中藥有效部位復方對小鼠熱應激腸道T淋巴細胞增殖影響的組方機制研究

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中藥有效部位復方對小鼠熱應激腸道T淋巴細胞增殖影響的組方機制研究 王自力　魏秀蓮　劉鳳華　毛帥　許劍琴 （1.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，100094；2.北京市飼料獸藥監(jiān)察所　100107；3.北京市北京農(nóng)學院動物科學系，北京 102206）

方劑是在中（獸）醫(yī)理論指導下，辨證論治的基礎(chǔ)上，根據(jù)動物病情需要選擇適當?shù)模▋晌换蚨辔叮┲兴?，酌定用量，按照一定的組成原則，配伍組合而成。藥物決定方劑的功效，方劑中藥味的增加或減少以及用量，可導致方劑配伍關(guān)系和功效變化。在中藥方劑及新藥研究中，雖可根據(jù)中獸醫(yī)理論和臨床經(jīng)驗選擇藥物和組方，但中藥方劑多為復方且藥物劑量不一，即存在多因素多水平特點[1]，為中獸藥作用機理研究、中藥現(xiàn)代化和新藥開發(fā)及其產(chǎn)業(yè)化帶來很多困難。正交試驗設(shè)計是采用規(guī)格化的正交表，使試驗因素和水平得到合理安排，并通過試驗結(jié)果分析各因素對試驗觀察指標的影響，分清各因素之間的主次關(guān)系和交互作用，確定各因素不同水平的最佳組合，是多因素多水平試驗效率最高的設(shè)計方法。 　　熱應激可引起動物免疫機能下降，如引起小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、淋巴細胞增殖活性、IL-2濃度及其受體表達均出現(xiàn)下降[2]，誘導胸腺細胞和脾臟細胞的凋亡，并引起動物胸腺和脾臟萎縮[3]，還可通過下丘腦－垂體－腎上腺皮質(zhì)軸引起皮質(zhì)醇水平升高而影響動物正常的生理和免疫功能[4~6]。因此，本試驗在中獸醫(yī)方劑“君、臣、佐、使”組方原則的指導下，采用正交設(shè)計法研究藿香、蒼術(shù)、黃柏和石膏四種中藥有效部位不同組合以及不同水平對熱應激后小鼠腸道淋巴細胞增殖的影響，旨在探討中藥有效部位復方組方機制。 　　1　材料與方法 　　1.1 藥品與試劑 　　中藥有效部位：石膏水提物（gypsum fibrosum water extract, GFWE）（硫酸鈣含量為92%）、黃柏生物堿（cortex phellodendri‘s alkaloid, CPA）（小檗堿含量為42.0%）、藿香揮發(fā)油包合物（herba agastachis‘s aetherolea, HAA）（百秋里醇含量30.47%）、蒼術(shù)揮發(fā)油包合物（rhizoma atractylodi’s aetherolea, RAA）（β-桉葉油醇含量33.63%）均由本課題組制備和定量測定，臨用前分別用RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制成1mg/ml。 　　RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、Hank’s干粉為Hyclone公司產(chǎn)品；小牛血清，購自北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所；二硫蘇糖醇（DTT），購自北京科昊澤生物技術(shù)有限公司；噻唑藍（MTT）、二甲基亞楓（DMSO），購自Amresco公司；Ⅱ型膠原酶、EDTA、植物血凝素（PHA）購自Sigma公司；小鼠淋巴細胞分離液，購自天津灝洋生物制品科技有限責任公司。 　　