準(zhǔn)確測(cè)定和表征β-葡聚糖酶活的方法與比較

jancie_wuhan

準(zhǔn)確測(cè)定和表征β-葡聚糖酶活的方法與比較
1. β-葡聚糖酶的應(yīng)用及作用機(jī)理
β-葡聚糖作為植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)性非淀粉多糖，廣泛存在于燕麥、大麥、黑麥、小麥等麥類作物中。如圖1 所示，常見麥類作物中，燕麥和大麥β-葡聚糖含量較高，其中燕麥含量最高(Choct M andAnnison G.,1990)。在飼料、啤酒等行業(yè)中，由于β-葡聚糖是限制麥類有效利用的主要因素，常使用β-葡聚糖酶來有效分解麥類植物胚乳細(xì)胞壁中的β－葡聚糖，以降低飼料中非淀粉多糖（Non-Starch Polysaccharide,NSP）及其抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量；降低啤酒釀造中麥汁黏度，提高麥芽溶出率，穩(wěn)定啤酒質(zhì)量。

圖1 常見麥類作物中β-葡聚糖含量
   
β-葡聚糖酶是具有β-(1→3)、(1→4)糖苷酶活性的專一性內(nèi)切酶。圖2示出β-葡聚糖的基本結(jié)構(gòu)以及酶切作用的機(jī)理。其中，每個(gè)實(shí)心圓表示一個(gè)葡萄糖分子，實(shí)心圓之間連線表示糖苷鍵，箭頭所示為酶切位點(diǎn)。從圖中可以看到，葡萄糖分子之間通過β-(1→4)糖苷鍵形成結(jié)構(gòu)單體(monomer)：包括纖維三糖(cello-trisaccharide)、纖維四糖(cello-tetrasaccharide)和極少量的低聚糖(cello-oligosaccharide)，同時(shí)結(jié)構(gòu)單體之間通過β-(1→3)糖苷鍵連接從而形成β-葡聚糖線性結(jié)構(gòu)。當(dāng)β-葡聚糖酶作用于β-葡聚糖的β-(1→3)、β- (1→4)糖苷鍵時(shí)，可使糖苷鍵斷裂，將其降解成寡糖和單糖。

