豬偽狂犬病診斷方法研究進(jìn)展

kinki0396 · 發(fā)表于 2007-7-13 10:36:41

偽狂犬病(Pseudorabies，PR)由偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起，最早發(fā)現(xiàn)于美國，因臨床表現(xiàn)與狂犬病類似，故稱偽狂犬病。該病在全球范圍內(nèi)的流行呈上升趨勢，世界上已有50多個(gè)國家和地區(qū)報(bào)導(dǎo)該病的流行。我國自1947年劉永純從豬體分離到PRV以來，已有24個(gè)省(市)、自治區(qū)報(bào)導(dǎo)流行[1]。文章主要對(duì)血清學(xué)、分子生物學(xué)診斷與檢測方法以及鑒別診斷方法進(jìn)行綜述。

1　傳統(tǒng)診斷方法

1.1　臨床診斷和病理組織學(xué)檢查

成年豬無明顯癥狀，母豬流產(chǎn)或產(chǎn)死胎，仔豬表現(xiàn)神經(jīng)癥狀，肌肉振顫，嚴(yán)重時(shí)四肢劃水樣運(yùn)動(dòng)，體溫升高達(dá)41 ℃～42 ℃。取PR病例的腦和脊髓做成組織切片，蘇木素-伊紅染色后觀察呈現(xiàn)非化膿性腦炎變化，其他大體剖檢特征不明顯。在神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞可檢出A型核內(nèi)包涵體。

1.2　動(dòng)物接種試驗(yàn)

將典型病例病料懸液給家兔、小鼠或雞胚接種，觀察其臨床癥狀的出現(xiàn)從而確診。家兔出現(xiàn)精神委頓，體溫升高，繼而注射部位出現(xiàn)奇癢癥狀，隨即肌肉痙攣，角弓反張，最后死亡。小鼠接種后有奇癢癥狀，持續(xù)12 h，在2 d～5 d內(nèi)死亡。雞胚接種后3 d～4 d后，病毒侵害神經(jīng)系統(tǒng)，雞胚死亡[2]。

2　血清學(xué)診斷

2.1　中和試驗(yàn)

中和試驗(yàn)(serum neutralization test，SN)又稱微量血清中和試驗(yàn)(mircoserum neutralization test，MSNT)，作為病毒檢測的經(jīng)典方法，是世界上多數(shù)國家檢測PR的法定方法之一[3]。

方六榮等[4]用MSNT進(jìn)行了PR的血清學(xué)調(diào)查。通過監(jiān)測中和指數(shù)和中和效價(jià)，發(fā)現(xiàn)SNT的特異性很強(qiáng)，但敏感性較低。如果延長抗原與血清的孵育時(shí)間，尤以補(bǔ)體存在時(shí)，可使其敏感性增高。由于該法操作繁瑣，工作量大，且受技術(shù)、細(xì)胞等條件限制，給實(shí)際應(yīng)用帶來一定的困難。

2.2　乳膠凝集試驗(yàn)

乳膠凝集試驗(yàn)(latex agglutination test，LAT)利用抗原抗體特異性結(jié)合的性質(zhì)，先用乳膠包被抗原，再與相應(yīng)血清反應(yīng)，如幾分鐘內(nèi)發(fā)生凝集，可判定有PRV感染。日本的柴因勛對(duì)比了LAT和SNT，檢驗(yàn)了1 659份血清樣品，發(fā)現(xiàn)LAT和SNT的相符程度達(dá)97.6%。且由于LAT可以檢測有很強(qiáng)凝集活性的IgM，可以早于SNT檢測到PR病毒的抗體。國內(nèi)吳斌等(1997)做了同類試驗(yàn)也表明LAT和SNT間無統(tǒng)計(jì)上的差異。美國已經(jīng)有商品化的LAT試劑盒供臨床使用[5]，華中農(nóng)大也于國內(nèi)率先研制成功LAT試劑盒。LAT操作簡單、方便、快速，且敏感性、特異性強(qiáng)，適用于疫病監(jiān)測或流行病學(xué)調(diào)查，以及種豬群檢疫凈化陽性豬初次篩選。與SNT相比，LAT具有更加廣闊的推廣前景[6]。

