超微粉碎對黃連解毒湯中黃芩苷溶出的影響

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超微粉碎對黃連解毒湯中黃芩苷溶出的影響 黃一帆  李富文  馬玉芳 （福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002）

摘要：應(yīng)用HPLC法測定比較了普通粉碎和超微粉碎對黃連解毒湯中黃芩苷溶出量的影響。采用Nova-PakC18色譜柱(3.9mm×150mm)，以甲醇-重蒸水-磷酸（47：53：0.2 ）為流動相，流速1ml·min-1， UV檢測波長為280nm。結(jié)果表明，超微粉碎可增加黃芩苷的溶出，在超聲提取下超微細(xì)粉中黃芩苷含量比細(xì)粉提高32.51%；而在簡化提取(開水沖攪)下，超微細(xì)粉中黃芩苷含量比細(xì)粉提高51.23%。超微粉碎未改變黃連解毒湯固有的藥效學(xué)成分，可提高黃連解毒湯中黃芩苷溶出量。 關(guān)鍵詞：黃連解毒湯；超微粉碎；HPLC；黃芩苷 中圖分類號：S853.73+2 中藥屬于天然產(chǎn)物，與抗生素、化學(xué)合成藥物和激素類藥物相比，具有毒副作用小、不易殘留、不污染環(huán)境、不易產(chǎn)生抗藥性等特點，而且療效肯定、加工方便。所以應(yīng)用中藥制劑來解決長期困擾畜牧業(yè)發(fā)展的藥物殘留問題無疑是一條很好的途徑。就目前而言，中藥制劑產(chǎn)品的研究和開發(fā)已取得一定的進展，并在一定的范圍內(nèi)對動物疫病的防治取得了較好的效果，但還存在著許多不足。在制作工藝上，絕大多數(shù)劑型以散劑和煎劑為主，新劑型不多，品種單調(diào)；生產(chǎn)設(shè)備簡陋，加工手段粗放，使用普遍劑量偏大；有些品種的研制過程不夠精密，有效成分不清，作用機理不明。另外中藥制劑如飼料添加劑，由于劑量偏大，不但給生產(chǎn)和運輸帶來許多不便，而且影響動物適口性和采食量。要解決以上問題，提高中藥制劑的科技含量，進行中藥加工技術(shù)的研究是極為重要的。 超微粉碎技術(shù)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一項高新技術(shù)，能把原料加工成微米級的微粉[1]，國外已廣泛應(yīng)用于紡織、食品、醫(yī)藥，化妝品和航天航空等國民經(jīng)濟和軍事的各個領(lǐng)域[2~4]。鑒于粉碎是中藥加工中的基本技術(shù)，近年來，在中藥加工業(yè)中已引入超微粉碎技術(shù)[5~8]。中藥的超微粉碎，是指以打破中藥材細(xì)胞為目的的粉碎作業(yè)。中藥材細(xì)胞在完整無損的情況下，有效成分只有過細(xì)胞壁(膜)釋放出來才能被利用；完整的細(xì)胞壁(膜)對有效成分的釋放形成阻力，且這種阻力隨著細(xì)胞團內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的增大而增大；對中藥進行超微粉碎，可以使絕大多數(shù)細(xì)胞破壁，使細(xì)胞內(nèi)的有效成分直接暴露于溶媒中，從而使有效成分的溶出和起效更加迅速、完全。 著名中藥方劑黃連解毒湯出自唐·王燾<<外臺秘要>>，由黃連、黃柏、黃芩、梔子四味中藥組成。該方劑為清熱解毒代表方，具有清熱、瀉火、解毒之功效，中醫(yī)上用于主治三焦熱盛證[6,7]?！吨腥A人民共和國獸藥典》（2000年版）中的黃連解毒散即源于本方。據(jù)研究，本方具有一定的抗菌、解毒、耐缺氧、抗自由基等作用。在獸醫(yī)臨床上，本方廣泛應(yīng)用于敗血癥、膿毒血癥、痢疾、肺炎等各種急性炎癥。對該方進行超微粉碎技術(shù)方面的研究，國內(nèi)未見報道。我們已對中藥方劑黃連解毒湯進行普通粉碎和超微粉碎后的形態(tài)學(xué)方面進行了比較觀察，并利用掃描電鏡、生物顯微鏡、激光粒度測定儀對普通粉和超細(xì)微粉進行了表征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超細(xì)微粉粉末顆粒大小均勻、均質(zhì)度明顯改善，絕大多數(shù)細(xì)胞破壁。