精子分離性別控制技術(shù)的研究

牧童

  如何能很迅速地一次分離足夠正常人工授精的精子數(shù)目，而且不損及其精子活力和型態(tài)，更不影響其授精後的生育能力，此為往後分離精子必須改進(jìn)努力的目標(biāo)。

一、前    言

        各種動物因性別之不同而其生理解剖上亦有所差異，因此在飼養(yǎng)上和市場的價格上的經(jīng)濟(jì)收益差異也很大。在理論上動物公母之性比例約在 1：1，所以在自然狀況下之性比例也只有公母各半的機(jī)率。

        近二十年來有關(guān)動物性別的控制技術(shù)已有相當(dāng)程度的進(jìn)展，其中如利用體外授精，核移置和細(xì)胞融合技術(shù)之發(fā)展已可獲得正常懷孕和分娩仔豬的報告，因體外授精、核移置和細(xì)胞融合技術(shù)之發(fā)展則大量增加了胚胎的來源，則胚胎之性別控制上可應(yīng)用細(xì)胞學(xué)的方法或胚胎顯微分切來檢定性染色體，在胚胎分裂發(fā)育至適合於移置時給予性別鑒定始再行移置，但是，因使用染色體以檢定性別的檢出率低，檢定的時間長，往往也因胚胎難免受損而使移置後其受胎率降低。

        其他性別鑒定的方法如 H Y 抗原已證實(shí)可應(yīng)用在牛、綿羊和豬等家畜，使用此項(xiàng)技術(shù)在胚胎性別鑒定的準(zhǔn)確率分別為 77 88% 和 82 89%，正確性相當(dāng)高。此項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用在牛胚胎或單胎動物胚胎上有其實(shí)質(zhì)上的經(jīng)濟(jì)效果，但如應(yīng)用在豬胚胎，因其性別準(zhǔn)確率不如單胎動物，所以其經(jīng)濟(jì)效益上無法與單胎動物相抗衡。

        在性別控制技術(shù)上另一種方法是精子中具有 X 和 Y 染色體的分離。在人類和實(shí)驗(yàn)動物方面已有相當(dāng)程度的成功率，但是利用這些技術(shù)應(yīng)用在家畜的精子分離，則因參與的動物頭數(shù)不多或未能重復(fù)試驗(yàn)致使缺乏說服力。近幾年來使用精子來控制性別比較有理論根據(jù)的學(xué)者有美國農(nóng)業(yè)部的 Dr. Johnson 等人，( 1989；1991 )。他們以測定脫氧核甘酸 ( DNA ) 含量多寡的方法來判定其性別。其過程為將精子置入流動測定儀 ( Folw  Cytometer ) 分離含有 X 染色體和 Y 染色體的精子。并已將分離的兔和豬精子經(jīng)由輸卵管授精法獲得生產(chǎn)特定性別之動物，此方法也是迄今為止分離精子性別比較精準(zhǔn)的方法。

二、胚胎性別鑒定方法

        (1)細(xì)胞學(xué)鑒定方法

        此方法為抽取胚胎內(nèi)的細(xì)胞經(jīng)過適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)後在辨別 X 或 Y 染色體。因此方法抽取胚胎內(nèi)的細(xì)胞時有損及胚胎之存活，致使經(jīng)移置後其成功率很低。

        (2)性核染質(zhì) ( Sex   chromatin ) 性別鑒定方法

        從 5.75 天囊胚期胚胎抽取 200 ~ 300 個滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞 ( Strophectodermal  cells )，將細(xì)胞固定和染色後鑒定 Barr  body 的存在與否來判定其性別。用此方法鑒定性別有很高的精準(zhǔn)率，但是胚胎的存活率卻很低 ( 16.5% )。

        (3)後期胚胎組織切片性別鑒定

        將 12 ~ 14 天之孵化囊胚期胚胎抽取 0.5 mm2 之滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞，組織切片細(xì)胞給予適當(dāng)培養(yǎng)後，使用核型鑒定方法來判定其性別，經(jīng)移置其受胎率很低 ( 38% )。

