重磅！農(nóng)業(yè)農(nóng)村部關(guān)于進一步嚴厲打擊違法研制生產(chǎn)經(jīng)營使用非洲豬瘟疫苗行為的通知

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農(nóng)業(yè)農(nóng)村部辦公廳關(guān)于進一步嚴厲打擊違法研制生產(chǎn)經(jīng)營使用非洲豬瘟疫苗行為的通知

各省、自治區(qū)、直轄市農(nóng)業(yè)農(nóng)村（農(nóng)牧、畜牧獸醫(yī)）廳（局、委），新疆生產(chǎn)建設兵團農(nóng)業(yè)農(nóng)村局：　　  

截至目前，包括中國在內(nèi)的世界各國均未批準生產(chǎn)經(jīng)營使用非洲豬瘟商品化疫苗，但非法使用非洲豬瘟疫苗問題時有反映。為切實推動非洲豬瘟防控工作有序開展，保持生豬生產(chǎn)恢復向好勢頭，現(xiàn)就嚴厲打擊違法研制生產(chǎn)經(jīng)營使用非洲豬瘟疫苗行為有關(guān)事項通知如下。

一、嚴厲打擊違法研制非洲豬瘟疫苗行為

各省級畜牧獸醫(yī)主管部門要組織對轄區(qū)內(nèi)科研教學單位、企業(yè)等所有獸醫(yī)實驗室開展排查活動，重點檢查是否違法從事非洲豬瘟疫苗研制活動；對實驗室冰箱保存的無標簽疫苗、病料或成份不明的試劑，要開展檢查檢測確認；對實驗活動記錄等要進行仔細核查。如發(fā)現(xiàn)有非洲豬瘟疫苗制苗用種毒或試制疫苗，要進一步核實種毒和試制疫苗的使用和去向情況。如發(fā)現(xiàn)涉嫌違法制售非洲豬瘟疫苗線索，要立即立案查處，依照《獸藥管理條例》《病原微生物實驗室生物安全管理條例》從嚴從快從重處理；涉嫌犯罪的，依法移送公安機關(guān)追究刑事責任。要加強對非洲豬瘟疫苗實驗室研究、臨床試驗單位和中試生產(chǎn)企業(yè)監(jiān)督檢查，重點檢查開展非洲豬瘟疫苗研究的實驗室條件是否符合要求，實驗活動、臨床試驗等是否經(jīng)過審批，臨床試驗范圍等是否與批準的試驗方案一致，中試條件和生物安全防范措施是否符合要求，是否存在非法轉(zhuǎn)移中試產(chǎn)品及其種毒行為等。發(fā)現(xiàn)未經(jīng)批準、擅自開展非洲豬瘟疫苗相關(guān)實驗室研究活動、臨床試驗或非法轉(zhuǎn)移中試產(chǎn)品及其種毒的，要立案查處，并依照《獸藥管理條例》《病原微生物實驗室生物安全管理條例》從嚴從快從重處罰。

二、嚴厲打擊違法生產(chǎn)非洲豬瘟疫苗行為

各省級畜牧獸醫(yī)主管部門要組織對轄區(qū)內(nèi)獸用生物制品生產(chǎn)企業(yè)開展全面檢查，排查是否存在違法制售非洲豬瘟疫苗行為。重點檢查生產(chǎn)企業(yè)的隱蔽場所、原材料出入庫情況、試驗動物購買和使用情況、資金往來情況等，全面查找非法制售假疫苗線索。如發(fā)現(xiàn)違法制售非洲豬瘟疫苗行為，要進一步核查疫苗生產(chǎn)銷售數(shù)量和銷售對象、生產(chǎn)種毒來源等信息，并依照《獸藥管理條例》第五十六條規(guī)定和《獸藥嚴重違法行為從重處罰情形》從嚴從快從重處理，吊銷《獸藥生產(chǎn)許可證》，獸藥生產(chǎn)企業(yè)主要負責人和直接負責的主管人員終身不得從事獸藥生產(chǎn)活動。涉嫌犯罪的，及時依法移送公安機關(guān)追究刑事責任。

