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豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)是從豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post?weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)病豬中分離的豬圓環(huán)病毒,又稱PMWS相關(guān)PCV。一般由PCV-2單獨引起的疾病比較輕微,但常常由于并發(fā)或繼發(fā)細菌或病毒感染而使死亡率大大增加,病死率可達25%以上。PCV-2感染和引起的疾病已呈全球分布,已成為危害養(yǎng)豬生產(chǎn)的主要疾病之一。我國北京、上海、江蘇等地都已證實有該病毒的存在,PCV-2具有免疫抑制特性,PCV-2感染可以引起繼發(fā)性免疫缺陷,發(fā)病或感染豬至少有短暫的免疫抑制現(xiàn)象而不能激發(fā)對其他病原體的有效免疫應(yīng)答。豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)又稱豬皰疹病毒Ⅰ型,可引起家畜和某些野生動物的傳染病,其中對豬的危害最大,主要特征是發(fā)熱和腦脊髓炎,新生仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀,成年豬多為隱性感染,妊娠母豬表現(xiàn)為流產(chǎn)、死胎、木乃伊,尤其是以產(chǎn)死胎較為嚴重,目前已有40多個國家報道發(fā)生本病,每年給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的損失,PRV已在我國廣泛存在。目前,關(guān)于PCV-2和PRV病原學常規(guī)檢測方法常常存在特異性、敏感性差、操作技術(shù)復雜、費時費力等缺點。PCR方法具有快速、特異、敏感的特點,已廣泛用于許多病毒和細菌病的快速診斷,PCV -2和PRV的分子生物學方面的研究已取得了很大的進展。本試驗在結(jié)合流行病學、臨床癥狀、病理剖檢的基礎(chǔ)上,應(yīng)用PCR技術(shù)將桂林市和貴港市兩地送檢的病料,快速、準確地診斷為PCV-2和PRV的混合感染。?
1 材料與方法
1.1 病料處理 5月22日與8月10日,從廣西自治區(qū)桂林市和貴港市兩大規(guī)?;i場無菌采取發(fā)病豬的脾臟、淋巴結(jié)、腦,-20℃保存。?
1.2 主要試劑 SDS購自AMRESCO、Tris 飽和酚購自TBD.BIO;氯仿、無水乙醇購自上海;dNTPs、TaqDNA聚合酶購自MBI公司;DL2000 DNA Marker、蛋白酶K購自TaKaRa公司。?
1.3 引物合成 參考蘆銀華根據(jù)PCV-2全基因序列設(shè)計引物,C1:5′-?CCG CGG GCT GGC TGA ACT T-3′; C2:5′-ACC CCC GCC ACC GCT ACC-3′預期擴增的片段長度為1154 bp。參考中華人民共和國豬偽狂犬病診斷技術(shù)標準,引物序列為:PR1:5′-?CAG GAG GAC GAG CTG GGG CT-3′; PR2:5′-?GTC CAC GCC CCG CTT GAA GCT-3′,擴增豬偽狂犬病病毒基因中434~651堿基對(bp)之間217 bp片段。以上兩對引物均由大連寶生物公司合成。
1.4 病料中總DNA的抽提分別取病豬脾臟、淋巴結(jié)及腦,用研磨器充分研磨,用Hank's液1∶5稀釋,反復凍融3次以上,8 000 r/min離心10 min,取上清500 μl,加30 μl 10% SDS和10 μl 20 mg/ml蛋白酶K,50℃水浴搖床上放置2 h。加入等量的飽和酚,12 000 r/min離心?5 min?。取上清液,加入等量的酚∶氯仿(1∶1),渦旋20 s,12 000 r/min離心?5 min。取上清液,加入等量的氯仿,振蕩混勻,?12 000 r/min? 離心5 min。取上清液,加入2倍體積的無水乙醇和1/10上清液體積的3 M NaAc(pH?5.2?),使其混勻。-20℃放置60 min,12 000 r/min離心10 min,棄上清,用75%無水乙醇沖洗沉淀2次,晾干,加入20 μl雙蒸水溶解即為模板。?