1.2　試驗方法 　　1.2.1　小鼠腸道淋巴細胞分離與培養(yǎng) 　　參照文獻方法[7,8]分離腸道淋巴細胞，即脫臼處死18~22g BALB/c鼠，置于75%酒精中浸泡5min，取出十二指腸到回盲腸結(jié)之間的腸道組織；用含有1000IU雙抗的Hank’s洗滌液反復沖洗；將腸道組織塊剪成1×1cm2大小置于含1000IU雙抗、5%小牛血清Hank’s洗滌液中浸泡5min，反復3次；加入20ml 37℃ EDTA-DTT消化液，間斷振蕩消化30min，收集消化液1000rpm離心5min以獲取淋巴細胞；向剩余組織塊中加入20ml 37℃的0.1%Ⅱ型膠原酶液，37℃恒溫振蕩水浴鍋中以250rpm振蕩消化40min；將剩余消化液經(jīng)2層無菌醫(yī)用紗布過濾；10000rpm離心濾液5min，收集細胞后用完全培養(yǎng)基洗滌2次；將兩次收集的淋巴細胞懸液緩慢加入到淋巴細胞分離液上層，以2000rpm離心20min，收集淋巴細胞分離液層和培養(yǎng)液中間的淋巴細胞層；用10%小牛血清RPMI-1640完全細胞培養(yǎng)基以1000rpm離心5min方式洗滌淋巴細胞2次，并經(jīng)玻璃纖維棉柱過濾；經(jīng)0.3%臺盼藍拒染法計算細胞活力＞90%后，用10%小牛血清完全培養(yǎng)基調(diào)整淋巴細胞數(shù)量為1×106個/ml，按照0.5ml/孔加入96孔細胞培養(yǎng)板后，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 　　1.2.2　正交試驗設(shè)計 根據(jù)正交試驗設(shè)計要求，考察藿香揮發(fā)油、蒼術(shù)揮發(fā)油、黃柏生物堿和石膏水提物不同水平組方對熱應激小鼠腸道淋巴細胞增殖的影響。即A，B，C，D，A×B，A×C，B×C，選用正交表L8（27）。因需考察A×B，就先將A放在第1列，B放在第2列由L8（27）交互作用列表查出A×B在第3列；將C放在第4列，同法查出A×C在第5列，B×C在第6列，D放在第7列。因素水平、表頭設(shè)計和試驗方案見表1和表2。 　　表1因素和水平表 因素 factor 藿香 HAA 蒼術(shù) RAA 黃柏 CPA 石膏 GFWE 種類type A B C D 1 200mg/ml 200mg/ml 200mg/ml 100mg/ml 2 100mg/ml 100mg/ml 100mg/ml 50mg/ml 表2表頭設(shè)計和試驗方案表 列array 1 2 3 4 5 6 7 因子 factors 藿香 HAA 蒼術(shù) RAA 藿香×蒼術(shù) HAA×RAA 黃柏 CPA 藿香×黃柏 HAA×CPA 蒼術(shù)×黃柏 RAA×CPA 石膏 GFWE 1 2 3 4 5 6 7 8 1（200） 1（200） 1（200） 1（200） 2（100） 2（100） 2（100） 2（100） 1（200） 1（200） 2（100） 2（100） 1（200） 1（200） 2（100） 2（100） 1 1 2 2 2 2 1 1 1（200） 2（100） 1（200） 2（100） 1（200） 2（100） 1（200） 2（100） 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 2 1 1 2 2 1 1（100） 2（50） 2（50） 1（100） 2（50） 1（100） 1（100） 2（50） 　　1.2.3 小鼠腸道淋巴細胞處理與數(shù)據(jù)處理 　　向分離獲得的小鼠腸道淋巴細胞懸液中加入不同濃度中藥有效部位組合復方以及1mg/ml PHA后，用10%小牛血清RPMI-1640完全培養(yǎng)基補足至1ml，將小鼠腸道淋巴細胞放于43℃熱應激1h后于37℃、65%濕度條件下培養(yǎng)44h，加入10ml 5mg/ml的MTT液于37℃、65%濕度條件下培養(yǎng)4h，加入100ml DMSO混勻于570nm波長檢測OD值。數(shù)據(jù)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件按照正交設(shè)計法進行方差分析。 　　2.結(jié)果與分析 　　2.1 直觀分析 表3 中藥有效部位復方對熱應激小鼠腸道淋巴細胞增殖的影響（直觀分析表） 藥物與交互作用 Medicine and interaction 藿香 HAA 蒼術(shù) RAA 藿香×蒼術(shù) HAA×RAA 黃柏 CPA 藿香×黃柏 HAA×CPA 蒼術(shù)×黃柏 RAA×CPA 石膏水提物 GFWE T細胞增殖 Proliferation of T lymphocyte 1 2 3 4 5 6 7 8 1 1 1 1 2 2 2 2 1 1 2 2 1 1 2 2 1 1 2 2 2 2 1 1 