槐花水煎液抗SLT-Ⅱe致RIMMVECs損傷的保護效果研究

貔貅

　志賀樣毒素Ⅱ型變異體(Shiga like toxin，SLT-Ⅱe）主要由出血性大腸桿菌(EHEC)產(chǎn)生，為豬水腫病的主要毒力因子。目前的研究表明，微血管內(nèi)皮細胞上帶有的SLT-Ⅱe特異性受體[2]，且SLT-Ⅱe能抑制大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞（rat intestinal mucosa microvascular endothelial cells, RIMMVECs）的增殖，并可對其造成一定損傷。本試驗通過對不同濃度槐花水煎液單獨及與SLT-Ⅱe共同作用后，RIMMVECs的增殖率及NO分泌量的觀察，探討中藥抗SLT-Ⅱe的作用機理，為防治豬水腫病的中藥篩選和中藥抗細菌毒素的機理研究提供理論依據(jù)?！　?．材料與方法
　　1.1材料
　　DMEM（Gibico）；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（Gibico）；SLT-Ⅱe液（揚州大學(xué)微生物實驗室惠贈）；槐花（購自北京同仁堂藥店）；大鼠腸粘膜微血管內(nèi)皮細胞（北京農(nóng)學(xué)院中獸醫(yī)實驗室提供）；NO試劑盒（深圳晶美）；噻唑藍（MTT，Amresco）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma）；所有試劑均經(jīng)過0.22μm孔徑的濾膜過濾除菌。
　　1.2儀器
　　培養(yǎng)板（Costar）；96孔酶標(biāo)板（Costar）；CO2培養(yǎng)箱（Sanyo)；熒光倒置數(shù)碼顯微鏡（麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）；酶聯(lián)免疫檢測儀（BioRad）；分光光度計(Unico)
　　1.3方法
　　1.3.1細胞傳代接種：選取第10代的細胞進行消化，所得細胞液用完全培養(yǎng)基稀釋，將細胞密度調(diào)整到5×104 ?個/mL，充分混勻后接種至96孔細胞培養(yǎng)板中，每個孔接種200 μl，然后置入CO2 培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)48 h。
　　1.3.2 藥液處理：精確稱量干燥槐花100 g ，常法煎煮兩次。經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成1︰1濃度的藥液。4℃保存。使用前，用維持培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。
　　1.3.3 槐花對RIMMVECs的效用試驗：細胞傳代至96孔細胞培養(yǎng)板，37 ℃、CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，待細胞生長到80%鋪滿培養(yǎng)孔底壁，選取5組共25孔的細胞用于試驗。吸棄原培養(yǎng)基，在各組中分別加入含100.0、10.0、1.0、0.1、0 mg/mL槐花的維持培養(yǎng)基200μl，記為槐花1組、槐花2組、槐花3組、槐花4組和空白組。37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，將96孔細胞培養(yǎng)板置入CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。吸出全部細胞培養(yǎng)液，3000 rpm離心10 min，將上清液移入新的小離心管中，封口，-20 ℃冰箱保存。依試劑盒說明書完成細胞上清液中NO的測定。在吸凈細胞上清夜的各孔細胞中加入5 mg/mL的MTT 30 ml及150 ml的DMEM維持培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，輕輕吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入150 μl DMSO，37 ℃孵育30 min 以上，使細胞內(nèi)結(jié)晶充分溶解，于酶標(biāo)儀570 nm波長測定細胞增殖率（OD值）。
　　1.3.4 槐花抗SLT-Ⅱe對RIMMVECs損傷的作用試驗：細胞處理同前，選取5組共25孔細胞進行試驗，分別記為空白組、毒素組、毒素+槐花1組、毒素+槐花2組、毒素+槐花3組。各組加入含不同成分的維持培養(yǎng)基200 μl，各組所含毒素及槐花濃度如下：空白組：維持培養(yǎng)基；毒素組：維持培養(yǎng)基中SLT-Ⅱe 含量為10.0 μg/mL；毒素+槐花1組：維持培養(yǎng)基中含SLT-Ⅱe 10.0 μg/mL，槐花5.0 mg/mL；毒素+槐花2組：維持培養(yǎng)基中含SLT-Ⅱe 10.0 μg/mL，槐花0.5mg/mL；毒素+槐花3組：維持培養(yǎng)基中含SLT-Ⅱe 10.0 μg/mL，槐花0.05 mg/mL。增殖率及 NO分泌量的測定同上。
　　1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計
　　試驗結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，試驗組間差異采用t檢驗法
　　2．結(jié)果
　　2.1 槐花對RIMMVECs的增殖效果試驗
　　由表1可以看出，不同濃度槐花水煎液作用于RIMMVECs 24 h后，槐花1組（100 mg/ mL）、槐花2組（10 mg/ mL）、槐花3組（1 mg/ mL）OD值均小于空白組，且差異極顯著，對RIMVECs增殖呈抑制作用，三組之間差異亦極顯著?；被?組（0.1 mg/ mL）OD值大于空白對照組，且差異極顯著，表現(xiàn)出對RIMVECs的保護、增殖作用，增殖率達14.67%。

