DNA疫苗在動物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

kinki0396

摘要： DNA疫苗是繼減毒疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗和重組多肽疫苗之后的又一新型疫苗，比其它疫苗高效、安全且易于大量生產(chǎn)。本文對DNA疫苗在牛、豬和雞一些病毒病上的使用效果及其安全問題等方面的研究近況作一綜述。
　　 關(guān)鍵詞： DNA疫苗；動物醫(yī)學(xué)
　　 近年來，許多畜禽病毒性傳染病，已不能依靠傳統(tǒng)疫苗如滅活疫苗、弱毒疫苗等對其進(jìn)行防治，DNA疫苗的出現(xiàn)使得這一狀況得到改善。編碼病毒、細(xì)菌和寄生蟲等不同種類抗原基因的質(zhì)粒DNA，能夠引起脊椎動物如哺乳類、鳥類和魚類等多個物種產(chǎn)生強(qiáng)烈而持久的免疫反應(yīng)。DNA疫苗被稱為繼滅活疫苗和弱毒疫苗、亞單位疫苗之后的“第三代疫苗”，具有廣闊的發(fā)展前景。
　　 1 DNA疫苗簡介
　　 DNA疫苗又稱核酸疫苗或基因疫苗，是編碼免疫原或與免疫原相關(guān)的真核表達(dá)質(zhì)粒DNA(有時也可是RNA)，它可經(jīng)一定途徑進(jìn)入動物體內(nèi)，被宿主細(xì)胞攝取后轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)出抗原蛋白，此抗原蛋白能刺激機(jī)體產(chǎn)生非特異性和特異性2種免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而起到免疫保護(hù)作用。
　　 DNA疫苗具有許多優(yōu)點：①DNA接種載體(如質(zhì)粒)的結(jié)構(gòu)簡單，提純質(zhì)粒DNA的工藝簡便，因而生產(chǎn)成本較低，且適于大批量生產(chǎn)；②DNA分子克隆比較容易，使得DNA疫苗能根據(jù)需要隨時進(jìn)行更新；③DNA分子很穩(wěn)定，可制成DNA疫苗凍干苗，使用時在鹽溶液中可恢復(fù)原有活性，因而便于運輸和保存；④比傳統(tǒng)疫苗安全，雖然DNA疫苗具有與弱毒疫苗相當(dāng)?shù)拿庖咴?，能激活?xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞而誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，但由于DNA序列編碼的僅是單一的一段病毒基因，基本沒有毒性逆轉(zhuǎn)的可能，因此不存在減毒疫苗毒力回升的危險(Davis等，1999)，而且由于機(jī)體免疫系統(tǒng)中DNA疫苗的抗原相關(guān)表位比較穩(wěn)定，因此DNA疫苗也不象弱毒疫苗或亞單位疫苗那樣，會出現(xiàn)表位丟失(Donnelly等，1999)；⑤質(zhì)粒本身可作為佐劑，因此使用DNA疫苗不用加佐劑，既降低成本又方便使用(Babiuk等，1999)；⑥將多種質(zhì)粒DNA簡單混合，就可將生化特性類似的抗原(如來源于相同病原菌的不同菌株)或1種病原體的多種不同抗原結(jié)合在一起，組成多價疫苗，從而使1種DNA疫苗能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生針對多個抗原表位的免疫保護(hù)作用，使DNA疫苗生產(chǎn)的靈活性大大增加。
　　 2 DNA疫苗的應(yīng)用
　　 2.1 豬
　　 2.1.1 偽狂犬病病毒(PRV) 將編碼PRVgC或gD基因的質(zhì)粒DNA免疫豬，能誘導(dǎo)保護(hù)性抗體的生成和細(xì)胞免疫的產(chǎn)生；將編碼gB、gC、gD的多種質(zhì)粒DNA混合使用，對引導(dǎo)免疫反應(yīng)更有效(Gerdts V等，1997；Rooij E M等，1998)。