        (4)早期胚胎組織切片性別鑒定方法

        將 6 ~ 8 天孵化前之胚胎抽取少許滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞組織切片，經(jīng)適當(dāng)培養(yǎng)後，再用核型鑒定方法來判定其性染色體。因此方法鑒定性別有 59% 的胚可以判定性別，但其分娩後仔畜性別之正確率僅 33%。

       (5)半切胚的方法鑒定性別

        將 6 ~ 7 天的胚胎分切成兩半，經(jīng)體外適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)後，使用核型鑒定方法來判定性染色體。以此方法鑒定性別有 60% 之半切胚可被鑒定性別。

        (6) X Linked 酵素的偵測方法

        以雌胚 比雄胚生產(chǎn)較多之 X Linked 酵素的特性來判別 X 或 Y 胚之方法。用此方法有 64% 之準(zhǔn)確率。

       (7)使用免疫之方法選擇胚之性別 ( H Y  antigen )

        H Y 抗原為雄胚特有之蛋白質(zhì)，經(jīng)螢光染色後可以進(jìn)行性別鑒定。由於方法不需要抽離細(xì)胞，而且在螢光照射下的時間也很短 ( 無傷害 )，經(jīng)移置後其受胎率不受影響。此方法鑒定性別可達(dá) 80% 的準(zhǔn)確率。

       (8) Y 染色體特別基因探針

        利用雄性特有之 Y 染色體基因探針可檢測出 57% 之細(xì)胞組織，其性別檢測的準(zhǔn)確率可高達(dá) 95%。因此方法必須抽取細(xì)胞檢測，胚受損率高，致使影響移置後的受胎率很大。近年來國外正嘗試?yán)?Polymeric  Chain  Reaction ( PRC ) 技術(shù)企圖盡量減低對胚胎的傷害程度以便提高移置的受胎率。但此方法必須與儀器配合，故想見其花費(fèi)的費(fèi)用極為昂貴。

三、精子性別鑒定方法

        (1)牛血清白蛋白 ( BSA ) 液相分層分離法

        因人類 X 和 Y 精子的大小和比重上有差異，所以經(jīng)此方法可以分離試驗(yàn)動物和人類 X 和 Y 精子。1982 年 Beernnink  and  Ericsson 曾經(jīng)使用此技術(shù)成功地分離人 X 和 Y 精子。但是利用此技術(shù)分離牛的 X 和 Y 精子，并將分離之精子給予授精、分娩，出生之仔畜性別則無明顯的差異。

        (2)免疫方法

        利用雄性動物細(xì)胞表面持有特別之蛋白質(zhì) ( H Y 抗原 )。并以免疫之方法生產(chǎn) H Y 抗體血清，在配合螢光染色技術(shù)可以辨別 X 和 Y 精子。利用此技術(shù)分離鼠和兔子 X 和 Y 精子則可獲得相當(dāng)程度的性別改變 ( 母鼠 54.6%；母兔 63% )。

       (3) Flow  Cytometric 儀分離方法

        利用 Flow  Cytometric 儀測定哺乳動物精子 DNA 含量已有報告 ( Garner  et  al.,  1983 ; Johnson  et  al.,  1985 ; Johnson  et  al.,  1987 )。而且 Pinkel  et  al.,  1982 年亦曾發(fā)現(xiàn) X 精子 DNA 含量多過 Y 精子 4%。

        在早期使用 Flow   Cytometric 儀分離 X 和 Y 精子前必須將精子的尾巴細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜棄掉，所以分離出來的 X 和 Y 精子是死的，以致無法作為授精之用。但是近兩年來美國農(nóng)業(yè)部生理專家強(qiáng)生博士等研究人員已可將已經(jīng)分離而且有活力的活精子使用輸卵管授精法給予授精母兔和母豬，并成功生產(chǎn)活的仔畜 ( 表 1、2 )。