2.3　免疫熒光試驗(yàn)

Stewart等(1967)首先應(yīng)用熒光抗體染色法(immunofluorescence，IF)檢查分別以病毒和病料接種的PK-15細(xì)胞培養(yǎng)物，獲良好結(jié)果。用免疫熒光技術(shù)對(duì)采自不同組織的病料進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，扁桃體和淋巴結(jié)的檢出率最高，其次是大腦、脾和脊髓。黃駿明等(1995)報(bào)導(dǎo)建立了檢出率在95%以上的直接免疫熒光試驗(yàn)。取病豬的腦三叉神經(jīng)、延腦和脊髓等組織作冰凍切片后免疫熒光檢查，可于2 h～ 4 h內(nèi)得到結(jié)果。此法是我國目前用于PR快速診斷的一種較好的方法。

2.4　酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-Iinked immunosorbent assay，ELISA) 具有快速、簡便的優(yōu)點(diǎn)，IgM-ELISA還可早期檢測[7]。OIE將其作為診斷豬PR的首選血清學(xué)方法。美國也將ELISA作為3種PR的法定檢測方法之一。

用ELISA檢測PRV抗體的方法由Snyder等(1978)首創(chuàng)。Homme P等 (1997)將PRV gD基因在桿狀病毒中表達(dá)，制成重組抗原并建立了競爭ELISA(cELISA)。用此法可檢測到感染2周后血清陽轉(zhuǎn)的情況。Gut M等[8]用同樣載體表達(dá)了gE糖蛋白和gI糖蛋白，構(gòu)建了直接競爭ELISA(gE/gI -ELISA)，試驗(yàn)證明gE/gI ELISA比gE-ELISA的敏感性和特異性更強(qiáng)，還可用于檢測感染2周齡的早期感染豬血清中的抗體。

婁高明等(1998)建立了檢測PRV抗原的雙抗體夾心ELISA法，因其操作簡便，不需要昂貴的儀器，因此適合大規(guī)模的檢驗(yàn)檢疫。四川農(nóng)業(yè)大學(xué)的曹三杰等[9]建立了Dot-PPA-ELISA，可檢測最低IgG含量為1.398×10－8g。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所研制的Dot-ELISA試劑盒已投入使用[10]。

2.5　瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

1977年Gutekunst D E等首次報(bào)道了利用微量免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(microimmunodiffusion test，MIDT)檢測了2 200多頭豬血清中的PRV抗體，其陽性結(jié)果與SNT相同[11]。此法所得結(jié)果不受血清污染、溶血和細(xì)胞毒素等條件的影響，具備經(jīng)濟(jì)和操作簡便、重復(fù)性好、特異的優(yōu)點(diǎn)，但敏感性不高。Willam P(1994)分別對(duì)MIDT、SNT、對(duì)流免疫電泳(countercurrent immunoelectrophoresis，CIE)進(jìn)行了比較，3種方法的檢測結(jié)果也很接近。國內(nèi)的黃生(1989)、吳斌(1997)在做了同類的比較試驗(yàn)后認(rèn)為MIDT操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，適合基層和大型豬場使用。

2.6　血凝試驗(yàn)與血凝抑制試驗(yàn)

Tetsu N等(1989)發(fā)現(xiàn)PRV可以凝集Balb/c小鼠紅細(xì)胞，并以此建立了PRV的血凝試驗(yàn)與血凝抑制試驗(yàn)(hemagglutination or HA-inhibition，HA或HI)，檢查豬血清抗體的結(jié)果與SNT緊密相關(guān)，但是HI效價(jià)較低。Inaba Y將抗原與血清孵育時(shí)間延至48 h，再加補(bǔ)體繼續(xù)孵育1 h，效價(jià)比前法高2倍～32倍。但是，Yamada S等研究發(fā)現(xiàn)gC-PrV 突變株不能凝集紅細(xì)胞。吳平等(1991)用單克隆抗體致敏綿羊紅細(xì)胞，建立了反向間接血凝抑制試驗(yàn)，SNT符合率為94%。

