小檗堿對內毒素致腸粘膜微血管內皮細胞損傷的保護作用

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[url=]小檗堿對內毒素致腸粘膜微血管內皮細胞損傷的保護作用[/url] 段慧琴1 ，許劍琴1，張永東1，索占偉2，穆祥2*，喬建1* （1.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100094；2. 北京農學院動科系，農業(yè)應用新技術北京市重點實驗室，北京 102206）

[摘要] 目的：探討小檗堿對細菌脂多糖（LPS）致大鼠腸黏膜微血管內皮細胞(RIMEC)損傷的保護作用。方法：以原代培養(yǎng)的大鼠腸黏膜微血管內皮細胞 (RIMEC)為實驗模型, 10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml小檗堿預孵2h后加入1μg/ml 的LPS 刺激24h 檢測不同時間點細胞培養(yǎng)上清夜中一氧化氮（NO）的水平。NO測定采用硝酸酶還原法。結果：小檗堿在12h、24h時使活化的內皮細胞分泌NO下降，與LPS比較差異極顯著（P<0.05），對內毒素引起的NO升高有明顯下調作用。結論：降低NO分泌，保護LPS引起的血管內皮損傷是小檗堿發(fā)揮其抗炎活性的機制之一。 [關鍵詞]：小檗堿；NO；LPS；微血管內皮細胞 中圖分類號：文獻標識碼：   小檗堿屬異喹啉類生物堿，也稱黃連素，常用其鹽酸鹽，為毛莨科黃連屬植物黃連、黃柏的根莖提取的主要成分，臨床上用于治療菌痢、腸炎、急性扁桃體炎和急性支氣管炎等多種疾患[ 1]。關于小檗堿的抗炎機制目前尚不清楚。為了闡明其的抗炎機制，本試驗采用體外細胞培養(yǎng)技術，觀察了小檗堿對腸粘膜微血管內皮細胞分泌NO的影響，以期進一步揭示其臨床藥理作用。 1.材料和方法 1.1主要試劑DMEM培養(yǎng)基、優(yōu)級胎牛血清(購自Gibco公司)、LPS ( E.coli O55:B5,購自sigma公司)、NO試劑盒 ((購自晶美生物工程有限公司)、小檗堿 (標準品，購自中國藥品生物鑒定所)。 1.2 大鼠腸黏膜微血管內皮細胞分離培養(yǎng)鼠腸黏膜微血管內皮細胞（RIMEC）分離培養(yǎng)見以前所述【1】簡述如下：選用出生24小時之內SD大鼠乳鼠，用外科手術方法獲得空腸，Dhank’s液沖洗，縱向切開，沖洗，剪成小段，吹打數(shù)次。調整濃度接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，基礎培養(yǎng)基用DMEM培養(yǎng)基，補充15％胎牛血清、100 U/ ml青霉素、10μg/ mL鏈霉素，置5%ＣＯ2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2-3ｄ換液1次。細胞達到80%融合生長時即行傳代。倒置顯微鏡下,細胞呈典型的鋪路石狀相嵌排列,無重疊生長現(xiàn)象。免疫熒光法檢測到內皮細胞Ⅷ因子相關抗原陽性。 1.3實驗細胞準備及處理實驗使用第5代細胞。將融合生長的內皮細胞以0.25％胰蛋白酶消化，細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板，細胞密度5×107 cells/L，每孔500μl，置5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細胞融合成單層細胞，開始實驗。分組：（1）對照組（加含2％血清的維持培養(yǎng)基）；（2）LPS組（1μg/ml LPS）（3）小檗堿組＋LPS（分別用10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml小檗堿預孵2h后加入1μg/ml 的LPS）（4）小檗堿組（10μg/ml 小檗堿），每組設復孔6個，分別于刺激后3、6、12、24h 收集上清液，貯存于-20℃冰箱內待測。 1.4 .細胞上清液內NO含量測定采用硝酸還原酶法。以總硝酸鹽(NOX)含量表示NO濃度。測試方法參照試劑盒說明書。 1.5統(tǒng)計學處理各組數(shù)據(jù)以ｘ±ｓ表示，組間差異顯著性判定采用ｔ檢驗。 2.結果 2.1 小檗堿對RIMEC分泌NO的影響本試驗利用還原酶法檢測了小檗堿對RIMECs 分泌NO的影響。結果顯示，10 μg/ml小檗堿在3h、6h內可以促進NO分泌，作用12h后對NO分泌影響減弱，24h時對正常NO分泌無影響，與正常組比較差異不顯著（見表1、圖1）。 2.2小檗堿對LPS誘導的RIMEC NO分泌增高的影響如表1、 圖2所示，在3h、和6h時，10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL的小檗堿對LPS誘導的NO 分泌升高均沒有影響；在12h和24h時，10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL的小檗堿顯著降低NO分泌水平，可以下調LPS引起的NO的分泌升高，基本恢復至正常水平，與LPS組比較差異極顯著，但沒有劑量依賴性。 