動(dòng)物基因工程

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  動(dòng)物基因工程

一、遺傳工程的概念

遺傳工程（genetic engineering）是七十年代發(fā)展起來(lái)的一門(mén)新技術(shù)，它是綜合分子生物學(xué)與微生物學(xué)、分子遺傳學(xué)等理論和技術(shù)建立起來(lái)的。

1. 定義

廣義：基因工程、細(xì)胞工程、染色體工程和細(xì)胞器工程。

狹義：基因工程

●基因工程：是一種操作，它不是通過(guò)一般傳統(tǒng)的有性雜交方法，而是采取類(lèi)似于工程建設(shè)的方式，按照預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，借助于實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)，將某種生物的基因或基因組轉(zhuǎn)移到另一種生物中去，使后者定向地獲得新的遺傳性狀，成為新的類(lèi)型。這實(shí)際上就是目前講的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。

2. 基因工程的優(yōu)越性
傳統(tǒng)雜交只能進(jìn)行親緣關(guān)系較近的交配（遠(yuǎn)緣交配失敗），無(wú)法進(jìn)行遠(yuǎn)緣交配（即遺傳物質(zhì)交流），遺傳物質(zhì)交流開(kāi)始是全方位的，通過(guò)人為選擇，可以達(dá)到目的性狀，但工作量大，且容易改變?cè)瓉?lái)的其他優(yōu)良性狀。但基因工程就不同的，它不但可以進(jìn)行種間、屬間科間遺傳物質(zhì)交流，還可以進(jìn)行高等、低等，動(dòng)物與植物間遺傳物質(zhì)交流，同時(shí)可以定向而不改變?cè)瓉?lái)的優(yōu)良性狀，所以十分誘人！目前基因工程主要在以下幾方面應(yīng)用：


a. 生物制藥

b. 遺傳病治療

c. 農(nóng)業(yè)新品種選育

d. 發(fā)酵工程

e. 治理環(huán)境污染(創(chuàng)新微生物類(lèi)型)

f. 其他
等

3. 基因工程施工的程序

a. 施工準(zhǔn)備材料, 即“目的”基因，載體和工具酶等。

b. 把目的基因與載體結(jié)合成重組DNA分子


c. 把重組DNA分子引入受體細(xì)胞，即基因轉(zhuǎn)移，建立分子無(wú)性繁殖或稱(chēng)克隆。
    d. 鑒定篩選轉(zhuǎn)基因系
  二、基因工程的四大要素及實(shí)施要點(diǎn)

（一）基因的克?。ǚ蛛x）

1. 鳥(niǎo)槍法（shot gun）

2. 化學(xué)合成

3. 從cDNA庫(kù)中分離

●cDNA：反轉(zhuǎn)錄DNA

如果已知基因的特異mRNA，就可以直接利用該mRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA（基因）。

值得提出cDNA與原來(lái)的基因組的基因序列可能不一樣，因?yàn)閮?nèi)含子不轉(zhuǎn)錄。

●cDNA文庫(kù)
某一時(shí)期等組織基因轉(zhuǎn)錄形成mRNA總體反轉(zhuǎn)錄成cDNA，這些cDNA總體就稱(chēng)為cDNA文庫(kù)。

4. 從基因組文庫(kù)中分離

●基因組文庫(kù)：將基因組DNA通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶部分酶解后所產(chǎn)生的基因組DNA片段隨機(jī)地同相應(yīng)的載體、重組、克隆，所產(chǎn)生的克隆群體代表基因組DNA的所有序列，現(xiàn)在已構(gòu)建的基因組文庫(kù)主要有：

BAC(細(xì)菌人工染色體)，以細(xì)菌作為對(duì)象，將DNA片段與質(zhì)粒重組后轉(zhuǎn)入細(xì)菌中繁殖。

YAC(酵母人工染色體)，以酵母作為對(duì)象。

PAC(噬菌體人工染色體), 以噬菌體作為對(duì)象。

TAC(可轉(zhuǎn)化的細(xì)菌人工染色體)

MAC(哺乳類(lèi)人工染色體)

(二)重組DNA的建立

為了實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移，首先需要限制酶將“目的”基因安裝在一個(gè)特定的運(yùn)載工具——載體DNA上，在載體DNA的運(yùn)載和保護(hù)下，被轉(zhuǎn)移的基因可以通過(guò)適當(dāng)方法順利進(jìn)入受體細(xì)胞，在受體細(xì)胞中復(fù)制，擴(kuò)增，最后整合到染色體上，達(dá)到穩(wěn)定表達(dá)。

1. 運(yùn)載工具

●作為運(yùn)載工具的條件

〇在宿主細(xì)胞中能自我復(fù)制，并能穩(wěn)定地保存有多種限制酶的切點(diǎn)，每種酶的切點(diǎn)最好只有一個(gè)，酶切后并不損壞其復(fù)制能力及選擇標(biāo)志基因，并能嵌入外源DNA的片段。

〇具有可作為重組DNA分子選擇標(biāo)記遺傳標(biāo)記。

●原核生物載體的種類(lèi)