表 1   兔子預(yù)選 X 和 Y 精子以及經(jīng)由輸卵管授精仔兔之性比例
精 子 處 理 別	頭            數(shù)		出 生 仔 兔 頭 數(shù) 和 百 分 率
	授 精 數(shù)	分 娩 數(shù)	預(yù)             選		生            產(chǎn)
			公 (%)	母 (%)	公 (%)	母 (%)
Y 精子 X 精子 混合 X 和 Y 精子<--mstheme-->	16 14 17	5 3 5	81 14 50	19 86 50	17 (81) 1 (6) 6 (43)	4 (19) 15 (94) 8 (57)
合            計(jì)	47	13	---	---	24 (47)	27 (53)
資料來源：Johnson  et  al.,  1989.   Biology  of  Reproduction  41：199-203   * ：每邊輸卵管注入 3×105 之精子

表 2  預(yù)選豬 X 和 Y 精子以及經(jīng)由輸卵管授精後仔豬之性比例
精 子 處 理 別	授精頭數(shù)／ 分 娩 頭 數(shù)	仔 豬 生 產(chǎn) 頭 數(shù)	平均每窩 產(chǎn)仔頭數(shù)
				預(yù)     選		生    產(chǎn)
				公 (%)	母 (%)	公 (%)	母 (%)

Y 精子      X 精子     不分離 染色     不分離 不染色	8／4 10／5 11／5 7／5	37 34 40 46	9.3 6.8 8.0 9.2	77 20 50 50	23 80 50 50	68 26 43 52	32 74 57 48
資料來源：Johnson  et  al.,  1989.    Biology  of   Reproduction  41：199 - 203        *：每邊輸卵管注入 3×105 之精子

　

四、結(jié)    語

        動物子代性別的控制，迄今仍為生殖生理學(xué)家和動物研究人員欲努力的目標(biāo)。雖然有眾多報告宣稱已獲得了某種程度的成功。甚至於申請過專利 ( 人 )。但據(jù)了解迄今在動物方面仍然沒有一種可隨心所欲或一致的方法先預(yù)知出生前的性別。

        因出生前能預(yù)先知道動物性別有下列的好處：(1)可以加速遺傳改進(jìn)。(2)提高生產(chǎn)效益和增加經(jīng)濟(jì)效益。(3)畜群飼養(yǎng)管理簡易。在前述的胚胎性別鑒定方法中，雖然有數(shù)種方法可預(yù)先測定胚胎之性別，而且其精確度也很高，但是，因其胚胎經(jīng)抽取細(xì)胞或分切，使胚胎的存活率降低，經(jīng)移置後也影響其受胎率，花費(fèi)的成本極高。所以此技術(shù)也只限於非外科取胚選胚的單胎動物。

        近幾年來發(fā)展分離 X 和 Y 精子技術(shù)已近成熟階段尤其利用 Flow  Cytometric 儀分離經(jīng)去尾和細(xì)胞膜的 X 和 Y 精子成功以後。迄 1989；1991 年美國農(nóng)業(yè)部動物生理學(xué)家強(qiáng)生博士更利用 Flow  Cytometric 儀分離仍有活力的精子，而且將分離仍有活力的 X 和 Y 精子經(jīng)由母體輸卵管授精成功地產(chǎn)下 94% 母仔兔和 81% 公仔兔以及 74% 母仔豬和 68% 公仔豬。

        雖然利用 Flow   Cytometric 儀可分離 X 和 Y 精子，因在分離之過程中損傷精子程度極高，分離的速度也嫌太慢，尤其對多胎動物需眾多數(shù)目的精子來授精仍嫌不足。所以如何能很迅速地一次分離足夠正常人工授精的精子數(shù)目，而且不損及其精子活力和型態(tài)，更不影響其授精後的生育能力，此為往後分離精子必須改進(jìn)努力的目標(biāo)。