　　 2.1.2 豬流感病毒(HIV) Mackling等(1998)的試驗結(jié)果表明，編碼HIV1株的血凝素(HA)和核衣殼蛋白(NP)質(zhì)粒DNA用金顆粒包裹，以基因槍轟擊豬的表皮進(jìn)行免疫后，HA質(zhì)粒DNA能使豬產(chǎn)生粘膜免疫反應(yīng)而對流感病毒的攻擊具有抵抗力，DNA疫苗引起的免疫反應(yīng)與滅活疫苗相當(dāng)。
　　 2.1.3 豬呼吸與繁殖綜合征病毒(PRRS) PRRS基因片段ORF5編碼的主要囊膜糖蛋白GP5是該病毒的3個主要結(jié)構(gòu)蛋白之一。含有ORF5基因質(zhì)粒DNA能誘導(dǎo)豬抗GP5特異性中和抗體的產(chǎn)生；且免疫豬的外周血單核細(xì)胞在GP5重組蛋白存在時能夠發(fā)生轉(zhuǎn)化反應(yīng)，顯示了GP5特異性細(xì)胞免疫的產(chǎn)生(Pirzadeh B等，1998)。Meng(2000)將GP5基因克隆入巨細(xì)胞病毒(CMV)早期啟動子的控制之下構(gòu)建成真核表達(dá)質(zhì)粒而制備出DNA疫苗，用其免疫仔豬后可誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生，實驗室攻毒后顯示出良好的保護(hù)效果。
　　 2.1.4 口蹄疫病毒(FMDV) 將FMDV全長基因組的cDNA克隆到質(zhì)粒，并去除其編碼核衣殼蛋白VP1的細(xì)胞結(jié)合部位的DNA序列，構(gòu)建成質(zhì)粒DNA以肌肉或皮內(nèi)注射，初次免疫后2～4周，可使所有的豬都產(chǎn)生特異的病毒中和抗體，攻毒試驗中呈現(xiàn)部分保護(hù)作用(Ward G等，1997)。
　　 2.1.5 豬瘟病毒(CSFV) 余興龍等(2000)構(gòu)建了CSFV主要保護(hù)性抗原E2基因4種不同的真核表達(dá)質(zhì)粒。小鼠免疫試驗結(jié)果表明，E2基因上不同的功能區(qū)對基因疫苗的免疫應(yīng)答有很大影響，有信號肽序列的E2基因可誘導(dǎo)特異性的免疫反應(yīng)，且無跨膜區(qū)序列的E2基因所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)比有跨膜區(qū)序列的強(qiáng)，而無信號肽序列的E2基因所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)比有跨膜區(qū)序列的強(qiáng)，而無信號肽序列的E2基因則不能誘導(dǎo)產(chǎn)生CFSV特異性的免疫反應(yīng)。攻毒保護(hù)試驗結(jié)果表明，免疫家兔最少可抵抗10個最小感染劑量(MID)的豬瘟兔化弱毒苗(HCIV)的攻擊；免疫豬可抵抗致死劑量的CFSV石門株強(qiáng)毒的攻擊。
　　 2.2 牛
　　 2.2.1 牛呼吸道合胞體病毒(BRSV) 用BRSV G基因構(gòu)建的DNA疫苗，以無針方式免疫小牛時比皮內(nèi)或肌肉注射引起的免疫反應(yīng)強(qiáng)烈。
　　 2.2.2 牛皰疹病毒(BHV) 用表達(dá)BHV?1 gD基因的質(zhì)粒DNA疫苗免疫牛，能產(chǎn)生很高的中和抗體；攻毒試驗后發(fā)現(xiàn)，免疫組比非免疫組的病毒排放量明顯減少(schrijver R S等，1997)。此疫苗通過肌肉或皮內(nèi)注射均可引導(dǎo)免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。但皮內(nèi)注射引起的免疫反應(yīng)更強(qiáng)(孟松樹等，2000)。?
　　 2.2.3 牛病毒性腹瀉病毒(BVDV) 以表達(dá)BVDV1型主要糖蛋白E2的質(zhì)粒DNA肌肉注射小牛，可產(chǎn)生病毒中和抗體和抗原特異的細(xì)胞增殖反應(yīng)；免疫后16周進(jìn)行攻毒試驗，發(fā)現(xiàn)免疫牛能產(chǎn)生針對BVDV1型和2型的血清中和抗體強(qiáng)烈的記憶抗體反應(yīng)，對牛有部分免疫保護(hù)作用(Cox G J等，1993)。?