為了進一步了解黃連解毒湯普通粉和超細(xì)微粉中有效成分溶出效果的不同，進行了本試驗。現(xiàn)將超微粉碎技術(shù)對黃連解毒湯中黃芩苷溶出效果的影響報道如下。 1 儀器與試藥 1.1 儀器 Waters高效液相色譜儀及Waters-2487 雙波長UV檢測器（Waters公司，美國），BS-210S 型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司），KQ-3200DE型醫(yī)用數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），BMF-6型倍力微粉機（濟南倍力粉技術(shù)工程有限公司），F(xiàn)Z-102微型植物試樣粉碎機（河北黃驊市齊家務(wù)科學(xué)儀器廠） 1.2藥材 黃連解毒湯由黃連、黃柏、黃芩和梔子(購于福州市藥材采購供應(yīng)站)按規(guī)定比例混合而成。黃連解毒湯細(xì)粉由植物試樣粉碎機粉碎，過65目篩。黃連解毒湯超微細(xì)粉由濟南倍力粉技術(shù)工程有限公司采用超微粉碎技術(shù)制成。 1.3 試劑 黃芩苷對照品（購自中國藥品生物制品檢定所），甲醇（色譜純），磷酸（分析純），水為重蒸餾水。 2．方法和結(jié)果 2.1 色譜條件[9] 色譜柱采用Nova-Pak C18，3.9mm×150mm，柱溫30℃；流動相為甲醇-重蒸水-磷酸（47：53：0.2 ），流速為1ml·min-1；UV檢測波長280nm。 2.2對照品溶液的制備 取黃芩苷，精密稱定，置50ml容量瓶中，加少量甲醇使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，即得黃芩苷對照品溶液（0.058mg/ml）。 2.3 供試品溶液的制備 取黃連解毒湯細(xì)粉及微粉粉末約1克，精密稱定，置三角燒瓶中，加45%甲醇30ml，超聲提取1小時，濾過，濾液置100ml 量瓶中，用少量水分?jǐn)?shù)次洗滌容器，洗液濾入同一量瓶中，用水稀釋至刻度。精密量取續(xù)濾液10ml，置25ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，以0.22um濾膜過濾分別得供試樣品1號和2號[9]。 另取黃連解毒湯細(xì)粉及微粉粉末約1g，精密稱定，置于50ml燒杯中，用適量沸水沖攪，浸泡15min后濾入50ml容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，用0.22um濾膜過濾分別得供試樣品3號和4號。 2.4 線性關(guān)系 精密吸取黃芩苷對照品溶液2，4，6，8，10ul依次進樣，在前述色譜條件下測定峰面積，以對照品進樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，回歸得直線方程Y=207678X - 31156，r =0.999。結(jié)果表明，黃芩苷進樣量在0.116~0.58ug峰面積積分值與其濃度呈良好的線性關(guān)系（圖1）。 2.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10ul，連續(xù)進樣5次，記錄峰面積積分值，結(jié)果表明精密度良好,RSD為1.3%（n=5）。 2.6重現(xiàn)性試驗 精密稱取同一批樣品 5份，按供試品溶液的制備方法處理后，分別進樣10ul，用外標(biāo)法計算黃芩苷含量，其RSD分別為0.6%、0.9%、1.8%和1.1%（n=5），表明該法重現(xiàn)性良好。 2.7 加樣回收率試驗 取已知含量的4種供試液各5份，分別精密加入黃芩苷對照品，按2.3 項下方法制成供試液，每次進樣10ul，并測定其黃芩苷含量，結(jié)果（n=5）4種樣品的平均回收率分別為94.93%、 97.14% 、95.17% 、94.00%；RSD分別為0.3% 、1.0%、1.3%、0.7%，表明該方法可行。 