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 2 1 2 1 1 2 2 1 1 2 2 1 1 2 2 1 2 1 1 2 0.303 0.295 0.301 0.284 0.294 0.282 0.302 0.285 T1 T2 R 1.183 1.163 0.02 1.174 1.172 0.002 1.185 1.161 0.024 1.2 1.146 0.054 1.171 1.175 -0.004 1.166 1.18 -0.014 1.171 1.175 -0.004 2.346 　　據(jù)表3結(jié)果直觀分析可知，黃柏和藿香的極差大，故黃柏和藿香作為主藥，且分別以1水平，即200mg/ml對小鼠腸道T淋巴細胞增殖促進作用最大；蒼術(shù)和石膏為次要藥物，其水平分別選1水平，即分別為200mg/ml和100mg/ml。即最佳組方為A1B1C1D1，以中藥有效部位復方1對熱應激小鼠腸道T淋巴細胞增殖影響最大。 　　2.2 方差分析 表4　中藥有效部位復方對熱應激小鼠腸道T淋巴細胞增殖的影響 列號 Array 1 2 3 4 5 6 7 藥物與交互 A B A×B C A×C B×C D Ri2 0.0004 0.000004 0.000576 0.002916 0.000016 0.000196 0.000016 SSi= Ri2/8 0.00005 0.0000005 0.000072 0.0003645 0.000002 0.0000245 0.000002 　　注：表中為Ri2各種藥物極差的平方，SSi公式中8為復方總數(shù)。 　　各處理因素自由度（df）＝水平數(shù)－1 　　各因素的均方（MS）＝SS/df 　　計算誤差列離均差平方和（SSe）、自由度（dfe）和均方（MSe），公式同上。即SSe＝?SS（SS2＋SS5+SS7）；dfe＝1+1+1＝32；MSe＝SSe/3＝0.0000015 　　F檢驗。F＝MS/MSe 　　結(jié)果判斷：可查F值表。如F<F0.05，P>0.01，差別無顯著；F>F0.05，P<0.05，差異顯著；F>F0.01，P<0.01，差異極顯著。 　　選擇離差平方和較小的SS2、SS5和SS7作為誤差，計算各因子F值，并對藥物的2個水平的作用評定，分析最佳交互列作用，以找出最佳劑量的最佳配伍。 　　表5 中藥有效部位復方對熱應激小鼠腸道T淋巴細胞增殖影響方差分析表 變異來源 SS df MS F P F0.05(1, 3) F0.01(1, 3) A B A×B C A×C B×C D 0.00005 0.0000005 0.000072 0.0003645 0.000002 0.0000245 0.000002 1 1 1 1 1 1 1 0.00005 0.000072 0.0003645 0.0000245 33.33 48.00 243.00 16.33 <0.05 <0.01 <0.01 <0.05 10.1 34.1 誤差 SS2+SS5+SS7＝0.0000045 3 0.0000015 　　表6　藿香和蒼術(shù)（A×B）對熱應激小鼠腸道T淋巴細胞增殖的交互作用分析 A1（藿香200mg/ml） A1(HAA 200mg/ml) A2（藿香100mg/ml） A2(HAA 100mg/ml) B1（蒼術(shù)200mg/ml） B1 (RAA200mg/ml) 0.303+0.295=0.598 0.294+0.282=0.576 B2（蒼術(shù)100mg/ml） B2 (RAA100mg/ml) 0.301+0.284=0.585 0.302+0.285=0.587 　　由表5可知，對熱應激小鼠腸道T淋巴細胞增殖影響較大的藥物有效部位是黃柏生物堿及藿香揮發(fā)油（F值分別為243.00和33.33）。交互作用較好的交互列依次為：A×B（藿香和蒼術(shù)）和B×C（蒼術(shù)和黃柏）。由表6可知，蒼術(shù)揮發(fā)油和藿香揮發(fā)油的濃度增加，對熱應激后小鼠腸道T淋巴細胞增殖具有較大影響，以藿香揮發(fā)油濃度增加效果尤為明顯。 　　綜合直觀分析、方差分析和交互作用分析，即認為藿香、蒼術(shù)、黃柏和石膏四味中藥有效部位復方對熱應激后小鼠腸道T淋巴細胞增的最優(yōu)組合為A1B1C1D1，即藿香揮發(fā)油200mg/ml、黃柏200mg/ml、蒼術(shù)揮發(fā)油200mg/ml、石膏水提物100mg/ml。 　　