭菌感染肉雞會(huì)導(dǎo)致早期飼料轉(zhuǎn)化效率在數(shù)值上的下降。同時(shí)本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)添加枯草芽孢桿菌后，各生長(zhǎng)性能指標(biāo)均有所提高。關(guān)于枯草芽孢桿菌對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響研究大多在正常條件下進(jìn)行，飼糧中添加枯草芽孢桿菌對(duì)肉雞前期的生長(zhǎng)性能沒有顯著影響[9]；飼糧中添加枯草芽孢桿菌肉雞全期生長(zhǎng)性能與攻毒組無(wú)顯著差異[10]；芽孢桿菌對(duì)雞平均日增重的影響存在時(shí)間上的積累性，而非速效性[11]。在產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒條件下的研究較少，宮秀燕等[12]研究表明，在產(chǎn)氣莢膜梭菌感染后，飼糧中添加凝結(jié)芽孢桿菌有增加肉雞體重的趨勢(shì)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒后，恩拉霉素和枯草芽孢桿菌混合使用顯著降低肉雞第1~42天F/G，添加枯草芽孢桿菌對(duì)肉雞第1~42天F/G有一定的改善作用，而對(duì)肉雞前期生長(zhǎng)性能沒有顯著影響。本試驗(yàn)結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌和恩拉霉素混合使用可改善產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒后肉雞的生長(zhǎng)性能。

　　3.2 枯草芽孢桿菌對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒肉雞空腸形態(tài)和病變的影響

　　腸道形態(tài)包括絨毛高度、隱窩深度和VH/CD。小腸絨毛是肉雞消化和吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的特有結(jié)構(gòu)，絨毛高度、隱窩深度直接影響小腸的吸收面積[13]，絨毛高度增高，吸收養(yǎng)分成熟細(xì)胞就會(huì)增多，吸收養(yǎng)分的能力就越強(qiáng)。隱窩深度反映了細(xì)胞生成率，隱窩變淺說(shuō)明細(xì)胞成熟率上升，分泌功能增強(qiáng)[14-15]。VH/CD綜合反映小腸絨毛吸收功能，VH/CD增大，說(shuō)明絨毛對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力增強(qiáng)，VH/CD減小時(shí)則減弱。產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒后，患有NE肉雞的空腸絨毛高度和VH/CD相比健康肉雞低[16]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒后的肉雞空腸黏膜絨毛高度和VH/CD在數(shù)值上都有所下降，但差異不顯著。飼糧中添加枯草芽孢桿菌能顯著降低空腸隱窩深度, 提高VH/CD[17]。臨武鴨飼糧中添加5.0×1010 CFU/kg枯草芽孢桿菌，對(duì)空腸VH/CD有顯著影響[18]。枯草芽孢桿菌PB6可改善產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒后肉雞的腸道形態(tài)[19]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒后，枯草芽孢桿菌對(duì)肉雞腸道形態(tài)沒有顯著影響, 在數(shù)值上略微提高了肉雞第21天和第42天空腸絨毛高度和VH/CD。這說(shuō)明枯草芽孢桿菌在本試驗(yàn)中對(duì)攻毒后的肉雞腸道形態(tài)上有一定的作用，但效果不明顯，與前人研究結(jié)果不完全一致。這可能與枯草芽孢桿菌的添加量、飼養(yǎng)環(huán)境、產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒效果等因素有關(guān)。

　　肉雞NE嚴(yán)重程度主要根據(jù)病變?cè)u(píng)分或死亡率量化[20-21]。本試驗(yàn)表明，產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒顯著增加了第28天空腸病變計(jì)分，與Wu等[16]的報(bào)道一致。添加芽孢桿菌對(duì)腸道損傷有明顯的改善效果。Jayaraman等[19]研究表明，肉仔雞在產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒后添加枯草芽孢桿菌，第28天的腸道損傷計(jì)分顯著低于攻毒組。宮秀燕等[12]研究表明，凝結(jié)芽孢桿菌能降低腸道病變計(jì)分。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，第28天時(shí)，產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒后，添加枯草芽孢桿菌及恩拉霉素和枯草芽孢桿菌混合使用顯著降低了肉雞空腸損傷計(jì)分，與前人報(bào)道結(jié)果一致。這說(shuō)明枯草芽孢桿菌可以降低腸道病變計(jì)分，防止肉雞患NE，提高腸道健康。

