不同酶制劑對(duì)豆粕中抗原蛋白的影響

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隨著飼料行業(yè)和畜禽養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，豆粕作為大豆加工副產(chǎn)物，富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其中蛋白質(zhì)含量為 40% ~ 50%， 脂肪為 1% ~ 2%，碳水化合物約為 10% ~ 15%， 且較魚(yú)粉價(jià)格低，是目前廣泛使用的植物性蛋白質(zhì)飼料原料， 其需求量逐年遞增（熊智輝等，2007）。然而豆粕中含有的抗原蛋白，如大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白等，會(huì)造成畜禽生產(chǎn)性能和飼料利用率降低， 這在一定程 度 上 限 制 了 其 在 飼 料 中 的 應(yīng) 用 （朱 長(zhǎng) 生 等，2014）。發(fā)酵法能在一定程度上去除豆粕中的有害物質(zhì)或抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，但這會(huì)大幅度提高豆粕的使用成本（王章存等，2018）。隨著酶制劑工業(yè)的快速發(fā)展和各種酶制劑產(chǎn)品的問(wèn)世，為利用酶制劑解決豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子問(wèn)題提供了可能性（姜倩倩等，2012）。王之盛等（2004）的體外酶解試驗(yàn)表明， 蛋白酶對(duì)大豆蛋白的體外降解并不總是降低大豆蛋白生物學(xué)的致敏性， 大豆蛋白的降解具有蛋白酶特異性， 不同的蛋白酶作用于不同的大豆蛋白亞基或結(jié)構(gòu)， 并最終反映到對(duì)動(dòng)物的致敏性差異上（于海濤等，2018；陳乃松等，2008；王寶海等，2005）。因此，本文使用常見(jiàn)的酶制劑采用單一和復(fù)合的方法對(duì)豆粕中的相應(yīng)抗原蛋白開(kāi)展試驗(yàn)，測(cè)定其中抗原蛋白的水平，旨在為利用酶制劑體外處理豆粕中的抗原蛋白提供科學(xué)依據(jù)。

1、材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料
豆粕，購(gòu)自濱州萬(wàn)齊飼料有限公司；大豆球蛋白定量檢測(cè)試劑盒、β-伴大豆球蛋白定量檢測(cè)試劑盒， 購(gòu)自北京龍科方舟生物工程技術(shù)有限公司。

堿性蛋白酶 1 ~ 3，購(gòu)自山東蔚藍(lán)生物科技有限公司；堿性蛋白酶 4 ~ 6，購(gòu)自寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；堿性蛋白酶 7 ~ 11，購(gòu)自安琪酵母股份有限公司。中性蛋白酶 1 ~ 2，購(gòu)自山東蔚藍(lán)生物科技有限公司；中性蛋白酶 3 ~ 5，購(gòu)自安琪酵母股份有限公司。酸性蛋白酶 1 ~ 2，購(gòu)自山東蔚藍(lán)生物科技有限公司；酸性蛋白酶 3 ~ 4，購(gòu)自安琪酵母股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酶解豆粕方法

根據(jù)飼料采樣GB/T14699.1-2005 對(duì)購(gòu)買(mǎi)豆粕進(jìn)行分裝采樣， 在每個(gè)呼吸袋裝入 200 g 豆粕， 按照料水比 5：4 加入一定體積蒸餾水， 在 25 ℃條件下再加入 0.5%的酶制劑，處理 24 h 后，將呼吸袋打開(kāi)，濕物料攪拌均勻取樣備用，測(cè)定其中抗原蛋白含量。

1.2.2 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的測(cè)定
ELISA 測(cè)定過(guò)程參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。過(guò)程簡(jiǎn)要描述如下：稱(chēng)取一定質(zhì)量備用樣品（樣品需粉碎成60 目以上顆粒，0.3 g） 于 50 mL 離心管中， 加入30 mL 樣品提取液，于 25 ℃振蕩提取 16 h，靜置2 min 后，離心 5 min（4000 r/min），取上清液并稀釋 70 倍。將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品平行測(cè)定兩次， 記錄校準(zhǔn)孔和樣品孔所在的位置，經(jīng)過(guò)加樣、洗板、加酶標(biāo)試劑、顯色，加終止液后于 450/630 nm 雙波下讀取吸光度值。按照下列公式計(jì)算吸光率：百分吸光率/%=B/B0×100；式中：B 為校準(zhǔn) 品 2 ~ 6 或樣品的 平均吸 光度值，B0 為校準(zhǔn)品 1 的平均吸光度值。

校準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：以校準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以校準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
采用對(duì)比試驗(yàn)方法，在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行體外消化試驗(yàn)：在 恒溫振蕩 器上進(jìn)行反 應(yīng)（37 ℃，90 min，100 r/min），反應(yīng)結(jié)束后立即瞬間高溫滅活終止酶解反應(yīng)，烘干后測(cè)定相關(guān)的抗?fàn)I養(yǎng)因子。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理
抗原蛋白降解率計(jì)算公式 如下：抗原蛋白降解率/%=（對(duì)照組 豆粕與酶解 豆粕的差值）/對(duì)照組豆粕×100。