文章來源：福建種豬信息網(wǎng)

bnduandm

EB+P4+陰道栓對荷斯坦青年牛超數(shù)排卵效果的影響

摘要：采用苯甲酸鈉雌二醇(estradiol benzoate, EB)+孕激素(progesterone, P4)+陰道栓方法對荷斯坦青年牛進(jìn)行人為誘導(dǎo)卵泡波處理，比較不同劑量的P4和不同陰道栓誘導(dǎo)新的卵泡波的發(fā)生，以及對同期發(fā)情效果和超排效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，海棉栓組PGF2α處理后到奶牛發(fā)情的時間間隔為48.3h，孕酮緩釋陰道栓組為39h，兩組差異極顯著（P<0.05）；海棉栓組的頭均獲胚數(shù)顯著高于孕酮緩釋陰道栓組（13.2：8.7枚，P<0.05），頭均可用胚數(shù)顯著高于孕酮緩釋陰道栓組(5.7：3.3枚，P<0.05)；外源注射50和100 mgP4都能夠成功地誘導(dǎo)新的卵泡波的發(fā)生，在同期發(fā)情效果和超排效果上沒有顯著差異( P>0.05 )。
關(guān)鍵詞：EB；P4；陰道栓；超數(shù)排卵
引言：
利用奶牛卵泡波的原理，采用物理或化學(xué)方法對供體奶牛的卵泡波進(jìn)行同期化處理，可以提高奶牛的同期發(fā)情和超數(shù)排卵效果。Lammoglia et al（1998）報道，使用雌激素+孕激素+陰道栓有效地促進(jìn)新的卵泡波的發(fā)生，提高排卵前的LH峰值，從而提高同期發(fā)情效果和超排效果。Martinez et al.（2000）使用EB+P4+CIDR（新西蘭）取得較好的同期發(fā)情效果和較高的妊娠率；Martinez et al.（2001）使用EB+P4誘導(dǎo)新的卵泡波的發(fā)生，取得較好的同期發(fā)情效果。Gabriel et al (2006) 報道了使用DIB(阿根廷生產(chǎn)的陰道栓)陰道栓+2.5mgEB+50mgP4進(jìn)行同期發(fā)情處理,使用Folltropin-V 進(jìn)行超排處理，取得較好的超排效果。
目前，國內(nèi)奶牛的同期發(fā)情和超排處理主要使用海棉陰道栓，由于該陰道栓埋置后容易與陰道發(fā)生黏連，陰道壁的刺激性比國外生產(chǎn)的CIDR、DIB強(qiáng)一些，容易阻塞陰道分泌物的排出，造成陰道內(nèi)較多的炎性分泌物，引起奶牛超排過程中的損傷，影響超排效果。因此，本研究比較不同的陰道栓和不同的孕激素劑量對奶牛同期發(fā)情和超數(shù)排卵效果的影響，從而進(jìn)一步提高奶牛的超排效果。