　　 2.3 雞
　　 2.3.1 新城疫病毒(DNV) Sakaguchi等(1996)將NDV F基因插入質(zhì)粒載體，F(xiàn)基因的表達(dá)受巨細(xì)胞病毒早期增強(qiáng)子和雞β?肌動蛋白啟動子控制。1周齡試驗雞肌肉內(nèi)注射重組質(zhì)粒后，有2/5注射線性質(zhì)粒的雞和4/5注射線性質(zhì)粒與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑混合物的雞產(chǎn)生了高水平針對F蛋白的抗體，而注射閉環(huán)狀質(zhì)粒的雞不能產(chǎn)生抗體。免疫9周后，體內(nèi)有抗體的試驗雞都能抵抗致死劑量NDV強(qiáng)毒的攻擊。?
　　 2.3.2 雞傳染性喉氣管炎病毒(ILT) 將分別構(gòu)建的含有雞傳染性喉氣管炎病毒王崗株gB、gC和gD基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒及空載體質(zhì)粒分組注射雛雞，攻毒后觀察免疫保護(hù)效果。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒誘導(dǎo)了免疫應(yīng)答，免疫保護(hù)率達(dá)到79%，該基因疫苗可以作為預(yù)防ILV的1個補(bǔ)充。?
　　 2.3.3 禽流感病毒 Robinson等(1993)最先將DNA疫苗用于雞，以編碼禽流感病毒H7N7株血凝素(HA)基因的質(zhì)粒(DNA)由不同途徑(靜脈、腹腔、皮下注射)免疫3周齡雞，可對致死劑量的H7N7株病毒鼻內(nèi)攻擊產(chǎn)生50%的保護(hù)。Fyna等(1993)為了研究DNA疫苗對雞最有效的免疫途徑，將100～200 μg編碼H7?HA的質(zhì)粒DNA通過靜脈、肌肉、皮下注射、點眼、囊內(nèi)、滴鼻等方式免疫3周齡雞。4周后進(jìn)行第2次免疫。第6周，用致死劑量的H7N7攻擊，免疫雞的存活率達(dá)10%～63%，而對照組的存活率只有2%。其中，多種途徑如靜脈和肌肉注射共同免疫的效果，比單一途徑如肌肉注射、點眼、法氏囊內(nèi)、滴鼻免疫效果好。Kodihalli等(1997)將編碼H5?HA的質(zhì)粒DNA以0.25、0.5、1.5或10 μg用基因槍免疫雞，4周后以100LD?50的Ty/lre/83株鼻內(nèi)免疫進(jìn)行攻擊，低至0.25 μg劑量的DNA可使50%的免疫雞存活。而1、5、10 μg的劑量可完全抵抗致死劑量病毒的攻擊。DNA疫苗對致死劑量的抗原變異株也可提供95%的保護(hù)，證實DNA流感疫苗具有廣闊的發(fā)展前景。
　　 國內(nèi)研制的H7亞型血凝素基因DNA疫苗，在極小的使用劑量下即可成功誘導(dǎo)免疫保護(hù)反應(yīng)，并有效阻斷同源低致病力禽流感病毒在機(jī)體內(nèi)的感染和排毒；研制的H5亞型血凝素DNA疫苗，具有良好的免疫原性，肌肉注射途徑即可獲得對同源強(qiáng)毒攻擊的免疫保護(hù)，并能有效阻斷免疫保護(hù)存活雞機(jī)體的排毒。
　　 3 DNA疫苗的安全性 雖然人們對于使用DNA疫苗的安全性存有疑慮，擔(dān)心DNA可能會整合到宿主細(xì)胞的染色體上而造成插入突變，但眾多研究結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)有插入突變的現(xiàn)象。質(zhì)粒DNA在動物體內(nèi)會緩慢降解，不會造成動物的自體免疫(陳化蘭等，1998)，也不隨卵子和精子傳入子代體內(nèi)，它隨生物鏈進(jìn)入其他物種體內(nèi)時也會失活，而且對環(huán)境的污染很小，因此其危險性遠(yuǎn)低于現(xiàn)用疫苗。
　　 4 結(jié)語
　　 雖然近幾年來鳥類和哺乳類動物DNA疫苗的制作技術(shù)已趨成熟，但對于DNA疫苗的作用機(jī)制和各種病原體抗原基因的分離也有待于進(jìn)一步的探索?？梢钥隙?，未來更多的高效安全、使用方便的DNA疫苗的制備和大規(guī)模生產(chǎn)，必將能促進(jìn)我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。




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[ 本帖最后由 kinki0396 于 2007-7-9 14:22 編輯 ]