清涼沖劑對雞免疫功能的影響

貔貅

清涼沖劑對雞免疫功能的影響 胡艷欣1佘銳萍1馬衛(wèi)明4肖沖2王占赫1許劍琴1劉鳳華3 *     （1 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院北京 100094；2中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院北京 100094；3北京農(nóng)學(xué)院北京 102206 ；4 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院山東泰安 271018)

摘要：本實(shí)驗所采用的清涼沖劑，是以石膏為主要成分的中藥復(fù)方。實(shí)驗動物選擇體重基本一致的農(nóng)大三號雛雞60只，隨機(jī)平均分為2組。實(shí)驗從第7日齡起，至49日齡時止，周期共計6周。其中實(shí)驗組飼喂中藥煎劑（濃度為1g/ml），喂藥量與飼料量比為1：1000；對照組不喂藥，兩組均正常飲水。在第7，21，35，49日齡時，兩組分別剖殺5只，取胸腺、法氏囊、脾臟等免疫器官，稱量并計算免疫器官指數(shù)；每周進(jìn)行心臟采血,用血凝抑制法(HI)測定各組血清NDV抗體水平；采用腹腔巨噬細(xì)胞功能測定法，計算其吞噬百分率和吞噬指數(shù)。實(shí)驗結(jié)果顯示：與對照組相比，免疫器官指數(shù)、NDV抗體水平以及腹腔巨噬細(xì)胞吞噬百分率和吞噬指數(shù)各項指標(biāo)實(shí)驗組均明顯高于對照組(P<0.05或P<0.01)。說明清涼沖劑可以有效增強(qiáng)雞的免疫功能。 關(guān)鍵詞：清涼沖劑免疫功能雞 Effect of Qingliang Chinese-Herb decoctionon chickenimmunological function HU yan-xin 1,SHE rui-ping1, MA wei-ming4,XIAO Chong2 , Wang zhan-he1,Xu jian-qin1,LIU feng-hua3 (1 College of Veterinary Medicine , China Agricultural University , Beijing 100094 ,2 College of Biology, China Agricultural University , Beijing 100094 ,3Beijing Agricultural College ,Beijing 102206,China 4 Shandong Agricultural University,taian,271018 ) ［Abstract］Sixty healthy seven-day-old layers were divided into two groups at random , thirty for each.. Qingliang Chinese-Herb decoction were orally administered to chicken of Group Ⅰ. Group II is the control group ..At the age of 7, 21, 35, 49 days , 5 layers of each group were sacrificed and index numbers of thymus , spleen and bursa Fabricius were calculated. Every week , HI test result s with heart blood were recorded to calculate NDV antibody titers. At the age of 49 days, phagocytic percentage and phagocytic index were observed. The result s demonstrated that Qingliang Chinese-Herb decoction could increased the spleen , thymus and bursa Fabricius weight and phagocytic percentage and phagocytic index. It could also significantly enhance NDV antibody titers. It is indicated that Qingliang Chinese-Herb decoction could improve the immunity in chicken. ［Key Word］Qingliang Chinese-Herb decoction,immunological function , chicken 清涼沖劑是以石膏為主要成分的抗熱應(yīng)激中藥方劑，其作用機(jī)理是通過增強(qiáng)散熱和提高機(jī)體免疫水平這兩個方面來達(dá)到抗熱應(yīng)激的目。石膏又名白虎，是中醫(yī)清熱瀉火治氣分實(shí)熱證的要藥，[1]在20世紀(jì)80年代前主要是通過研究石膏有無退熱作用，來對其作用機(jī)制進(jìn)行探討。在近年的研究中發(fā)現(xiàn)，石膏亦能夠非特異性增強(qiáng)動物細(xì)胞及體液免疫水平。