1.材料和方法
1.1實(shí)驗(yàn)材料
1.1.1實(shí)驗(yàn)動物
供體牛選用北京奶牛中心良種場飼養(yǎng)的體質(zhì)健康、性周期正常、無生殖疾患，具有優(yōu)良高產(chǎn)基因的71頭13～15月齡荷斯坦青年母牛用于實(shí)驗(yàn)。
1.1.2器械和主要藥品
開膣器，輸精槍，外套膜，外套管，三通管，沖卵管(日本鈴木式)、集卵杯(日本)、體視顯微鏡等沖胚、檢胚器材。
促卵泡素（FSH），加拿大產(chǎn)Folltropin-V，規(guī)格：20mg/mL，生產(chǎn)批號：DIN 00867357；前列腺素（PGF2α），上海計(jì)劃生育研究所生產(chǎn)的氯前列烯醇，規(guī)格：0.2mg/支，生產(chǎn)批號：040428；雌激素，南京動物激素廠生產(chǎn)的苯甲酸鈉雌二醇（EB），4mg/支，生產(chǎn)批號：030102；孕激素（P4），南京動物激素廠生產(chǎn)的黃體酮， 50mg/支，生產(chǎn)批號：040621；陰道海綿栓由浙江臺州東牧動物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：031225；孕酮緩釋陰道栓由上海計(jì)劃生育研究所生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：20050905；沖卵液、胚胎保存液及冷凍液由本實(shí)驗(yàn)室配制。
1.2方法
1.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
實(shí)驗(yàn)于2005年11月份在北京奶牛中心良種場進(jìn)行，分為兩種不同的陰道栓埋植組（海綿栓/ 孕酮緩釋陰道栓）和兩種不同濃度的孕激素處理組（50 mg/100 mg）,采用陰道栓埋植方法進(jìn)行人為誘導(dǎo)新的卵泡波超排處理。
1.2.2超排處理
在青年奶牛發(fā)情周期的任意一天（發(fā)情當(dāng)天除外），進(jìn)行陰道栓埋植（海綿栓組和孕酮緩釋陰道栓組）處理，并肌肉注射EB（2mg），P4（100 mg/50 mg）。放栓當(dāng)天為0 d，第4 d開始超排處理，采用加拿大進(jìn)口Folltropin-V，遞減法連續(xù)4d肌肉注射FSH 320 mg；超排處理的第3 d上午肌肉注射氯前列烯醇2支(0.4 mg),下午撤出陰道栓。
1.2.3發(fā)情觀察、輸精和采卵
在注射PGF2α 后36 h開始觀察發(fā)情，每4 h觀察一次發(fā)情，每次觀察30 min。以供體母牛接受爬跨并站立不動為發(fā)情判定標(biāo)準(zhǔn)，另外伴隨母牛全身出汗等特征，做好發(fā)情開始和發(fā)情持續(xù)期的記錄。于供體牛發(fā)情后8~12 h進(jìn)行第一次輸精，間隔12 h第2次輸精。7 d后應(yīng)用非手術(shù)法回收胚胎。對回收的胚胎進(jìn)行鏡檢，質(zhì)量鑒定并分級，合格的A、B級胚胎冷凍保存。統(tǒng)計(jì)回收胚胎的總數(shù)、可用胚胎數(shù)、變性胚胎數(shù)和未受精卵數(shù)。
1.3統(tǒng)計(jì)分析
試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel生物統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，PGF2α處理后的發(fā)情時間間隔對比，頭均獲胚數(shù)，頭均可用胚數(shù)等顯著性檢驗(yàn)均采用t-檢驗(yàn)。

2.結(jié)果和分析
2.1不同陰道栓和P4對同期發(fā)情效果的影響
由表1看出，試驗(yàn)組中的71頭荷斯坦青年奶牛在PGF2α處理后全部表現(xiàn)發(fā)情，發(fā)情率達(dá)到100%，這說明應(yīng)用陰道栓+PGF2α方法誘導(dǎo)奶牛同期發(fā)情可以使超排牛同期發(fā)情率達(dá)到100%。不同的試驗(yàn)組奶牛的發(fā)情開始時間和持續(xù)時間存在顯著差異（P<0.05）：海綿栓組在PGF2α處理后48.3 h左右開始表現(xiàn)發(fā)情，且發(fā)情集中程度較高；孕酮緩釋陰道栓組在PGF2α處理后39 h左右表現(xiàn)發(fā)情，發(fā)情相對集中(圖1)。但是，每個試驗(yàn)組中不同濃度的P4處理對發(fā)情開始時間和持續(xù)時間并沒有顯著影響（P>0.05）。