3　討論 　　腸道黏膜免疫系統(tǒng)包括三種淋巴細胞：分布于腸道黏膜上皮細胞內(nèi)的淋巴細胞，即上皮內(nèi)淋巴細胞（IEL）、固有層淋巴細胞（LPL）、集合淋巴結(jié)（PP結(jié)）淋巴細胞，構(gòu)成腸道黏膜免疫主要部分，其功能的正常對于維護腸道黏膜免疫功能具有重要作用；夏季高溫氣候易引起動物產(chǎn)生熱應激，導致其免疫力下降而給畜牧生產(chǎn)帶來巨大損失[2～6]。根據(jù)中獸醫(yī)理論，我國大部分養(yǎng)豬場夏季環(huán)境多屬于高溫高濕環(huán)境，常被認為是濕熱之邪。夏季動物產(chǎn)生熱應激與飼養(yǎng)環(huán)境因素有關(guān)，即感受濕熱病邪。濕熱病邪常從上焦而入，也可直中中焦，后入下焦，由表及里；濕熱之邪常郁阻中焦脾胃，導致中焦脾胃運化功能障礙，且濕為陰邪，熱為陽邪，二者屬性不一，故病程中出現(xiàn)濕偏重、熱偏重或者濕熱并重等類型。因此，在防治中常采用清熱祛濕原則。本試驗中擬方為藿香、黃柏、蒼術(shù)、石膏四味藥組成，主功效為清熱瀉火、解表和中、燥濕健脾，用于動物在夏季高溫高濕環(huán)境感受濕熱之邪后出現(xiàn)的濕熱證。方中藿香芳香化濁，開胃止嘔，發(fā)表解暑及醒脾理濕；黃柏苦寒，入腎、膀胱經(jīng)和大腸經(jīng)，主瀉下焦火，具有清濕熱、瀉火解毒功效，使?jié)駸嵯滦梗c藿香共為方中主藥。蒼術(shù)燥濕以健脾，祛風濕，臣藥；石膏辛甘大寒，具有清泄氣分實熱，為佐使藥。 　　目前對中藥復方的藥理研究方法可分為全方研究和拆方研究。全方有助于藥效學研究，但不利于研究中藥復方的組方規(guī)律；拆方研究可說明中藥復方的配伍關(guān)系和組方理論，主要通過正交試驗法和拆方分析法[9]進行。本試驗中采用的正交試驗法是按照一定的正交試驗設(shè)計表將一個方劑中的藥物（因素）和劑量（水平）按照一定規(guī)律設(shè)置，遵循這種規(guī)律性設(shè)計，以最少的實驗次數(shù)得出盡可能最佳的試驗結(jié)果；試驗結(jié)果經(jīng)過直觀分析、方差分析和交互分析確定藿香、蒼術(shù)、黃柏和石膏有效部位組成復方的最優(yōu)組合是A1B1C1D1，即藿香揮發(fā)油200mg/ml、黃柏生物堿200mg/ml、蒼術(shù)揮發(fā)油200mg/ml、石膏水提物100mg/ml；對熱應激小鼠腸道T、B淋巴細胞增殖交互作用較好的是藿香揮發(fā)油和蒼術(shù)揮發(fā)油，且以蒼術(shù)揮發(fā)油劑量增加則效果較好；且以黃柏生物堿對熱應激小鼠腸道T、B淋巴細胞增殖影響最大，藿香揮發(fā)油影響居其次，二者共為方中主藥，而蒼術(shù)揮發(fā)油和石膏水提物對T、B淋巴細胞增殖影響較小，作為臣、佐藥，與中獸醫(yī)對熱應激的辨證論治結(jié)果一致；以藿香揮發(fā)油和蒼術(shù)揮發(fā)油交互效果最好，且以蒼術(shù)揮發(fā)油劑量增加則效果較好，說明中藥有效部位劑量在組方中的劑量效應的重要性，同時也說明了中藥有效部位具有中藥特性，且其復方可顯著促進熱應激小鼠腸道T淋巴細胞增殖。 　　根據(jù)正交法設(shè)計的試驗，其試驗點均衡分布，代表性強，可以最大限度節(jié)約人力、物力、時間，同時可以避免完全設(shè)計方法的盲目性，且試驗結(jié)果分析具有計算簡單和結(jié)論可靠的特點[10]。對于正交試驗設(shè)計中的因素選擇必須在專業(yè)知識（中獸醫(yī)理論）指導下進行篩選，使其具有可控性和獨立性，水平的選擇應該具備合理性，符合專業(yè)理論知識和實踐經(jīng)驗的要求，否則易導致無效結(jié)果出現(xiàn)[11，12]。因此，根據(jù)中獸醫(yī)辨證和方劑理論，及正交試驗設(shè)計法確定不同組成中藥有效部位復方，利用熱應激引起腸道淋巴細胞增殖抑制模型，篩選確定中藥有效部位復方組成和劑量，可作為探討中藥方劑組方機制和中藥方劑現(xiàn)代開發(fā)一條重要途徑。

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