2.7　免疫組化法

Narita等(1982) 建立了免疫組化技術(shù)檢測組織中重激活的PRV。Ducatelle等(1982)用免疫過氧化物酶技術(shù)檢測了61頭有神經(jīng)癥狀的病豬，發(fā)現(xiàn)與病毒分離試驗(yàn)試驗(yàn)相符程度為95%。Afsher等(1986) 建立了可對(duì)PRV進(jìn)行定量分析的免疫過氧化物酶蝕斑染色方法[12]。

除以上方法外，還有補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)、放射免疫試驗(yàn)[13]和對(duì)流免疫電泳等試驗(yàn)可用于PR的診斷。

3　分子生物學(xué)診斷

3.1　核酸探針技術(shù)

核酸探針又稱核酸雜交(ribonucleotide hybridization)，具有高特異性、高敏感性的特點(diǎn)，已被用于PR的診斷。Brown T M等(1988)建立了檢測感染豬體內(nèi)PRV-DNA的原位雜交法[14]。Linne T(1987)報(bào)道的斑點(diǎn)雜交法中，用P32標(biāo)記的探針在感染后4 h就可檢出組織中的病毒DNA，而分離病毒需要1 d～2 d。Maes R K等[15]用生物素和地高辛標(biāo)記探針，其敏感度為1 pg～5 pg。郭萬柱 (1991)等也用全基因組和重組質(zhì)粒制備了P32標(biāo)記的探針，成功的檢測了10 pg的PRV DNA。李學(xué)伍等(1997)利用PCR(polymerase chain reaction，PCR) 特異性擴(kuò)增產(chǎn)物制備地辛高標(biāo)記的探針，對(duì)閩A株、鄂A株、Baratna株、英國株及臨床病料進(jìn)行檢測，結(jié)果與PCR檢測結(jié)果相符，準(zhǔn)確率為100%，靈敏度達(dá)到2 pg DNA。在沒有PCR技術(shù)之前，核酸原位雜交技術(shù)是短時(shí)間檢查PRV潛伏感染的最敏感的方法。

3.2　PCR診斷

Belak S等(1989)率先建立了PCR檢測PRV的方法。Jestin A等(1990)由鼻拭子抽提核酸，擴(kuò)增gD基因序列而檢測到PRV。李學(xué)伍等(1998)研究發(fā)現(xiàn)，PCR的敏感性顯著高于MSNT，PRV檢出率最高的組織為三叉神經(jīng)節(jié)(100%)。Galeota-wheeler等通過合成擴(kuò)增gD基因的引物，從豬的扁佻體、三叉神經(jīng)節(jié)、嗅球和腦干中檢測出了潛伏感染的PRV DNA。Talmage T B等[16]應(yīng)用來自gB(g)基因的寡核苷酸引物對(duì)活檢的扁桃體細(xì)胞或?qū)嵸|(zhì)組織進(jìn)行擴(kuò)增，可檢查潛伏感染。其還通過應(yīng)用來自gB 基因的嵌套引物對(duì)PRV DNA 進(jìn)行扁桃體細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增并應(yīng)用原位雜交來探查細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增的DNA，大大提高了檢出率。Cheung A K[17]也通過PCR在14頭豬中檢出三叉神經(jīng)節(jié)(100%)和扁桃體(86%)中的潛伏感染。PCR敏感性高，特異性好，費(fèi)時(shí)少，可作為活體檢查用。

4　鑒別診斷

目前，PR防控中使用了大量的疫苗，以上的檢測方法無法區(qū)分疫苗毒和野毒的感染，要區(qū)分疫苗接種動(dòng)物和野毒感染動(dòng)物，就需要以下的鑒別診斷方法。

4.1　限制性核酸內(nèi)切酶分析

Lomniczi B等(1984)對(duì)Bartha和Norden等疫苗毒株及Ka等野毒株DNA用BamHⅠ，Bgl和Kpn酶切分析，發(fā)現(xiàn)弱毒株在US區(qū)有缺失。Gielkens A L J等(1985)NIA-3等野毒株和Bartha，BUK，Ercegovac，B-KAL和MK-25 5個(gè)弱毒疫苗株DNA以BamHⅠ酶切分析也證實(shí)疫苗株在US區(qū)缺失，導(dǎo)致酶切圖譜改變。此法可用于流行病學(xué)調(diào)查。