表1 兩種陰道栓的同期發(fā)情效果
table 1 the effect of estrus synchronization between two vaginal-bolt
項(xiàng) 目 the item        組別 group        孕激素劑量 doses of progesterone(P4,mg)        平均值 average
                50        100       
奶牛頭數(shù) cattle number        BI        20        16        —
        PRD        19        19        —
發(fā)情率 estrus rate (%)        BI        100        100        100
        PRD        100        100        100
發(fā)情時間c  estrus time (h)        BI        47.9a        48.9a        48.3
        PRD        38.2b        39.8b        39.0
注：a ,b 不同表示不同組間差異顯著，P<0.05;c表示PGF2α處理后到奶牛發(fā)情的時間間隔，BI表示海棉栓組，PRD表示緩釋陰道拴組。note: different letters(a and b) within a row mean a significant difference for animals(P<0.05)；c means intervals from PGF2α  treatment to estrus(h) ,BI stands for the group of  sponge blot(BI), PRD stands for the group of progestin release device (PRD)










圖1 PG處理后的發(fā)情時間和發(fā)情率
fig.1 the time and rate of oestrus after PGF2α treatment
注：A，50 mgP4海綿栓組；B，100 mgP4海綿栓組；C，50 mgP4孕酮緩釋陰道栓組；D，100 mgP4孕酮緩釋陰道栓組, a ,b 不同表示不同組間差異顯著，P<0.05。note: A, the sponge blot group of 50 mgP4; B, the sponge blot group of 100 mgP4;
C, the progestin release device group of 50 mgP4; D, the progestin release device group of 100 mgP4

發(fā)情同期性與陰道栓孕酮釋放穩(wěn)定性有關(guān)，穩(wěn)定性越好，發(fā)情同期性越高。對比兩種不同陰道栓的發(fā)情效果，說明兩種陰道栓的孕酮釋放相對穩(wěn)定，發(fā)情同期性高。但是，孕酮緩釋陰道栓組比海綿栓組提前發(fā)情10h左右，這可能是由于孕酮緩釋陰道栓釋放孕酮含量低，造成撤拴后孕激素濃度提前降低到基準(zhǔn)水平，卵泡迅速生長，并比海棉栓組提前達(dá)到排卵卵泡，雌激素濃度迅速上升，從而提前發(fā)情。
Taft et al (1996) 報道，孕激素在行使功能時候，通過直接途徑（作用于卵巢，芳香化酶作用）和間接途徑（作用于LH）來實(shí)現(xiàn)。超排期間，應(yīng)用陰道栓來人為提高奶牛血漿中孕激素水平，從而抑制優(yōu)勢卵泡的發(fā)育，解除優(yōu)勢卵泡對從屬卵泡的抑制作用，使更多卵泡發(fā)育為優(yōu)勢卵泡。但是，處理時不同的孕激素濃度會導(dǎo)致不同的同期發(fā)情效果，Richardson et al (2002) 用三種不同的方法進(jìn)行同期發(fā)情（P4+PGF2α組，GnRH+PGF2α組，GnRH+P4+PGF2α組），結(jié)果GnRH+PGF2α組最先發(fā)情，提前12h左右。該試驗(yàn)通過比較發(fā)情前期不同孕激素水平得出，孕激素處理組在撤拴當(dāng)天血漿中的孕激素濃度要高于對照組，而雌激素濃度要低于對照組。較小卵泡的奶牛從撤拴到發(fā)情開始的間隔時間要長于有較大卵泡的奶牛。卵泡生長速率與LH峰頻率有關(guān)，當(dāng)孕激素濃度處于低水平時，LH峰頻率加強(qiáng)，卵泡就有較高的生長速率。Utt et al (2003) 報道，第一個卵泡波卵泡的生長速率快于第二個優(yōu)勢卵泡波，主要是因?yàn)榈谝粋€卵泡波的孕激素濃度低的原因，第一個卵泡波處于早期黃體期間，而第二個卵泡波處于中期黃體期間。本試驗(yàn)中，由于國產(chǎn)孕酮緩釋裝置釋放孕酮含量低，造成撤拴后孕激素濃度提前降低到基準(zhǔn)水平，卵泡迅速生長，并比對照組提前達(dá)到排卵卵泡，雌激素濃度迅速上升，從而提前發(fā)情。
2.2不同陰道栓和不同的P4劑量對超排效果的影響

