《重新修改》豬圓環(huán)病毒2型江西毒株的全基因擴(kuò)增與序列分析

kinki0396

　豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus,PCV）是由Tischer 等于1974年在PK-15細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的。病毒粒子為20面體對(duì)稱，以滾環(huán)方式進(jìn)行復(fù)制，可在PK-15細(xì)胞上生長(zhǎng)，但不引起細(xì)胞病變，現(xiàn)將其歸為圓環(huán)病毒科（Circoviridae）圓環(huán)病毒屬。PCV主要由衣殼蛋白和基因組組成，存在兩種血清型，即PCV-1和PCV2。PCV-1無(wú)致病性，基因組總長(zhǎng)為1.759×103 bp，包含7個(gè)讀碼框架，廣泛存在于豬體各器官組織及豬源細(xì)胞中。PCV2首先由Allan等從患斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）的豬群中分離到，被證明為PMWS的重要病原。患豬表現(xiàn)為明顯食欲不振、生長(zhǎng)遲緩、皮毛不整、皮膚蒼白，常伴有黃疸和低燒，如并發(fā)感染會(huì)加劇死亡，不死者多變成僵豬。剖檢可見(jiàn)患豬表現(xiàn)為全身淋巴結(jié)腫大，間質(zhì)性肺炎，脾輕度腫大，肝硬變等。PMWS既可水平傳播，導(dǎo)致斷奶仔豬發(fā)病死亡，亦可垂直傳播，引起繁殖障礙。目前在中國(guó)、德國(guó)、法國(guó)、西班牙、加拿大、美國(guó)、日本、印度等國(guó)家和中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)已有檢測(cè)到PCV2的相關(guān)報(bào)道。PCV2常和豬呼吸和繁殖綜合征病毒（PRRSV）、細(xì)小病毒（PPV）、偽狂犬病病毒（PRV）混合感染，造成豬的免疫失敗。PCV2基因組為1 768 bp或1 767 bp，含有11個(gè)閱讀框。PCV-1、PCV2均包含有2個(gè)主要的開放閱讀框（ORF）即ORF1和ORF2。ORF1在兩株P(guān)CV間相對(duì)保守，ORF2可變性較大。二者的主要結(jié)構(gòu)蛋白均由ORF2編碼，而ORF1則與病毒的復(fù)制有關(guān)。?

　　本實(shí)驗(yàn)旨在用PCR方法擴(kuò)增到PCV2江西病料的全基因組，并對(duì)其序列進(jìn)行分析，從而為該病毒的分子生物學(xué)、流行病學(xué)等作一研究。?

　　1 材料與方法  

　　1.1  可疑病料   從江西豬種中采集表現(xiàn)PMWS癥狀斷奶仔豬的肝、肺、淋巴結(jié)等病料，分裝后－20℃保存?zhèn)溆谩?

　　1.2  DNA提取   取肺門淋巴結(jié)、脾臟組織少量，分別加入約4倍體積的組織裂解緩沖液沖洗研磨后6 000 r/min離心35 min后取上清液。按終濃度20 μg/ml?加入胃蛋白酶K，50℃消化2 h。再依次用等體積的飽和酚，等體積的酚/氯仿/異戊醇（25∶?24∶?1）提取組織中的總DNA。然后用無(wú)水乙醇沉淀DNA，并將其溶解在無(wú)DNA酶的TE緩沖液（pH7.5）中，－20℃保存待用。

　　1.3  引物設(shè)計(jì)  根據(jù)NCBI上PCV2的序列，并對(duì)國(guó)內(nèi)外已使用的引物進(jìn)行篩選，采用如下兩對(duì)引物：?

　　引物1：5′?CCGCGGGCTGGCTGAACTT-3′?

　　引物2：5′?CTCGGCTATGCGCTCCAAAAT-G-3′?

　　引物3：5′  GATTTTGTTGGTCCCCCCTC3′?

　　引物4：5′  TTTAGTCTCTACAGTCAATG3′?