4.2　ELISA

根據(jù)疫苗株所缺失的糖蛋白可將鑒別ELISA分為gE-ELISA、gC-ELISA和gG-ELISA。其中gE-ELISA敏感性最高，應(yīng)用較多，最早由荷蘭的Van Oirschot J T等(1986)建立，其敏感性好于SNT。Morenkov O S等[18]建立了兩種檢測PR gE抗體的間接ELISA。一種是利用大腸埃希菌表達(dá)gE基因N末端氨基酸1位～125位的融合蛋白而建立的重組gE-ELISA，一種是利用親和層析技術(shù)從病毒粒子中提純的天然gE蛋白而建立的親和層析gE-ELISA。這兩種ELISA法均可區(qū)分gE基因缺失苗免疫與野毒感染所產(chǎn)生的抗體。美國和歐共體規(guī)定，使用的疫苗至少要缺失gE基因，利用gE-ELISA 就可將疫苗株和野毒株區(qū)分開，從而逐步根除PR。

此外，Cook等(1990)建立了檢測抗gG 抗體的阻斷gG-ELISA，該方法可以區(qū)分疫苗株與野毒株，但敏感性不如常規(guī)ELISA法[19]。有研究發(fā)現(xiàn)在有母源抗體存在的情況下，gG缺失株疫苗免疫原性好于gE缺失株。唐勇等也建立了gC-ELISA鑒別診斷方法，并成功的制成了試劑盒[20]。

ELISA方法敏感性高、特異性強(qiáng)，而且簡便、快速、重復(fù)性好，適于大量樣品的檢測，是目前最好的鑒別診斷方法。但要注意根據(jù)不同地區(qū)或豬場所使用的基因缺失疫苗關(guān)聯(lián)的ELISA法，以免造成誤診。

4.3　PCR

Scherba G等(1992)在根據(jù)gG基因和lacz基因設(shè)計(jì)了上下游引物，建立了區(qū)分PRV疫苗株與野毒株的PCR方法，并通過對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行Southern雜交和液相色譜分析建立了定量PCR技術(shù)。Hasebe H等(1993)根據(jù)gD和gE-g I基因序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，對(duì)人工感染Bartha、BUK以及另外5株野毒的豬組織DNA進(jìn)行擴(kuò)增，也能有效地區(qū)分強(qiáng)弱毒。冉智光(1998)等分別根據(jù)gB和gE設(shè)計(jì)兩對(duì)引物建立了復(fù)合PCR鑒別診斷方法，成功的將國內(nèi)普遍防疫使用的Bartha-K61株和野毒株區(qū)分開。劉莉娜等[21]建立了多重PCR，檢出了106 pg的基因缺失苗毒且特異性好。陳陸等[22]建立了gE/gB鑒別診斷方法，敏感、特異且可以檢測潛伏感染。

5　電子顯微鏡檢測

應(yīng)用電子顯微鏡可以直接觀察PRV粒子。王家富等(1996) 在電鏡下觀察純化的PRV湖北株，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)與皰疹病毒極為相似，成熟的病毒顆粒呈球形或圓形，直徑在200 nm，囊膜較厚，病毒外周可看到纖突，也可以看到直徑約150 nm的小囊膜病毒、未成熟病毒粒子。

6　結(jié)語

目前，可以用來診斷豬PRV的多種檢測手段中，傳統(tǒng)檢測手段可靠，但往往操作較復(fù)雜，或耗時(shí)較長，實(shí)際應(yīng)用有一定困難。血清學(xué)檢測手段，尤其是研制成功的LAT和部分ELISA試劑盒操作簡單、方便，不需要使用昂貴復(fù)雜的儀器，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，特別是鑒別ELISA試劑盒可鑒別野毒感染和疫苗免疫動(dòng)物，但一些ELISA方法還不夠完善仍，是有待解決的問題。分子生物學(xué)方法特別是PCR技術(shù)，隨著研究的深入將更加趨于敏感、簡便、快速、實(shí)用化。目前，美國和歐盟國家已經(jīng)啟動(dòng)了PR撲滅計(jì)劃。建立和完善可用于我國PR的控制以致最終消滅該病的診斷方法，是我國廣大獸醫(yī)科技工作者面臨的重大課題之一。

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