三、嚴厲打擊違法經(jīng)營非洲豬瘟疫苗行為

各省級畜牧獸醫(yī)主管部門要組織對轄區(qū)內(nèi)獸藥經(jīng)營企業(yè)開展全面檢查，排查是否存在經(jīng)營所謂“非洲豬瘟中試苗、自家苗、進口苗”等非法疫苗行為。重點檢查無標簽疫苗、出入庫記錄、資金往來等情況，全面查找違法經(jīng)營假疫苗線索。如發(fā)現(xiàn)違法經(jīng)營非洲豬瘟疫苗行為，要進一步核查假疫苗來源、銷售對象和數(shù)量等信息，并依照《獸藥管理條例》第五十六條規(guī)定和《獸藥嚴重違法行為從重處罰情形》從嚴從快從重處理，吊銷《獸藥經(jīng)營許可證》，獸藥經(jīng)營企業(yè)主要負責人和直接負責的主管人員終身不得從事獸藥經(jīng)營活動。涉嫌犯罪的，及時依法移送公安機關(guān)追究刑事責任。

四、嚴厲打擊違法使用非洲豬瘟疫苗行為

各省級畜牧獸醫(yī)主管部門要組織對轄區(qū)內(nèi)生豬養(yǎng)殖企業(yè)（場、戶）開展檢查，排查是否存在違法使用非洲豬瘟疫苗行為。重點檢查冰箱冰柜是否保存有可疑疫苗、疫苗購買記錄、免疫接種記錄、檢測記錄、資金往來等信息，全面查找違法使用假疫苗線索。如發(fā)現(xiàn)違法使用非洲豬瘟疫苗行為，要進一步核查假疫苗來源和數(shù)量等信息，并依據(jù)《獸藥管理條例》第六十二條和《獸藥嚴重違法行為從重處罰情形》從嚴從快從重處罰。必要時商請公安機關(guān)聯(lián)合辦案，一查到底。對養(yǎng)殖企業(yè)（場、戶）使用非洲豬瘟非法疫苗免疫接種的豬只，一經(jīng)檢測為陽性的，視為非洲豬瘟感染豬，予以撲殺，并不得給予補助。

五、組織開展非洲豬瘟疫苗毒鑒別檢測

各省級畜牧獸醫(yī)主管部門在按照《2020年全國非洲豬瘟監(jiān)測方案》組織做好轄區(qū)內(nèi)非洲豬瘟監(jiān)測基礎上，要組織開展鑒別檢測，對來自養(yǎng)殖場、采用實時熒光PCR方法檢測結(jié)果為陽性的組織、血液或口鼻拭子等樣品，可按照“非洲豬瘟病毒流行株與基因缺失株鑒別檢測規(guī)范”（見附件）進行鑒別檢測。鑒別檢測結(jié)果顯示為基因缺失病毒的，各檢測單位要第一時間將檢測結(jié)果及樣品來源信息報省級畜牧獸醫(yī)主管部門。對涉嫌違法單位，省級畜牧獸醫(yī)主管部門要立即組織立案查處。

中國動物疫病預防控制中心和中國動物衛(wèi)生流行病學中心在開展非洲豬瘟病毒監(jiān)測的同時，要對來自養(yǎng)殖場、采用實時熒光PCR方法檢測結(jié)果為陽性的組織、血液或口鼻拭子等樣品進行鑒別檢測。鑒別檢測結(jié)果顯示為基因缺失病毒的，第一時間將檢測結(jié)果及樣品來源信息報我部畜牧獸醫(yī)局。