　　3.3 枯草芽孢桿菌對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒肉雞空腸黏膜IgG和SIgA含量的影響

　　腸道黏膜中IgG和SIgA可加強(qiáng)腸道細(xì)胞吞噬作用，SIgA是胃腸道和黏膜表面主要免疫球蛋白，是防御病菌在腸道黏膜黏附和定植的第1道防線[22-23]。益生菌可在腸道黏附定植，發(fā)揮特異性免疫作用活化相關(guān)淋巴組織，使SIgA生物合成增加，提高黏膜免疫功能[24]。Vinderola等[25]用瑞士乳桿菌灌喂小白鼠，小腸中SIgA漿細(xì)胞數(shù)量有所增加，提示益生菌能增強(qiáng)黏膜免疫功能。王麗鳳[26]研究表明，飲水喂給益生菌植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum P-8)可顯著提高14及42日齡肉雞腸液中SIgA含量。唐志剛等[27]研究表明，在不同營(yíng)養(yǎng)水平飼糧中添加益生菌，能提高21和42日齡肉雞腸道黏膜中IgG和42日齡黏膜中SIgA含量。本試驗(yàn)結(jié)果表明，產(chǎn)莢膜梭菌攻毒后，ENRA+BS組顯著增加第21天空腸黏膜SIgA含量，BS組和ENRA+BS組顯著增加第28天IgG含量，說(shuō)明枯草芽孢桿菌在產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒后能提高腸道免疫功能。

　　3.4 枯草芽孢桿菌對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒肉雞盲腸微生物數(shù)量的影響

　　動(dòng)物胃腸道內(nèi)微生物區(qū)系的平衡主要由有益菌(乳酸桿菌、雙歧桿菌)維持，如果胃腸道有害菌(大腸桿菌、沙門氏菌)繁殖過(guò)度，造成微生物區(qū)系紊亂，可能造成動(dòng)物腸道疾病。據(jù)報(bào)道，芽孢桿菌可以使胃腸道內(nèi)有益菌的數(shù)量增加，這些細(xì)菌會(huì)產(chǎn)生大量乳酸降低腸道內(nèi)pH，從而抑制有害菌的增殖。Jayaraman等[19]研究表明，產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒后，攻毒組顯著增加第28天產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量。本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究一致。易中華等[28]研究表明，枯草芽孢桿菌能減少肉雞盲腸中的總需氧菌、大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量，增加乳酸桿菌數(shù)量。Li等[29]研究表明，枯草芽孢桿菌降低盲腸中產(chǎn)氣莢膜梭菌和大腸桿菌數(shù)量。La Ragione等[30]研究報(bào)道，枯草芽孢桿菌能減少肉雞經(jīng)口服低劑量產(chǎn)氣莢膜梭菌后腸道產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量。本試驗(yàn)結(jié)果表明，產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒后，枯草芽孢桿菌以及枯草芽孢桿菌和恩拉霉素混合使用均能降低第21天盲腸大腸桿菌數(shù)量和第28天產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量，與前人研究結(jié)果一致。這說(shuō)明枯草芽孢桿菌可以抑制腸道有害菌的增殖，保護(hù)腸道健康。

　　4 結(jié)論

　　枯草芽孢桿菌及恩拉霉素和枯草芽孢桿菌混合使用可降低產(chǎn)氣莢膜梭菌感染肉雞的腸道病變計(jì)分，促進(jìn)小腸絨毛的生長(zhǎng)發(fā)育，提高腸道免疫功能，促進(jìn)有益菌的增殖，抑制有害菌的增殖，從而改善肉雞的生長(zhǎng)性能。

　　作者：胡均 , 張克英 , 白世平 , 王建萍, 曾秋鳳 , 彭煥偉 , 欒超 , 丁雪梅
　　參考文獻(xiàn)：略
　　來(lái)源：動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)