　　表1 槐花對RIMMVECs的增殖效果試驗

組別	X ± S	增殖率%	統(tǒng)計結(jié)果
空白組	1.60±0.07	—	B? b
槐花1組	0.04±0.02	-97.81	E? e
槐花2組	0.70±0.08	-55.96	D? d
槐花3組	1.24±0.07	-22.49	B? b
槐花4組	1.83±0.08	14.67	A? a

　　注：各組間不含有相同大寫字母表明差異極顯著p＜0.01，各組間不含有相同小寫字母表明差異顯著p＜0.05
　　2.2 槐花對RIMMVECs分泌NO的影響
由表2可以看出，槐花1組與槐花2組對RIMVECs作用24h后，所測NO分泌量與空白對照組比較，差異極顯著，與槐花其他兩組比較差異極顯著，二者之間差異亦極顯著?；被?組NO分泌量與空白對照組比較，無明顯差異?；被?組NO分泌量分泌與空白對照組比較，差異顯著（P＜0.05）。但槐花3、4組間無明顯差異。

表2? 槐花水煎液對RIMMVECs分泌NO的影響（X±S μmol/L，n = 5）組

組別	X ± S	統(tǒng)計結(jié)果
空白組	10.02±1.10	C?? d
槐花1組	66.01±2.32	A ??a
槐花2組	17.21±1.40	B?? b
槐花3組	12.02±1.80	C ?cd
槐花4組	12.50±1.64	C ??c

　　注:? 各組間不含有相同大寫字母表明差異極顯著P<0.01，各組間不含有相同小寫字母表明差異顯著P<0.05
　　2.3 槐花水煎液與SLT-Ⅱe共同作用對RIMMVECs增殖率的影響
　　由表3可以看出，當(dāng)SLT-Ⅱe濃度為10 μg/mL時，毒素作用細胞24 h后，MTT法測細胞增殖率OD值低于空白對照組，二者相比較，差異極顯著，其對細胞增殖抑制率達29.07%。對于槐花組，毒素+槐花1組OD值與空白對照組比較差異顯著，與毒素組比較差異不顯著。毒素+槐花2組與空白對照組比較差異不顯著，與毒素組比較差異顯著。毒素+槐花3組與空白對照組比較，差異顯著，與毒素組比較差異極顯著。槐花3個組OD值則隨著槐花濃度增加呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢。槐花三個組之間比較差異均極顯著。其中只有毒素+槐花2組與槐花三個組比較無明顯差異，其他兩組均差異極顯著。