[2，3，4] 本研究將觀察服用清涼沖劑后，雞免疫器官指數(shù)、NDV抗體水平以及腹腔巨噬細(xì)胞吞噬百分率和吞噬指數(shù)各項指標(biāo)的變化，來探討含有石膏成分的清涼沖劑對雞免疫功能的影響。從而為清涼沖劑的開發(fā)奠定一定的理論基礎(chǔ)。 1. 材料與方法 1.1材料 1.1.1 藥物及主要試劑 清涼沖劑，主要成分以石膏為主，藿香等中草藥為輔。采用傳統(tǒng)中藥煎煮方法將中草藥制成水煎液，并濃縮成1g/ml，作為實(shí)驗藥劑。雞新城疫克隆C30活疫苗（SPF）、雞新城疫低毒力活疫苗（Lasota 系）(遼寧省益康生物制品廠產(chǎn)品)，購自中國獸藥監(jiān)察所。5 %的雞紅細(xì)胞懸液，由筆者所在實(shí)驗室自行制備。 1.1.2 實(shí)驗動物與飼養(yǎng)管理 農(nóng)大3號1日齡公雛，購自北京昌平區(qū)雞場。雛雞飼喂北京震亞飼料廠生產(chǎn)的蛋雛雞全價料（ME＝12.18MJ/kg，CP＝18.45％），自由采食與飲水。光照時間1～3日齡為23小時/天，從4日齡起，每天減少2h，直至8小時/天時為止。雞舍內(nèi)溫度1～3日齡為30～33℃，4～7日齡為28～30℃，以后每周降低2℃，直至18～20℃為止。 1.2實(shí)驗方法 1.2.1免疫器官指數(shù)的測定和計算 在7、21、35和49日齡，實(shí)驗組和對照組各隨機(jī)抽取5羽試驗雞，稱重后迅速處死并完整剝離每只雞的胸腺、脾臟和法氏囊，稱重。按照下述公式計算每只雞的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)：免疫器官指數(shù)= 免疫器官重(mg)/體重(g)。[5]用MINITAB Release 10.1軟件進(jìn)行平均數(shù)運(yùn)算和方差計算，分析各實(shí)驗組各個指標(biāo)之間的差異顯著性。（下同） 1.2.2NDV血清抗體水平的測定 雞新城疫的免疫采用雞新城疫克隆C30活疫苗（SPF），于7日齡滴鼻點(diǎn)眼首免，1頭份/只；21，35日齡時用雞新城疫低毒力活疫苗（Lasota 系）飲水進(jìn)行二免和三免，2頭份/只。分別于7、14、21、28、35、42和49日齡采血分離血清，實(shí)驗組與對照組分別隨機(jī)抽取10只雞。按常規(guī)方法用96孔“V”形血凝板進(jìn)行血凝抑制試驗（HI），測定NDV血清抗體的血凝抑制效價，以log2表示。 1.2.3雞腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬功能的測定 取49日齡實(shí)驗組和對照組雞各5只。檢測前1天每只雞腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 5 %的淀粉生理鹽水1.0ml，檢測時每只雞腹腔注射體積分?jǐn)?shù)為5 %的雞紅細(xì)胞懸液1.0 ml；30min后頸靜脈放血致死雞只。經(jīng)腹膜注入生理鹽水3.0ml , 輕揉腹部, 然后吸出腹腔洗液1.0 ml，平均滴于2 片載玻片上，37℃溫育，PBS漂洗，除去未貼片細(xì)胞，晾干，丙酮-甲醇（1∶1）固定，姬姆薩染色，每片油鏡下計數(shù)200 個巨噬細(xì)胞所吞噬的雞紅細(xì)胞數(shù)。[6,7,8]按下列公式計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)： 2.實(shí)驗結(jié)果 2.1清涼沖劑對免疫器官指數(shù)的影響 不同時期各組雞免疫器官指數(shù)見表1。 表1清涼沖劑對雞免疫器官指數(shù)的影響 (，n=5)單位：% 7日齡 21日齡 35日齡 49日齡 胸腺指數(shù) 實(shí)驗組 6.63±0.05 7.11±0.12 7.95±0.19* 7.50±0.26* 對照組 6.63±0.05 7.50±0.11 5.72±0.13 4.62±0.06 脾臟指數(shù) 實(shí)驗組 1.11±0.03 1.45±0.01 1.86±0.05 2.23±0.04 對照組 1.11±0.03 1.27±0.02 1.75±0.05 1.71±0.03 法氏囊指數(shù) 實(shí)驗組 3.48±0.03 6.02±0.14 4.53±0.15 3.49±0.09 對照組 3.48±0.03 6.16±0.09 4.12±0.17 2.38±0.16 （表中* 表示差異顯著，P<0.05；**表示差異極顯著，P<0.01） 從表1可以看出，服用清涼沖劑之后（7日齡開始），與對照組相比較，實(shí)驗組雞各免疫器官指數(shù)均有所增高。到35日齡和49日齡的時候，實(shí)驗組雞胸腺指數(shù)顯著高于對照組，P<0.05。脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)差異性分析均為不顯著（P>0.05），但均高于對照組，說明清涼沖劑可以促進(jìn)免疫器官的發(fā)育。 2.2清涼沖劑對NDV血清抗體水平 不同時期各組雞NDV血清抗體水平見圖1。 圖1實(shí)驗期間雞NDV血清抗體變化曲線圖 從圖1可以看出，7日齡首免后，NDV血清抗體水平逐漸提升，21日齡進(jìn)行二免，抗體水平繼續(xù)提升，至35 日齡有所下降，之后又回升。