圖2 β-葡聚糖分子結(jié)構(gòu)圖和酶切位點(diǎn)示意圖

2. 測(cè)定β-葡聚糖酶活性的標(biāo)準(zhǔn)方法
  β－葡聚糖酶活的測(cè)定方法主要有3種，即還原糖測(cè)定法（分光光度法）、粘度測(cè)定法和底物染色法。其中還原糖測(cè)定法（分光光度法）簡便實(shí)用，比較準(zhǔn)確，而且測(cè)定的結(jié)果重復(fù)性好，對(duì)于β－葡聚糖酶活的測(cè)定，一般認(rèn)為是其3種方法中的首選方法；粘度測(cè)定法雖然更接近酶和底物在動(dòng)物體內(nèi)的作用方式，但這種方法目前僅能進(jìn)行半定量描述，而且測(cè)定時(shí)比較繁瑣費(fèi)時(shí)；底物染色法是一種新型的方法，它是通過對(duì)底物的人工著色，然后測(cè)定顏色的變化來計(jì)算酶活，但這種方法難以操作，目前還沒有得到廣泛應(yīng)用（王在貴等，2002）。
   目前國內(nèi)外采用較多的還是還原糖測(cè)定法（分光光度法），其原理是：β-葡聚糖酶能將β-葡聚糖降解成寡糖和單糖，具有還原性末端的寡糖和有還原基團(tuán)的單糖在沸水浴條件下可以與DNS試劑發(fā)生顯色反應(yīng)。由于反應(yīng)液顏色的強(qiáng)度與酶解產(chǎn)生的還原糖量成正比,而還原糖的生成量又與反應(yīng)液中β－葡聚糖酶的活力成正比，因此，可以通過分光比色測(cè)定反應(yīng)液顏色的強(qiáng)度，從而計(jì)算反應(yīng)液中β－葡聚糖酶的活力（農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)，NY/T 911-2004）。
3. β-葡聚糖底物的選擇對(duì)β-葡聚糖酶活測(cè)定的影響
雖然各類作物中β－葡聚糖的含量不同，但分子結(jié)構(gòu)都是相似的，即葡萄糖以β-(1→3)和β-(1→4)鍵相連的線性聚合物，不同點(diǎn)僅僅在于主要結(jié)構(gòu)單體的纖維三糖和纖維四糖的比例不同，即β-(1→3)和β-(1→4)兩種糖苷鍵的比例不同 (Susan M et al.,2004)。那么，選用不同作物來源的β-葡聚糖作底物對(duì)酶活測(cè)定有沒有影響呢？
從酶的作用機(jī)理來看，β-葡聚糖酶的酶切作用只對(duì)糖苷鍵的鍵型有選擇性，即專一性針對(duì)β-(1→3)和β-(1→4)鍵，而對(duì)糖苷鍵的比例沒有選擇性。
另外，根據(jù)β－葡聚糖酶活單位的國際定義：在pH5.0、40℃條件下，每分鐘從β－葡聚糖底物溶液中降解釋放1μmol還原糖（表示為還原糖當(dāng)量）所需要的酶量為一個(gè)酶活單位，簡稱為U，我們可以看到，國際定義中是通過測(cè)定由酶分解底物產(chǎn)生小分子還原糖的量還原糖當(dāng)量來計(jì)算樣品酶活的。因此，不管這種β-葡聚糖來源于哪一種麥類作物，只要底物越純、低聚合度小分子糖類含量越少，即能準(zhǔn)確的表征β-葡聚糖酶活（王在貴等，2002）。
4. 百特純（Putus Macromolecular Sci & Tech Ltd.）生產(chǎn)的β-葡聚糖的特點(diǎn)以及在酶活測(cè)定的應(yīng)用。
有些科研單位和生產(chǎn)企業(yè)為了節(jié)省經(jīng)費(fèi)，采用自制的β－Glucan（大麥提?。┳鞯孜铮m然效果也還好，但不宜作為最終產(chǎn)品的驗(yàn)證試劑。目前國內(nèi)外能提供β-葡聚糖純品的公司較少，僅有的幾種產(chǎn)品售價(jià)偏高，例如Sigma、Merck公司的大麥β-葡聚糖平均售價(jià)在3500-4000元/g左右，無疑增加了β-葡聚糖酶產(chǎn)品成本，限制了其廣泛應(yīng)用。
百特純大分子科技有限公司（Putus Macromolecular Sci.&Tech..Ltd）是主要從事碳水化合物大分子領(lǐng)域新品研發(fā)及應(yīng)用的國際公司，制造并提供高質(zhì)量、高純度、高均一性的具有特定分子量和支化度的碳水化合物大分子標(biāo)準(zhǔn)品及其相關(guān)產(chǎn)品。公司采用β-葡聚糖含量最高的燕麥作為原料，提供的燕麥β-葡聚糖純品（PS-OBG）純度高達(dá)97%以上，并且擁有高、中、低三種不同規(guī)格分子量，不含淀粉、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，水溶性好，穩(wěn)定性高，是作為β-葡聚糖酶活測(cè)定的良好底物，而且價(jià)格在市場(chǎng)上具有較強(qiáng)的競爭優(yōu)勢(shì)。
百特純大分子（武漢）科技有限公司
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參考文獻(xiàn)：
1、Choct M., Annison G. Anti-nutritive activity of wheat pentosans inbroiler diets [J]. British Poultry Science, 1990, 31:811-822.
2、SusanM., Yolanda B., Peter J., Wang Q., John W. Evaluation of Structure inthe formation of gels by structurally diverse (1→3)(1→4)-β-D-glucansfrom four cereal and one lichen species[J]. Carbohydrate Polymers,2004, 57:249-259
3、王在貴,何瑞國,張宏福.飼用β－葡聚糖酶活力測(cè)定需注意的幾個(gè)問題[J].飼料廣角, 2002,(08)
4、農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)：農(nóng)業(yè)部2006105172955906, «飼料添加劑», β一葡聚糖酶活力的測(cè)定, 分光光度法, Determinationof β-glucanase activity in feed additives —Spetrothoetric method,2005-01-04 發(fā)布, 2005-02-01 實(shí)施

[ 本帖最后由 jancie_wuhan 于 2007-10-30 17:00 編輯 ]

southmigrant

Sigma不是有一種Dextran的葡聚糖嗎？也還比較便宜，能作為底物嗎？

jancie_wuhan

你說的Dextran跟β－葡聚糖的結(jié)構(gòu)是不同的，它是一種葡萄糖以α（1-6）為主鏈，α（1-3）或α（1-4）、α（1-2）為支鏈相連接的多聚糖，而β－葡聚糖是葡萄糖以β-(1→3)和β-(1→4)鍵相連的線性聚合物。由于β－葡聚糖酶是具有β-(1→3)、(1→4)糖苷酶活性的專一性內(nèi)切酶，所以在測(cè)定酶活時(shí)，底物應(yīng)該選擇相應(yīng)的β－葡聚糖。