表3 槐花水煎液與SLT-Ⅱe共同作用對RIMMVECs增殖率的影響

組別	X ± S	增殖率%	統(tǒng)計結(jié)果
空白組	2.40±0.10	0	A? ?a
毒素組	1.70±0.11	-29.07	C?? c
毒素+槐花1組	1.72±0.09	-28.39	C?? c
毒素+槐花2組	2.30±0.07	-4.20	A?? a
毒素+槐花3組	2.00±0.14	-16.60	B?? b

　　注:? 各組間不含有相同大寫字母表明差異極顯著P<0.01，各組間不含有相同小寫字母表明差異顯著P<0.05
　　2.3 槐花水煎液與SLT-Ⅱe共同作用對RIMMVECs分泌NO的影響
　　由表4和圖4可以看出，當(dāng)SLT-Ⅱe濃度為10 μg/mL時，毒素作用RIMMVECs 24 h后，細胞上清液中NO的分泌量與空白對照組比較增加明顯，且差異極顯著。對于槐花組，毒素+槐花1組、毒素+槐花2組與空白組比較差異極顯著，而與毒素組比較無顯著差異。毒素+槐花3組與空白組比較差異不顯著，但與毒素組比較差異極顯著?；被ńM相應(yīng)的NO分泌量隨槐花濃度的降低而逐漸降低，三個組之間，毒素+槐花1組與毒素+槐花2組比較無顯著差異，與毒素+槐花3組比較差異顯著，毒素+槐花2組與毒素+槐花3組間比較差異顯著。

表4 槐花水煎液與SLT-Ⅱe共同作用對RIMMVECs分泌NO的影響

組別	X ± S	統(tǒng)計結(jié)果
空白組	14.20±2.31	C ???d
毒素組	24.32±4.16	A ???a
毒素+槐花1組	22.95±1.73	A ???ab
毒素+槐花2組	20.57±1.77	AB ?bc
毒素+槐花3組	17.95±2.19	BC ??d

　　3．分析與討論
　　傳統(tǒng)中(獸)醫(yī)的觀點認(rèn)為，豬水腫病的病因內(nèi)為高蛋白飼料完谷不化，郁積為熱毒；外來六淫之邪夾攻，濕毒熱邪無以發(fā)泄所致[2]?；被ㄋ幮晕⒑⑽犊?、歸肝、大腸經(jīng)。具有涼血、止血的功效,用于便血、痔血、血痢、崩漏等 [3]。通過本試驗中槐花對RIMMVECs的效用試驗的結(jié)果可以看出，槐花水煎液對RIMMVECs具有較強的毒性作用，在24 h內(nèi)，1.0 mg/mL以上的槐花劑量組均可以明顯抑制RIMMVECs的增殖，直到濃度為0.1 mg/mL才表現(xiàn)出對細胞的增殖作用。而槐花各組對RIMMVECs分泌NO均高于空白組，但由于槐花水煎液本身具有一定的色澤影響，故排除槐花1組、槐花2組。而從槐花3組、槐花4組的結(jié)果仍略高于空白對照組，結(jié)合槐花組對細胞增殖率的試驗結(jié)果，可以推測槐花對細胞NO的分泌呈微上調(diào)的趨勢。而從槐花水煎液與SLT-Ⅱe共同作用RIMMVECs后細胞增殖率的結(jié)果可以看出，在濃度為0.5 mg/mL和0.05 mg/mL時，槐花水煎液明顯的改善了因SLT-Ⅱe作用而導(dǎo)致的細胞增殖抑制，表明槐花水煎液可以起到保護內(nèi)皮細胞的作用，其中0.5 mg/mL濃度組效果更好。而5.0mg/mL濃度組的細胞增殖率較低則很可能是由于槐花在該濃度下仍具有細胞毒性所致。而從NO分泌的角度來看，毒素+槐花3組表現(xiàn)出明顯的抑制SLT-Ⅱe作用后細胞分泌NO增加的作用?；被▽O分泌的調(diào)控與細胞增殖結(jié)果并不完全一致，其對抗SLT-Ⅱe、保護RIMMVECs的作用機理尚有待進一步研究。