表2 兩種陰道栓的超排結(jié)果
table 2 the superovulatory results of the two vaginal-bolt
項(xiàng) 目the item        組別 group        孕激素劑量 doses of progesterone(P4,mg)        平均值 average
                50        100       
奶牛頭數(shù) cattle number        BI        20        15        —
        PRD        19        17        —
獲胚數(shù) embryo number        BI        272        189        —
        PRD        167        146        —
胚/ 頭 average embryo number        BI        13.6a        12.6a        13.2a
        PRD        8.8b        8.6b        8.7b
受 精 卵 / 頭average fertilized embryo        BI        11.4a        10.1a        10.8a
        PRD        4.5b        4.9b        4.7b
可 用 胚 / 頭average useable embryos        BI        5.6a        5.9a        5.7a
        PRD        3.4b        3.1b        3.3b
注：a ,b 不同表示不同組間差異顯著，P<0.05;BI表示海棉栓組，PRD表示緩釋陰道拴組。note: different letters(a and b) within a row mean a significant difference for animals；BI stands for the group of  sponge blot(BI), PRD stands for the group of progestin release device (PRD)

由表2可看出，海綿栓組（50mgP4/100mgP4）和孕酮緩釋陰道栓組（50mgP4/100mgP4）頭均獲胚數(shù)分別為13.6、12.6、8.8和8.6枚，每個實(shí)驗(yàn)組中不同孕激素水平的頭均獲胚數(shù)沒有顯著差別（P>0.05），兩個實(shí)驗(yàn)組之間的差異極顯著（13.2：8.7枚，P<0.05）。海綿栓組（50mgP4/100mgP4）和孕酮緩釋陰道栓組（50mgP4/100mgP4）頭均受精卵數(shù)分別為11.4、10.1、4.5和4.9枚，每個試驗(yàn)組中不同孕激素水平的頭均受精卵數(shù)沒有顯著差別（P>0.05），兩個實(shí)驗(yàn)組之間的差異極顯著（10.8：4.7枚，P<0.05）。同樣，海綿栓組（50mgP4/100mgP4）和孕酮緩釋陰道栓組（50mgP4/100mgP4）的頭均可用胚數(shù)分別為5.6、5.9、3.4和3.1枚，每個試驗(yàn)組中不同孕激素水平的頭均可用胚數(shù)沒有顯著差別（P>0.05），兩個實(shí)驗(yàn)組之間的差異極顯著（5.7：3.3枚，P<0.05）。   
應(yīng)用國產(chǎn)海綿栓組的超排效果明顯高于國產(chǎn)孕酮緩釋陰道栓組，孕酮緩釋陰道栓組的超排結(jié)果在獲胚數(shù)，頭均受精卵數(shù)和頭均可用胚數(shù)上要顯著低于國產(chǎn)海綿栓組（P<0.05），這主要與國產(chǎn)孕酮陰道栓的孕激素釋放量有關(guān)。由于孕酮緩釋陰道栓的孕激素釋放量較小，使得供體奶牛的體內(nèi)孕激素水平較低，不能抑制優(yōu)勢卵泡的生長，優(yōu)勢卵泡的生長產(chǎn)生大量雌激素，導(dǎo)致奶牛提前發(fā)情；并且，優(yōu)勢卵泡的生長抑制了其它從屬卵泡的生長，使得從屬卵泡不能充分發(fā)育，在發(fā)情后不能排卵，從而減少了頭均獲胚數(shù)和頭均可用胚數(shù)。
Savio et al.(1993)報道，持久卵泡的出現(xiàn)會降低受精率，持久卵泡會導(dǎo)致早期胚胎發(fā)育畸形率提高和無精卵的出現(xiàn)。持久卵泡的出現(xiàn)可以改變卵泡中雌激素水平，使其濃度升高，這樣就改變了卵子的成熟和輸卵管功能，從而降低超排效果。Austin et al (1999) 研究發(fā)現(xiàn)，在撤拴時雌激素水平高的提前發(fā)情。優(yōu)勢卵泡持續(xù)期越長，雌激素水平越高，越容易提前發(fā)情。但是，當(dāng)優(yōu)勢卵泡持續(xù)期2-4天時，發(fā)情不同步，不能達(dá)到一個很好的發(fā)情效果。高水平的外源孕激素可以減少持久卵泡的發(fā)生和降低雌激素的分泌水平。Wehrman et al (1993) 研究表明，持久卵泡的出現(xiàn)可以使青年牛提前發(fā)情10h左右。本試驗(yàn)中，由于國產(chǎn)孕酮緩釋裝置釋放孕酮含量較低，不能充分抑制優(yōu)勢卵泡的生長，產(chǎn)生持久卵泡，使得優(yōu)勢卵泡分泌大量的雌激素，抑制其它從屬卵泡的生長，同時提前發(fā)情，導(dǎo)致其它從屬卵泡的生長時間較短，不能達(dá)到排卵卵泡，降低了超排的頭均獲胚數(shù)，頭均受精卵數(shù)和頭均可用胚數(shù)，影響了超排效果。
苯甲酸鈉雌二醇（EB）和孕激素（P4）的聯(lián)合使用可以誘導(dǎo)奶牛新的卵泡波的出現(xiàn)，這在大量研究中都有報道。Caccia and B6 (1998) 報道，使用2.5mgEB+50mgP4+CIDR可以在3-4天內(nèi)成功誘導(dǎo)新的卵泡波的發(fā)生， B6 et al (2002) 使用2.5mgEB+50mgP4成功地對奶牛進(jìn)行超排，超排效果與傳統(tǒng)的8-12天自然發(fā)情后進(jìn)行超排的效果沒有顯著差異。Mapletoft et al. (1999) 使用5mgE-17β+100mgP4對奶牛進(jìn)行超排并取得理想的超排效果。本試驗(yàn)采用兩種不同孕激素水平（50mg，100mg）來誘導(dǎo)新的卵泡波。本實(shí)驗(yàn)中，兩種孕激素水平對超排牛的同期發(fā)情效果和超排效果都沒有顯著差異（P<0.05），這說明50mg的孕酮肌肉注射和苯甲酸鈉雌二醇（EB）聯(lián)合使用就可以成功誘導(dǎo)新的卵泡波的發(fā)生，達(dá)到較好的超排效果。