2.8 樣品測定 精密吸取10ul 樣品液進樣，用外標(biāo)法計算樣品中黃芩苷含量（圖2-5）。4種樣品的測定結(jié)果見表1。 表1黃芩苷含量測定結(jié)果 (n=5) Tab1 The content result of baicalin(n=5) 樣品編號含量RSD/% sample No.( content)/mg?g-1 116.180.6% 2 21.440.9% 39.371.8% 414.171.1% 注:供試樣品處理見2.3項：供試品溶液的制備。 附：圖1黃芩苷對照品色譜圖           圖2 黃連解毒湯細(xì)粉 色譜圖(超聲提取)圖3 黃連解毒湯超細(xì)微粉色譜圖(超聲提取) 圖4 黃連解毒湯細(xì)粉色譜圖(簡化提取)圖5 黃連解毒湯超細(xì)微粉色譜圖(簡化提取) 3. 討論 中藥經(jīng)超微碎加工后，所得的超細(xì)微粉粒徑范圍一般為1-75um，平均≤15 um。根據(jù)物理學(xué)知識可知，中藥粒徑在此范圍內(nèi)的顆粒，其細(xì)化程度尚不涉及原子或分子結(jié)構(gòu)層面上的影響，，不會發(fā)生明顯的分子結(jié)構(gòu)上的變化，這為中藥藥效的穩(wěn)定提供了基本保證，既不影響中藥屬性、藥效特征和功能主治。從試驗結(jié)果的粉體HPLC圖譜顯示，在同一提取方法下，細(xì)粉和超細(xì)微粉在相同的保留時間有相同的吸收峰，僅在峰值有差別，沒有新的峰出現(xiàn)。說明超細(xì)微粉沒有新物質(zhì)生成，傳統(tǒng)中藥固有的藥效學(xué)基礎(chǔ)物質(zhì)沒有發(fā)生質(zhì)的變化。中藥超微粉碎，較好地處理了中藥研發(fā)過程中繼承與創(chuàng)新的關(guān)系，即發(fā)揮了現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的優(yōu)勢，又秉承了傳統(tǒng)中藥治病保健的固有特性。 現(xiàn)代中藥加工研究不少從中藥中提取中藥有效成分，試圖使用中藥提取物來解決傳統(tǒng)劑型存在的缺點。中藥提取物的應(yīng)用，在減少制劑用量、有效使用藥材及對中藥活性成分的研究具有劃時代的意義。但提取物的劑型也有重要的缺點。因為中藥與中醫(yī)理論一脈相承，中藥以中醫(yī)基礎(chǔ)理論為指導(dǎo)，提取物的使用難以體現(xiàn)中醫(yī)的特色。尤其在復(fù)方研究上，中醫(yī)強調(diào)藥物協(xié)同和全成分入藥，這是中藥復(fù)方發(fā)揮藥效的前提和關(guān)鍵。在中藥加工業(yè)上進行超微粉碎技術(shù)的研究，一方面可以使藥材細(xì)胞破壁，提高藥效，提高中藥生物得用度，降低中藥資源的浪費和消耗；另一方面，仍然保持中藥的全成分入藥，可以遵循中醫(yī)學(xué)辨證論治和理法方藥的用藥原則。因此將這一高新技術(shù)引入中藥制劑領(lǐng)域進行應(yīng)用研究，具有十分重要的意義。 實驗結(jié)果表明：經(jīng)超聲提取后，黃連解毒湯中的有效成分黃芩苷含量超細(xì)微粉約比細(xì)粉提高32.51℅（見表1）；而在簡化提取(開水沖攪)下黃連解毒湯中的有效成分黃芩苷含量超細(xì)微粉比細(xì)粉提高51.23℅（見表1）。以上結(jié)果與文獻[10]報道“細(xì)胞破壁后，細(xì)胞內(nèi)有效成分充分暴露出來，藥物的釋放量會大幅度提高”是一致的。超聲提取是一種先進的提取方法，方便且提取率高；但在簡化提取(開水沖攪)下，超細(xì)微粉中的黃芩苷含量僅略低于細(xì)粉在超聲提取中的含量，故藥材經(jīng)超微粉碎后，細(xì)胞破壁，藥物的有效成分不經(jīng)細(xì)胞壁交換而被溶提出來，即可簡便提取方法，又能縮短提取時間，中藥超微粉的應(yīng)用將會大大方便用藥者。黃連解毒湯中含有的其它有效成分，如小檗堿、梔子苷等，它們是否與黃芩苷呈相關(guān)變化；以及黃連解毒湯兩種粉體的藥效學(xué)比較等將有待進一步研究和報道。