現(xiàn)在有多種載體，它們分別由從細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體DNA、病毒DNA分離出的元件組裝而成。

〇質(zhì)粒載體：以細(xì)菌質(zhì)粒（plasmid）的各種元件為基礎(chǔ)組建而成的基因工程載體。
質(zhì)粒，環(huán)狀DNA大小1kbp到200kbp。

它們經(jīng)改造后具有作為DNA運(yùn)載工具所有的條件。

a. pBR322質(zhì)粒，廣泛應(yīng)用。


特征：

（a）有36個(gè)單一的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)，（EcoRⅠ，HindⅢ等）

（b）四環(huán)素抗性基因Tetr。外源DNA片段插入到BamHI位點(diǎn)時(shí)，使Tetr失活，可以通過(guò)Ampr Tets來(lái)篩選重組體。

b. pUC18/19質(zhì)粒


     c. pGEM系列多功能載體

●真核生物載體

真核生物載體與原核的不一樣。目前所用的大多是所謂的穿梭載體，它們應(yīng)該具備如下條件：

〇含有原核基因的復(fù)制起始序列以及篩選標(biāo)記

〇含有真核基因的復(fù)制起始序列以及真核細(xì)胞篩選標(biāo)記

〇含有有效的啟動(dòng)子序列

〇RNA聚合酶Ⅱ所需的轉(zhuǎn)錄終止和poly（A）加入的信號(hào)序列。
〇合適供外源基因插入的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)。

舉列：yeast-E.coli穿梭載體

2. 限制性?xún)?nèi)切酶

細(xì)菌細(xì)胞對(duì)外來(lái)DNA具有防御，當(dāng)DNA進(jìn)入時(shí)，DNA會(huì)被一種特殊的酶（即限制性核酸內(nèi)切酶）所毀滅，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)做限制。

這種限制性?xún)?nèi)切酶非常有用，它可以把大的DNA——小片段，也可以把運(yùn)載工具—質(zhì)粒切成適于攜帶基因或片段的狀態(tài)，以便形成重組DNA分子。這是一次巨大的發(fā)現(xiàn)。

●類(lèi)別

第一群以EcoB、Ecok等為代表，能切斷雙鏈，切割部位沒(méi)有特異性。

第二群以EcoR1，HindⅢ（嗜血桿菌）等為代表，能切斷雙鏈，切割部位在DNA分子上有特定的堿基順序，即切割部位具有特異性。


● EcoR1和HindⅢ的特點(diǎn)

〇只在一定核苷酸順序上起作用
  〇多數(shù)可以產(chǎn)生粘性末端，即在酶解時(shí)，DNA雙鏈不在同一地方斷開(kāi)，因而產(chǎn)生的片段兩端都帶有數(shù)個(gè)堿基的單鏈尾巴，這兩個(gè)單鏈尾巴帶有互補(bǔ)的堿基配對(duì)順序，可以互相自動(dòng)接合成為環(huán)狀DNA，因此稱(chēng)為粘性末端。

3. 重組DNA分子的建立

有了“目的”基因、載體DNA、限制酶，下一步是DNA的體外重組，就是把“目的”基因牢牢地安裝在載體上，使它們共價(jià)連接。這就是DNA分子的重組。

DNA的重組主要是采用限制性?xún)?nèi)切酶法。
同一種限制酶切割不同來(lái)源的DNA所產(chǎn)生的DNA片段，雖然區(qū)段和大小不同，但單鏈末端（粘性末端）的順序和長(zhǎng)短都一樣。因此，不同來(lái)源的DNA片段，可以通過(guò)粘性末端對(duì)應(yīng)堿基間的氫鍵集合到一起，再經(jīng)DNA連接酶的作用，將切口接合起來(lái)，成為一個(gè)完整的重組DNA分子（如下圖）。

（三）重組DNA的導(dǎo)入

重組DNA的導(dǎo)入方法有多種

1. 轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染

●轉(zhuǎn)化：以質(zhì)粒為載體的重組DNA分子引入受體細(xì)胞。

●轉(zhuǎn)染：把重組噬菌體或重組病毒DNA引入受體細(xì)胞。

這二種方法導(dǎo)入重組DNA關(guān)鍵的問(wèn)題是要有感受態(tài)的細(xì)胞，即處于最適于攝取外源DNA的生理狀態(tài)的細(xì)胞。目前創(chuàng)建感受態(tài)細(xì)菌的方法是讓受體菌經(jīng)一定濃度的冰冷CaCL2（50~100mmo/L）溶液處理一段時(shí)間。   


2. 高壓電穿孔法，即基因槍的方法方便，但必須有專(zhuān)門(mén)儀器

3. PEG(聚乙二醇)介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法

4. 磷酸鈣或DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染

5. 原生質(zhì)體融合（如下圖）  


6. 脂質(zhì)體法

7. 細(xì)胞顯微注射法   
   
（四）基因重組體的篩選

1. 利用質(zhì)粒上特異的篩選標(biāo)記進(jìn)行特異篩選

2. 分子雜交篩選

3. 其他的方法
三、細(xì)胞工程

1. 體細(xì)胞雜交

2. 細(xì)胞核移植