1.5 PCV?2目的基因片段的擴增 PCR反應(yīng)體系:10×PCR buffer 5.0 μl,dNTP(2.5 m
mol/L) 4.0 μl,MgCl?2(25 mmol/L) 3.0 μl,上下游引物(25 pmol/μl)各1.0 μl,cDNA 5.0 μl,TaqDNA聚合酶(5 U/μl) 0.5 μl,加H?2O至50 μl。預變性94℃ 10 min進入循環(huán),94℃ 1 min,53℃ 1 min, 72℃ 1.5 min,35個循環(huán)后72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μl PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳,在凝膠成像系統(tǒng)上觀察目的片段。
1.6 PRV目的基因片段的擴增 PCR反應(yīng)體系:10×PCR buffer 2.5 μl,dNTPs(2.5 mmol/L)2.0 μl,MgCl?2(25 mmol/L) 2.0 μl,PR1和PR2(25 pmol/μl)各0.5 μL,cDNA 4.0 μl,0.25 μl TaqDNA聚合酶(5 U/μl),加H?2O至25 μl。預變性94℃ 3 min進入循環(huán),94℃ 1 min,65℃ 1 min,72℃ 1 min, 40個循環(huán)后72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μl PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳,在凝膠成像系統(tǒng)上觀察目的片段。
2 結(jié)果 ?
2.1 PCV-2的檢測結(jié)果應(yīng)用PCR技術(shù),利用合成的PCV?2特異性引物,從兩頭病豬的
脾、淋巴結(jié)混合病料中均擴增出長度為1 154 bp的特異目的基因片段,與陽性對照擴增的片段大小一致(圖1)。
圖1 PCV?2目的基因PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖
1.桂林病料;2.貴港病料;3.標準PCV?2;4.DL2000 DNA Marker
2.2 PRV的PCR檢測結(jié)果應(yīng)用PCR技術(shù),利用診斷PRV特異性引物,分別從病豬的腦組織中擴增出了長度約217 bp目的基因片段,與預期的結(jié)果一致,表明所檢測的病料為PRV陽性。PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖2)。
圖2 PRV目的基因PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖
1.桂林病料;2.貴港病料;3.標準PCV;4.DL2000 DNA Marker
3 討論 ?
3.1 近年來,關(guān)于PCV?2和PRV的診斷方法有病毒分離鑒定、ELISA以及IFA等常規(guī)技術(shù),隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展國內(nèi)外已經(jīng)建立了聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)診斷技術(shù),PCR技術(shù)用于診斷PCV?2和PRV具有:速度快、特異性強、敏感性高、穩(wěn)定性好等特點,大大的提高了這兩種病毒病的檢出率和準確性,另外PCR技術(shù)對于PCV?2和PRV的早期感染、潛伏期感染和持續(xù)性感染的診斷均具有重要的意義。?
3.2 根據(jù)流行病學、臨床癥狀、病理剖檢的初步診斷,應(yīng)用PCR技術(shù),從廣西桂林某規(guī)模
豬場的病料中同時擴增出PCV-2和PRV特異的目的基因片段,從而確診為PCV?2和PRV混合感染。目前,本實驗室已經(jīng)從廣西區(qū)的許多地市檢測并分離到PCV?2和PRV,而這次是從豬體內(nèi)同時檢測到PCV-2和PRV的混合感染,可見疾病的發(fā)展情況日趨復雜,在疾病的預防和診斷過程中應(yīng)引起重視。?
3.3 控制和消滅豬偽狂犬病所面臨的主要困難是偽狂犬病的潛伏感染問題,感染豬康復后往往會長期帶毒,且有散毒的危險,在機體受到體內(nèi)外因素的剌激時,病毒往往被活化,并由帶毒動物傳給其他動物,引起疾病暴發(fā)。所以要控制本病的發(fā)生,只有做好免疫接種,完善飼養(yǎng)管理,嚴格防止病毒傳入健康豬群,尤其是引進種豬時必須經(jīng)檢驗無病后才能引進。
3.4 根據(jù)近年來歐美各國在控制PMWS的經(jīng)驗表明,對PCV-2感染的特異性控制措施很難奏效,目前,還沒有有效的疫苗可以用來預防PCV-2的感染。因此,只有通過對豬群加強飼養(yǎng)管理,提高營養(yǎng)水平,降低應(yīng)激因素,完善用藥方案,防止繼發(fā)性感染,作好其他疾病的免疫接種等措施來預防和控制PCV-2的感染。?
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