2、結(jié)果與分析

2.1 酶制劑的篩選

2.1.1 堿性蛋白酶
由圖 1 可知， 在相同的酶解參數(shù)（料水比、溫度、酶添加量和處理時(shí)間）下，不同堿性蛋白酶對(duì)豆粕中抗原蛋白的含量影響差異較大，10 號(hào)酶對(duì)兩種抗原蛋白都有效果， 對(duì)大豆球蛋白降解效果更明顯。

2.1.2 中性蛋白酶
由圖 2 可知， 在相同的酶解參數(shù)（料水比、溫度、酶添加量和處理時(shí)間）下，不同中性蛋白酶對(duì)豆粕中抗原蛋白的含量有一定差異性，5 號(hào)酶對(duì)大豆球蛋白降解效果優(yōu)于伴大豆球蛋白。

2.1.3 酸性蛋白酶
由圖 3 可知，在相同的酶解參 數(shù)（料 水 比、溫 度、酶 添 加 量 和 處 理 時(shí) 間）下，不同酸性蛋白酶對(duì) 豆粕中抗 原蛋白的含 量影響差異相對(duì)不大，4 號(hào)酶對(duì)伴大豆球蛋白降解效果較好。

2.2 酶添加量的選擇

2.2.1 堿性蛋白酶用量
由圖 4 可知，在相同的酶解參數(shù)（料水比、溫度和處理時(shí)間）下，隨著堿性 蛋 白 酶（10 號(hào)）量的 增 加，豆 粕 中 的 大 豆 球 蛋白降解率增大， 表明 在堿性蛋白 酶的催化作 用下，豆粕中的大豆球蛋白含量越來(lái)越低。在 0.7%添加量時(shí)達(dá)到最高降解率。

2.2.2 中性蛋白酶用量
由圖 5 可知，在相同的酶解參數(shù)（料水比、溫度和處理時(shí)間）下，隨著中性蛋白酶（5 號(hào)）量的增加，豆粕中的大豆球蛋白降解率增大， 表明在中性蛋白酶的催化作用下，豆粕中的大豆球蛋白含量越來(lái)越低。在曲線(xiàn)的開(kāi)始階段，斜率最大，此后逐漸減小，表明隨著中性蛋白酶量的增加，大豆球蛋白降解率的增加也逐漸減小。

2.2.3 酸性蛋白酶用量
由圖 6 可知，在相同的酶解參數(shù)（料水比、溫度和處理時(shí)間）下，隨著酸性蛋白酶（4 號(hào)）量的增加，豆粕中的 β-伴大豆球蛋白降解率增大，表明在酸性蛋白酶的催化作用下，豆粕中的大豆球蛋白含量越來(lái)越低。在 0.6%添加量之后逐漸減小，表明隨著酸性蛋白酶量的增加，大豆球蛋白降解率的增加也逐漸減小。

2.3 復(fù)合酶的制備
優(yōu)選 10 號(hào)堿性蛋白酶、5 號(hào)中性蛋白酶和 4 號(hào)酸性蛋白酶按照 7:5:6 比例制備復(fù)合酶。由圖 7 可知，在相同的酶解參數(shù)（料水比、溫度、酶添加量和處理時(shí)間）下，復(fù)合酶對(duì)抗原蛋白的降解效果優(yōu)于單個(gè)酶。

3、結(jié)論

豆粕是畜牧行業(yè)中優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來(lái)源之一，但豆粕中的抗原蛋白是普通存在的問(wèn)題。酶解法被認(rèn)為是安全有效可降低抗原蛋白的方法， 于海濤等（2018）的試驗(yàn)表明，使用 6 kg/t 的角蛋白酶可以降解 60%的伴大豆球蛋白 和 37%的大豆球 蛋白，本文通過(guò)篩選不同外源酶試驗(yàn)，也得出不同酶制劑對(duì)豆粕中抗原蛋白有不同程度的降解作用，說(shuō)明酶解法確實(shí)是去除抗原蛋白的有效方法。

推測(cè)抗原蛋白類(lèi)物質(zhì)以復(fù) 雜的連接方 式形成復(fù)合體，單一的酶制劑難以充分破壞其結(jié)構(gòu)，因此多種酶制劑的協(xié)同作用效果可能更好， 本文也驗(yàn)證了這一推測(cè)，在同樣的酶解方法下，復(fù)合酶制劑對(duì)豆粕中抗原蛋白降解效果優(yōu)于單一酶制劑。通過(guò)抗原蛋白的降解率分析， 使用外源酶可有效提高豆粕中的蛋白消化利用率， 但是酶解法的酶解效果受酶的種類(lèi)、 添加量、 酶解條件等多種因素的影響。

王之盛等（2004）認(rèn)為，還需要考慮不同酸堿性條件對(duì)酶解能力的影響， 并通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證在堿性條件下有利于豆粕抗原蛋白的降解。因此如何有效降低或者完全去除豆粕中的抗原蛋白， 還需在酶解方法上做更深入的研究。

來(lái)源：預(yù)混料家園
作者：龔阿瓊、高 震