六、嚴格執(zhí)行非洲豬瘟疫苗“五禁止”監(jiān)管措施

非洲豬瘟疫苗監(jiān)管工作對非洲豬瘟疫情防控和生豬生產(chǎn)恢復影響深遠，采取強力措施、堅決遏制非法研制生產(chǎn)經(jīng)營使用非洲豬瘟疫苗行為是目前各地畜牧獸醫(yī)主管部門面臨的緊迫任務。為保證非洲豬瘟疫苗監(jiān)管職責落實到位，各地畜牧獸醫(yī)主管部門和相關(guān)從業(yè)人員要嚴格執(zhí)行非洲豬瘟疫苗“五禁止”監(jiān)管措施，即：禁止未經(jīng)批準開展實驗活動，禁止未經(jīng)審批開展臨床試驗，禁止生產(chǎn)非法疫苗，禁止經(jīng)營非法疫苗，禁止使用非法疫苗。對存在違法研制生產(chǎn)經(jīng)營非洲豬瘟疫苗行為的單位及其主要負責人、直接負責的主管人員，一經(jīng)查實，全部列入失信懲戒名單，列為重點監(jiān)管對象，從嚴審核行政許可審批事項。

各省級畜牧獸醫(yī)主管部門要及時總結(jié)打擊違法研制生產(chǎn)經(jīng)營使用非洲豬瘟疫苗行為進展情況，并于11月30日前將相關(guān)工作情況報送我部畜牧獸醫(yī)局。

附件：非洲豬瘟病毒流行株與基因缺失株鑒別檢測規(guī)范

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部辦公廳

2020年8月24日

抄送單位：中國動物疫病預防控制中心、中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所、中國動物衛(wèi)生與流行病學中心

非洲豬瘟病毒流行株與基因缺失株鑒別檢測規(guī)范

本規(guī)范適用于非洲豬瘟病毒流行毒株與非洲豬瘟病毒CD2v和MGF 360-505R基因缺失株的熒光PCR方法鑒別檢測。

1. 主要試劑

1.1  核酸提取試劑盒。

1.2  無核酸酶水。

1.3  熒光PCR預混液（2×）。

1.4  引物和探針：P72、CD2v、MGF360-505R基因擴增引物和探針由國家非洲豬瘟參考實驗室設計并提供（聯(lián)系人：李林，電話：0532-87839188）。

1.5 陽性和陰性對照：陽性對照樣品為ASFV基因組DNA標準物質(zhì)（用無核酸酶水稀釋1000倍后使用），由國家非洲豬瘟參考實驗室提供；陰性對照樣品為無核酸酶水。

2.  主要儀器設備

2.1 熒光PCR擴增儀。

2.2 臺式低溫高速離心機。

2.3 組織勻漿機。

2.4 微量可調(diào)移液器（2.5 μL、10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL等不同規(guī)格）。

2.5 無核酸酶離心管與吸頭。

2.6  PCR擴增管。

3.  樣品采集和運輸保存

對活豬，可采集抗凝全血（EDTA抗凝）、口鼻拭子或血清等；對病死豬或已屠宰豬，可采集脾臟、淋巴結(jié)、扁桃體、肝臟等組織。盡快送至實驗室進行病毒核酸檢測。

樣品的運送與保存應滿足NY/T 541《獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范》相關(guān)要求。上述樣品可在4°C最長保存2天；如需長時間保存，應置于-20°C以下。

4.  樣品處理

4.1  組織樣品

取0.1 g～0.2 g樣品，加入1 mL～2 mL預冷的PBS（pH 7.4），用組織勻漿機高速勻漿，制成10%組織勻漿液，以5000 r/min離心10 min，取200 μL上清液進行核酸提取。

4.2  液體樣品

抗凝全血、血清等液體樣品不需進行特殊處理，直接取200 μL進行核酸提取。

5. 病毒核酸的提取和純化

取已進行前處理的樣品200 μL，可按傳統(tǒng)方法提取病毒核酸，也可采用病毒核酸提取試劑盒、自動化核酸提取儀提取病毒核酸。提取后的病毒核酸應立即使用或置于-20°C以下冷凍保存。每次抽提核酸，應包括一個陽性對照樣品和一個陰性對照樣品。

6.  熒光PCR檢測

6.1  熒光PCR反應液制備

在滅菌的離心管中制備符合檢測樣品數(shù)量（包括陽性、陰性對照）要求的熒光PCR反應混合液，至少額外制備兩個樣品的量。每個樣品配制20 μL PCR反應混合液，組成如下：7.5 mL P72、CD2v、MGF360-505R基因引物、探針預混液（P72、CD2v、MGF360-505R基因探針分別用FAM、VIC和Cy5進行標記）、12.5 mL 2×探針法熒光PCR預混液。