在整個實(shí)驗期間，實(shí)驗組抗體水平始終高于對照組，但在14～28日齡期間，實(shí)驗組抗體水平與對照組差異不顯著（P>0.05）；在35日齡，實(shí)驗組抗體水平與對照組差異極顯著（P<0.01）；至42日齡，實(shí)驗組抗體水平高于對照組，差異顯著（P<0.05）； 49日齡，又回到了差異不顯著的水平（P>0.05）。 2.3清涼沖劑對雞腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 圖2 清涼沖劑對巨噬細(xì)胞吞噬百分率、吞噬指數(shù)的影響 油鏡下，巨噬細(xì)胞體積明顯大于雞紅細(xì)胞，且胞漿呈淡粉色（圖3）。從圖2可以看出，實(shí)驗組雞腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞的吞噬百分率和吞噬指數(shù)都顯著高于對照組（P<0.05），說明清涼沖劑可以提高雞腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞的吞噬能力。    圖3巨噬細(xì)胞吞噬紅細(xì)胞后的形態(tài)結(jié)構(gòu)（姬姆薩染色，100×）：A圖表示未吞噬紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞，B圖表示正在吞噬紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞，C圖表示已吞噬紅紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞（箭頭所示）。 3小結(jié)與討論 石膏屬清熱類藥，主要成分是含水硫酸鈣，主要功效是清熱瀉火，防煩止渴。在免疫方學(xué)面，發(fā)現(xiàn)石膏及以石膏為主的復(fù)方，可明顯增加免疫器官重量，[8]增強(qiáng)細(xì)胞吞噬功能，增加機(jī)體細(xì)胞免疫功能。[2,3,9] 本研究已經(jīng)證實(shí)以石膏為主要成分的清涼沖劑可以顯著提高機(jī)體的免疫功能。 機(jī)體免疫系統(tǒng)是一個復(fù)雜的系統(tǒng),包括特異性免疫和非特異性免疫，二者相輔相成，相互聯(lián)系，共同維持機(jī)體內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)定。免疫器官和免疫細(xì)胞及其產(chǎn)物（如抗體）是動物機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的物質(zhì)基礎(chǔ)。胸腺、法氏囊和脾臟作為禽類重要的中樞免疫免疫器官和外周免疫器官，其生長發(fā)育勢必與其免疫功能密切相關(guān)。一般免疫藥理學(xué)試驗常以藥物對免疫器官的增重作為衡量其免疫功能強(qiáng)弱的指標(biāo)之一。[10]免疫器官指數(shù)能很好的反應(yīng)機(jī)體的免疫器官的重量變化，且能將個體差異的影響降低到最低限度。[11]本實(shí)驗中，實(shí)驗組雞各免疫器官指數(shù)明顯高于對照組，提示清涼沖劑有促進(jìn)免疫器官增重的作用，從而為機(jī)體免疫功能的增強(qiáng)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。 巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞,是機(jī)體抵抗病原體和腫瘤的第一道防線之一,在抗感染初期,吞噬和殺滅入侵微生物，發(fā)揮非特異性免疫作用。[12]在藥物對免疫功能的影響作用的研究中，巨噬細(xì)胞吞噬試驗是一個重要的非特異性免疫功能的觀察指標(biāo)。在各種微生物和免疫學(xué)實(shí)驗指導(dǎo)中常用體內(nèi)吞噬細(xì)菌法來測定吞噬細(xì)胞的吞噬功能。本研究結(jié)果表明，實(shí)驗組的雞腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能增強(qiáng)，其吞噬百分率和吞噬指扮與對照組相比有顯著的差異（P<0.05），提示清涼沖劑可以提高機(jī)體的非特異性免疫能力。 ND抗體水平作為檢測特異性免疫能力的指標(biāo)，在本研究中被列為研究對象之一。ND至今仍是影響?zhàn)B禽業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的主要疫病之一。免疫程序混亂、免疫抑制以及免疫后血清保護(hù)性抗體不能快速提升，也是造成這兩種疫病廣為傳播的原因之一。[12]本研究中，整個實(shí)驗期間，實(shí)驗組抗體水平始終高于對照組，且在35日齡時，實(shí)驗組抗體水平與對照組差異極顯著（P<0.01），提示清涼沖劑在雞生長發(fā)育的不同階段對其特異性免疫起著連續(xù)的加強(qiáng)作用,使藥效作用時間更加持久。 綜上所述，以石膏為主要成分的復(fù)方清涼沖劑，可以明顯提高雞免疫器官指數(shù)、NDV抗體水平以及腹腔巨噬細(xì)胞吞噬百分率和吞噬指數(shù)，表明了清涼沖劑可以增強(qiáng)機(jī)體非特異性及特異性免疫功能。