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Effect of EB+P4+Vaginal-bolt on Superovulation of Holstein Heifers
Duan Bao-ning1,2 , Xue Jian-hua3, Zhang Xin-hui3,Wu Sheng-quan3, Sun Feng-jun3, Sang Run-zi1,2
1. Animal Science and Technology College of the Agriculture University of Hebei.2.The Research Centre of Cattle and Sheep Embryonic Technique of Hebei, Baoding of Hebei,071001.3.The embryo department of Beijing Dairy Cattle Center.
Abstract: The Follicular wave of Holstein heifers was induced by estradiol benzoate (EB), progesterone (P4) and vaginal-bolt in order to study the effect of P4 with different doses and different types of vaginal-bolt on inducing of new follicular wave, estrus synchronization and superovulatory results. The results showed that the interval of the sponge blot (BI) group from PGF2α treatment to estrus was 48.3h, and that of the progestin release device (PRD) group was 39h, there were significant differences between the two groups (P>0.05). The average number of obtained embryo for BI group (13.2) was significantly higher than that (8.7) of PRD group (P < 0.05), and the average number of useable embryo of BI group (5.7) was also significantly higher than that (3.3) of PRD group (P < 0.05). The P4 injection dosage of 50 and 100 mg could induce new follicular wave efficiently, and there was no significant difference on estrus synchronization and superovulatory results between the BI and PRD groups (P > 0.05).
Key word: EB; P4; vaginal-bolt; Superovulation

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