表1 不同濃度小檗堿在不同時間點對RIMECs分泌NO的影響 (ｎ=6,ｘ±ｓμmol/l) Table1.1: The effect of various concentrations ofBerberine on NO production in RIMECs (ｎ=6,ｘ±ｓ) Group 3h 6h 12h 24h Control 24.18±1.87 21.2±1.15 21.33±3.52 23.1±0.39 LPS (1 μg/ml) 27.20±0.58* 28.86±1.26* 46.75±0.56** 58.53±0.66** Berberine 1 μg/ml +LPS Berberine 5 μg/ml +LPS 30.34±0.79 26.81±1.06 26.55±2.69▲▲ 19.65±3.56 34.26±1.3 29.68±1.22 25.52±7.29▲▲ 19.5±0.26 Berberine 10 μg/ml +LPS 29.82±1.15 26.12±2.57 22.16±0.9▲▲ 21.89±0.52 Berberine 10 μg/ml 32.16±1.25** 30.90±2.28 25.46±2.46 24.11±1.01 *:（P<0.05） **:（P<0.01）：vs normal group,▲: P<0.05, ▲▲: P<0.01 vs LPS group 3.討論     內皮細胞不僅是血液和組織之間的重要屏障，而且在許多病理生理過程（包括炎癥）中起著重要的作用【2】。越來越多的研究證明，血管內皮細胞受損是內毒素性休克、全身性炎癥反應綜合癥以及多器官功能障礙的基本原因【3】。不同來源的微血管內皮細胞在形態(tài)、結構、功能上存在著一定的差異性[4]。腸粘膜微血管內皮細胞是內毒素作用的主要靶點之一，在大腸桿菌性腸炎及其引起的菌血癥和毒血癥的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。利用體外培養(yǎng)的腸粘膜微血管內皮細胞可以直接觀察藥物對內皮細胞的調控作用，從而在細胞水平對機理進行深入研究。     NO在許多生理和病理生理狀態(tài)中具有遞質、信使和細胞功能調節(jié)因子的功能。研究認為急慢性炎癥的發(fā)生均與NO有關系。在炎癥反應中組織中誘生型NO合酶(iNOS)被誘導生成，產(chǎn)生大量NO，促進炎癥反應，包括使血管舒張，形成水腫和局部紅斑，增加炎性滲出，細胞毒性作用以及細胞因子依賴過程的介導作用，促進敗血癥的發(fā)展等。這也暗示了能夠抑制LPS引起的NO分泌增加的制劑對控制炎癥的發(fā)生發(fā)展具有潛在的的治療價值。     小檗堿具有在人醫(yī)和獸醫(yī)臨床上具有廣泛應用價值。印度Dutta等在60年代發(fā)現(xiàn)小檗堿可以抑制幼兔的霍亂弧菌的傳染[5]。從那以后，印度科學家對該藥進行了深入的研究，并發(fā)現(xiàn)了小檗堿可以抑制其他的細菌的傳染（包括霍亂弧菌），對原生動物，真菌和利什曼原蟲均有抑制作用，并有報道發(fā)現(xiàn)用小檗堿治療霍亂[6]引起急性腹瀉。小檗堿對大腸桿菌耐熱腸毒素和不耐熱腸毒素引起的幼兔腹瀉具有顯著療效[7]。但對其抗炎機理的研究報道較少。郝鈺等[8]研究發(fā)現(xiàn)小檗堿能下調IL-1、TNF誘導的人臍靜脈內皮細胞粘附分子ICAM-1的表達增強。呂燕寧等[9]研究發(fā)現(xiàn)小檗堿1.5mg/mL對二硝基氟苯(DN FB) 所致的小鼠DTH 有抑制作用, 其機制可能是抑制了IFN-C, IL-1, TN F-A, IL-2 等因子的產(chǎn)生和分泌, 從而抑制免疫反應, 減輕炎癥損傷。     本試驗結果發(fā)現(xiàn)小檗堿對LPS誘導的腸粘膜微血管內皮細胞NO分泌增加有明顯的抑制作用。小檗堿對內皮細胞分泌NO的影響反應較慢，在12h和24h時作用較強，能夠抑制過多的NO分泌。在12h時，5、10 μg/ml的小檗堿可以抑制LPS引起的NO增加，24h時1、5、10 μg/ml的小檗堿均可以抑制LPS引起的NO增加，三個濃度組之間沒有明顯的劑量依賴性。結果提示小檗堿可以通過降低NO的分泌來發(fā)揮其抗炎活性，改善LPS引起的內皮細胞損傷及循環(huán)障礙。     試驗還發(fā)現(xiàn)小檗堿對靜息的腸粘膜微血管內皮細胞分泌功能也有影響，3h、6h時使NO分泌升高，12h后又逐漸恢復正常。提示小檗堿在生理狀態(tài)下可能有舒張血管的效應，而且存在自我調節(jié)機制，這也從一方面證實了血管內皮釋放NO 是小檗堿產(chǎn)生血管松弛作用的內皮依賴性機制[10]。     關于小檗堿在病理生理條件下調節(jié)腸粘膜微血管內皮細胞分泌NO的的分子機制還需從小檗堿對eNOS和iNOS的活性及其mRNA表達的調控方面進行深入研究。