分別取20 μL PCR反應混合液加至每個PCR擴增管中；再分別取5 μL DNA模板加入到PCR擴增管中。每次進行熒光PCR擴增時均應設立陽性、陰性對照。陽性對照應用陽性對照樣品所提取核酸作為模板，陰性對照應用陰性對照樣品所提取核酸作為模板。加入模板后，密封PCR擴增管，瞬時離心。將所有PCR擴增管放在熒光PCR儀中。按下述條件運行擴增程序。

6.2  熒光PCR擴增條件

50°C孵育2min；95°C預變性5min；95°C變性15s，60°C退火延伸1min，45個循環(huán)，在每一循環(huán)的60°C時收集FAM、VIC和Cy5通道中的熒光信號。

6.3  結(jié)果分析

Ct值由熒光PCR儀的軟件自動確定。

6.3.1  試驗成立條件

陽性對照P72、CD2v、MGF 360-505R基因的Ct值均＜35且出現(xiàn)特異性擴增曲線，陰性對照P72、CD2v、MGF 360-505R基因無Ct值或陰性對照P72、CD2v、MGF 360-505R基因Ct值≥40且無特異性擴增曲線，判為試驗有效。試驗無效時應重新進行試驗。

6.3.2  P72、CD2v、MGF 360-505R基因檢測結(jié)果判定

6.3.2.1 P72基因檢測結(jié)果判定（FAM通道）

被檢樣品Ct值≤38且出現(xiàn)特異性擴增曲線，判為ASFV P72基因檢測陽性；無Ct值或Ct值≥40，判為ASFV P72基因檢測陰性；38＜Ct值＜40且出現(xiàn)特異性擴增曲線，判為疑似。對疑似樣品，再進行1次復檢，做3個重復；至少2個重復Ct值＜40且出現(xiàn)特異性擴增曲線即判為ASFV P72基因檢測陽性，否則判為ASFV P72基因檢測陰性。

6.3.2.2  CD2v基因檢測結(jié)果判定（VIC通道）

被檢樣品Ct值≤38且出現(xiàn)特異性擴增曲線，判為ASFV CD2v基因檢測陽性；無Ct值或Ct值≥40，判為ASFV CD2v基因檢測陰性；38＜Ct值＜40且出現(xiàn)特異性擴增曲線，判為疑似。對疑似樣品，再進行1次復檢，做3個重復；至少2個重復Ct值＜40且出現(xiàn)特異性擴增曲線即判為ASFV CD2v基因檢測陽性，否則判為ASFV CD2v基因檢測陰性。

6.3.2.3  MGF 360-505R基因檢測結(jié)果判定（Cy5通道）

被檢樣品Ct值≤38且出現(xiàn)特異性擴增曲線，判為ASFV MGF 360-505R基因檢測陽性；無Ct值或Ct值≥40，判為ASFV MGF 360-505R基因檢測陰性；當38＜Ct值＜40且出現(xiàn)特異性擴增曲線，判為疑似。對疑似樣品，再進行1次復檢，做3個重復；至少2個重復Ct值＜40且出現(xiàn)特異性擴增曲線即判為ASFV MGF 360-505R基因檢測陽性，否則判為ASFV MGF 360-505R基因檢測陰性。

6.3.3  綜合判定

結(jié)合P72、CD2v、MGF 360-505R等3個基因的檢測結(jié)果進行綜合判定。具體判定標準見附表。

附表   綜合判定標準

綜合判定結(jié)果	檢測結(jié)果
	P72-FAM	CD2v-VIC	MGF-Cy5
ASFV流行株陽性	+	+	+
ASFV CD2v基因缺失株陽性	+	-	+
ASFV MGF基因缺失株陽性	+	+	-
ASFV CD2v與MGF基因雙缺失株陽性	+	-	-
ASFV陰性	-	-	-

注：“+”代表檢測陽性；“-”代表檢測陰性

來源：農(nóng)業(yè)農(nóng)村部