《重新修改》豬圓環(huán)病毒2型江西毒株的全基因擴增與序列分析

kinki0396

　豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus,PCV）是由Tischer 等于1974年在PK-15細胞中發(fā)現的。病毒粒子為20面體對稱，以滾環(huán)方式進行復制，可在PK-15細胞上生長，但不引起細胞病變，現將其歸為圓環(huán)病毒科（Circoviridae）圓環(huán)病毒屬。PCV主要由衣殼蛋白和基因組組成，存在兩種血清型，即PCV-1和PCV2。PCV-1無致病性，基因組總長為1.759×103 bp，包含7個讀碼框架，廣泛存在于豬體各器官組織及豬源細胞中。PCV2首先由Allan等從患斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（PMWS）的豬群中分離到，被證明為PMWS的重要病原?；钾i表現為明顯食欲不振、生長遲緩、皮毛不整、皮膚蒼白，常伴有黃疸和低燒，如并發(fā)感染會加劇死亡，不死者多變成僵豬。剖檢可見患豬表現為全身淋巴結腫大，間質性肺炎，脾輕度腫大，肝硬變等。PMWS既可水平傳播，導致斷奶仔豬發(fā)病死亡，亦可垂直傳播，引起繁殖障礙。目前在中國、德國、法國、西班牙、加拿大、美國、日本、印度等國家和中國臺灣地區(qū)已有檢測到PCV2的相關報道。PCV2常和豬呼吸和繁殖綜合征病毒（PRRSV）、細小病毒（PPV）、偽狂犬病病毒（PRV）混合感染，造成豬的免疫失敗。PCV2基因組為1 768 bp或1 767 bp，含有11個閱讀框。PCV-1、PCV2均包含有2個主要的開放閱讀框（ORF）即ORF1和ORF2。ORF1在兩株PCV間相對保守，ORF2可變性較大。二者的主要結構蛋白均由ORF2編碼，而ORF1則與病毒的復制有關。?

　　本實驗旨在用PCR方法擴增到PCV2江西病料的全基因組，并對其序列進行分析，從而為該病毒的分子生物學、流行病學等作一研究。?

　　1 材料與方法  

　　1.1  可疑病料   從江西豬種中采集表現PMWS癥狀斷奶仔豬的肝、肺、淋巴結等病料，分裝后－20℃保存?zhèn)溆谩?

　　1.2  DNA提取   取肺門淋巴結、脾臟組織少量，分別加入約4倍體積的組織裂解緩沖液沖洗研磨后6 000 r/min離心35 min后取上清液。按終濃度20 μg/ml?加入胃蛋白酶K，50℃消化2 h。再依次用等體積的飽和酚，等體積的酚/氯仿/異戊醇（25∶?24∶?1）提取組織中的總DNA。然后用無水乙醇沉淀DNA，并將其溶解在無DNA酶的TE緩沖液（pH7.5）中，－20℃保存待用。

　　1.3  引物設計  根據NCBI上PCV2的序列，并對國內外已使用的引物進行篩選，采用如下兩對引物：?

　　引物1：5′?CCGCGGGCTGGCTGAACTT-3′?

　　引物2：5′?CTCGGCTATGCGCTCCAAAAT-G-3′?

　　引物3：5′  GATTTTGTTGGTCCCCCCTC3′?

　　引物4：5′  TTTAGTCTCTACAGTCAATG3′?

　　引物1、2擴增長度為1 154 bp，引物3、4擴增長度1 069 bp,擴增的兩片段重疊區(qū)超過450 bp。引物由TaKaRa公司合成，為凍干粉，用前溶解于滅菌超純水，濃度為20 pmol/μl,－20℃保存。?

　　1.4  PCR反應   兩片段PCR擴增采用相同條件。所加PCR成分為：1×PCR buffer，2.5 mmol的MgCl2， 0.2 mmol的dNTPs，0.4 μmol的引物，2 U的Taq聚合酶 。PCR擴增條件設置為：94℃變性?5 min?之后進行35個循環(huán)（94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min），72℃延伸8 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。?

　　1.5 PCR擴增產物純化回收將PCR  產物瓊脂糖電泳，切割所得特異性擴增條帶，用膠回收試劑盒回收。

　　1.6   測序分析   測序工作由上海生工完成，應用DNA Star軟件對基因序列做分析比較并繪制系統發(fā)生樹。?

　　2 結果  

　　2.1  PCR擴增   PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，成像系統分析可見，7個PCR擴增產物中都出現特異條帶，大小與預期相符，分別為1 156 bp和1 069 bp。?

　　2.2 序列分析   經測序，待檢的江西豬場的病料PCV2全基因全長，A株為1 767 bp，B株為1 768 bp，與資料報道相一致。將所測序列與GenBank中的其他已知參考毒株進行比較。所選序列包括3個美國株（USA），5個加拿大株，1個荷蘭株，2個法國株，1個西班牙株，2個德國株，2個中國臺灣株，及中國大陸各地區(qū)共6個。結果顯示，本研究的2個分離株與世界上其他不同地區(qū)的23個已知的PCV2分離株的基因組序列密切相關，各個核苷酸序列之間的同源率在95.4%～99.8%。本實驗所測的兩病料全序列核苷酸同源率為99.4%。A、B株和國內的毒株的同源性普遍較高均在 96%以上，它們都與加拿大的AF027217同源率最高(分別為99.8%和?99.5%?)；從總體上來說兩個分離株與法國、部分加拿大的同源性普遍高于美國、瑞典、德國、荷蘭等國。本研究的2個分離株及其他己知的PCV2分離株之間的全基因組序列同源率見表1。從上述的比較來看在PCV2進化上有著一定的地理位置上的差異，通過DNAstar分析生物學軟件所繪制的PCV2全基因組進化樹(圖3)可以看出除北京和中國臺灣外中國大多分離株均在一個較大的分支上，其中本研究所分離的A株被單獨分支，B株則和一個江蘇分離株也獨立成為其中一個小分支；而另一個較大的分支則主要由美洲株組成，在這個分支上還有一個德國分離株和一個西班牙分離株，它們也都各自獨立分支；另外，還有一個江蘇分離株與其他地域的分離株差異較大而單獨成一支。?

　　3 討論  

　　資料表明，PCV2是PMWS的主要病因，本實驗從江西豬PMWS可疑病料中成功擴增到了PCV2片段并進行了測序，進一步證實了PCV2與PMWS的相關性，病料中是否還存在其他病原還需進一步研究。


                                                                                                  

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[ 本帖最后由 kinki0396 于 2007-7-14 15:18 編輯 ]

vetxy

呵呵，原來你說幾十年前是指PCV1。