　　引物1、2擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 154 bp，引物3、4擴(kuò)增長(zhǎng)度1 069 bp,擴(kuò)增的兩片段重疊區(qū)超過(guò)450 bp。引物由TaKaRa公司合成，為凍干粉，用前溶解于滅菌超純水，濃度為20 pmol/μl,－20℃保存。?

　　1.4  PCR反應(yīng)   兩片段PCR擴(kuò)增采用相同條件。所加PCR成分為：1×PCR buffer，2.5 mmol的MgCl2， 0.2 mmol的dNTPs，0.4 μmol的引物，2 U的Taq聚合酶 。PCR擴(kuò)增條件設(shè)置為：94℃變性?5 min?之后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)（94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min），72℃延伸8 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。?

　　1.5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收將PCR  產(chǎn)物瓊脂糖電泳，切割所得特異性擴(kuò)增條帶，用膠回收試劑盒回收。

　　1.6   測(cè)序分析   測(cè)序工作由上海生工完成，應(yīng)用DNA Star軟件對(duì)基因序列做分析比較并繪制系統(tǒng)發(fā)生樹。?

　　2 結(jié)果  

　　2.1  PCR擴(kuò)增   PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，成像系統(tǒng)分析可見(jiàn)，7個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中都出現(xiàn)特異條帶，大小與預(yù)期相符，分別為1 156 bp和1 069 bp。?

　　2.2 序列分析   經(jīng)測(cè)序，待檢的江西豬場(chǎng)的病料PCV2全基因全長(zhǎng)，A株為1 767 bp，B株為1 768 bp，與資料報(bào)道相一致。將所測(cè)序列與GenBank中的其他已知參考毒株進(jìn)行比較。所選序列包括3個(gè)美國(guó)株（USA），5個(gè)加拿大株，1個(gè)荷蘭株，2個(gè)法國(guó)株，1個(gè)西班牙株，2個(gè)德國(guó)株，2個(gè)中國(guó)臺(tái)灣株，及中國(guó)大陸各地區(qū)共6個(gè)。結(jié)果顯示，本研究的2個(gè)分離株與世界上其他不同地區(qū)的23個(gè)已知的PCV2分離株的基因組序列密切相關(guān)，各個(gè)核苷酸序列之間的同源率在95.4%～99.8%。本實(shí)驗(yàn)所測(cè)的兩病料全序列核苷酸同源率為99.4%。A、B株和國(guó)內(nèi)的毒株的同源性普遍較高均在 96%以上，它們都與加拿大的AF027217同源率最高(分別為99.8%和?99.5%?)；從總體上來(lái)說(shuō)兩個(gè)分離株與法國(guó)、部分加拿大的同源性普遍高于美國(guó)、瑞典、德國(guó)、荷蘭等國(guó)。本研究的2個(gè)分離株及其他己知的PCV2分離株之間的全基因組序列同源率見(jiàn)表1。從上述的比較來(lái)看在PCV2進(jìn)化上有著一定的地理位置上的差異，通過(guò)DNAstar分析生物學(xué)軟件所繪制的PCV2全基因組進(jìn)化樹(圖3)可以看出除北京和中國(guó)臺(tái)灣外中國(guó)大多分離株均在一個(gè)較大的分支上，其中本研究所分離的A株被單獨(dú)分支，B株則和一個(gè)江蘇分離株也獨(dú)立成為其中一個(gè)小分支；而另一個(gè)較大的分支則主要由美洲株組成，在這個(gè)分支上還有一個(gè)德國(guó)分離株和一個(gè)西班牙分離株，它們也都各自獨(dú)立分支；另外，還有一個(gè)江蘇分離株與其他地域的分離株差異較大而單獨(dú)成一支。?

　　3 討論  

　　資料表明，PCV2是PMWS的主要病因，本實(shí)驗(yàn)從江西豬PMWS可疑病料中成功擴(kuò)增到了PCV2片段并進(jìn)行了測(cè)序，進(jìn)一步證實(shí)了PCV2與PMWS的相關(guān)性，病料中是否還存在其他病原還需進(jìn)一步研究。


                                                                                                  

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[ 本帖最后由 kinki0396 于 2007-7-14 15:18 編輯 ]

vetxy

呵呵，原來(lái)你說(shuō)幾十年前是指PCV1。