抗血清的制備

huangshihan

一、動(dòng)物的選擇

　　選擇合適的動(dòng)物進(jìn)行免疫極為重要。選擇時(shí)應(yīng)考慮以直幾個(gè)因素：①抗原與免疫動(dòng)物的種屬差異越遠(yuǎn)越好；親緣關(guān)系太近不易產(chǎn)生抗體應(yīng)答（如兔－大鼠之間，雞－鴨之間）。②抗血清量的需要：大動(dòng)物如馬、騾等可獲得大量血清（一頭成年馬反復(fù)采血可獲得10000ml以上的抗血清）；但有時(shí)抗體需要是不多，選用家兔或豚鼠即可。③抗血清的要求：抗血清可分為R型和H型。H型抗血清用于沉淀反應(yīng)較難掌握，因而極少應(yīng)用。④抗原的選擇：對(duì)蛋白質(zhì)抗原，大部分動(dòng)物皆適合常用的是山羊和家兔。但是，在某些動(dòng)物體內(nèi)有類似的物質(zhì)或其它原因，對(duì)這些動(dòng)物免疫原性極差，如IgE對(duì)綿羊、胰島素對(duì)家兔、多種酶類（如胃蛋白酶原等）對(duì)山羊等，免疫時(shí)皆不易出現(xiàn)抗體。這些物質(zhì)有時(shí)可以用豚鼠（如胰島素等）、火雞、甚至豬、狗、貓等作試驗(yàn)免疫。⑤甾體激素免疫多用家兔；酶類免疫多用豚鼠。

　　二、免疫劑量、時(shí)間和途徑

　　免疫原合適劑量的選定應(yīng)考慮抗原性強(qiáng)弱、分子量大小和免疫時(shí)間?？乖杩闪慷?，時(shí)間間隔長(zhǎng)，劑量可適當(dāng)加大。大動(dòng)物抗原劑量（以蛋白抗原為準(zhǔn)）約0.5～1mg/只，小動(dòng)物約0.1～0.6mg/只。有時(shí)主觀希望加強(qiáng)免疫效果而不適當(dāng)?shù)丶哟髣┝?，往往?huì)弄巧成拙。因?yàn)閯┝考哟髽O易造成免疫耐受（免疫抑制）而遭失敗。已有證明，幾微克的蛋白質(zhì)也能很好地免疫出抗血清。

　　免疫注射的途徑也很重要。一般采用多點(diǎn)注射，一只動(dòng)物注射總數(shù)約為8～10點(diǎn)，包括足掌及肘窩淋巴結(jié)周圍，背部?jī)蓚?cè)、頜下、耳后等處皮內(nèi)或皮下，皮內(nèi)易引起細(xì)胞免疫反應(yīng)，對(duì)提高抗體效價(jià)有利。但皮內(nèi)注射較困難，特別是天冷時(shí)更難注入（因佐劑加入后粘度較大）。其他途徑還有肌內(nèi)、腹腔、靜脈、腦內(nèi)等，但較少應(yīng)用。如抗原極為寶貴可采用淋巴結(jié)內(nèi)微量注射法，抗原只需10～100μg；方法是先用不完全佐劑在足作基礎(chǔ)免疫（預(yù)免疫），10～15天后可見肘窩處有腫大的淋巴結(jié)（有時(shí)在腹股溝處觸及），用兩手指固定好淋巴結(jié)，消毒后用微量注射器直接注射入抗原（一般不需要佐劑）。

　　免疫間隔時(shí)間也是重要因素，特別是首次與第二次之間更應(yīng)注意。第一次免疫后，因動(dòng)物機(jī)體正處于識(shí)別抗原和B細(xì)胞增殖階段，如很快接著第二次注入抗原，極易造成免疫抑制。一般以間隔10～20天為好。二次以后每次的間隔一般為7～10天，不能太長(zhǎng)，以防刺激變?nèi)?，抗體效價(jià)不高。對(duì)于半抗原的免疫間隔則要求較長(zhǎng)，有的報(bào)告1個(gè)月，有的長(zhǎng)達(dá)40～50天，這是因?yàn)榘肟乖切》肿?，難以刺激機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)之故。免疫的總次數(shù)多，多為5～8次。如為蛋白質(zhì)抗原，第八次免疫未獲得抗體，可在30～50天后再追加免疫一次；如仍不產(chǎn)生抗體，則應(yīng)更換動(dòng)物。半抗原需經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間的免疫才能產(chǎn)生高效價(jià)抗體，有時(shí)總時(shí)間為一年以上。

　　三、動(dòng)物采血法

　　動(dòng)物免疫3～5天后，如抗血清鑒定合格（見下節(jié)），應(yīng)在末次免疫后5～7天及時(shí)采血，否則抗體將會(huì)下降。因故未及時(shí)取血，則應(yīng)補(bǔ)充免疫一次（肌肉、腹腔或靜脈內(nèi)注射，不加佐劑），過(guò)5～7天取血。

　　1．頸動(dòng)脈放血法這是最常用的方法，對(duì)家兔、山羊等動(dòng)物皆可采用。在動(dòng)物頸外側(cè)做皮膚切口，拉開皮膚后可見斜行的胸鎖乳突肌，將此肌鈍性分離并推向后方，即可見到淡紅色有彈性的總動(dòng)脈。將此動(dòng)脈輕輕游離（連同與之同行的迷走神經(jīng)），用絲線將遠(yuǎn)心端結(jié)扎，近心端用止血鉗夾住，另一止血鉗夾住動(dòng)脈迷走神經(jīng)，用以固定。沿結(jié)扎處剪斷血管，用固定止血鉗將斷端放入瓶口，慢慢打開夾持的止血鉗，動(dòng)脈血立即噴射入瓶。如此放血的速度快，動(dòng)物死亡也快，取血量略少于其他放血法。如在放血大約總量的一半時(shí)，暫時(shí)將動(dòng)脈夾住片刻，再繼續(xù)放血，得血量可以多些。

　　另外一種慢放血法是在動(dòng)脈內(nèi)插入一采血器，用閉式放血。在頸動(dòng)脈內(nèi)插入一較粗的玻璃管，將血管與玻璃管用線扎牢，玻璃管接一橡皮管引血入瓶，也極為方便。

　　2．心臟采血法此法多用于豚鼠、大鼠、雞等小動(dòng)物。采血技術(shù)應(yīng)熟練，穿刺不準(zhǔn)容易導(dǎo)致動(dòng)物急性死亡。

　　3．靜脈多次采血法家兔可用耳中央靜脈，山羊可用頸靜脈。這種放血法可隔日一次，有時(shí)可采集多量血液。如用耳靜脈切開法，一只家兔可采百余毫升血液（用頸動(dòng)脈放血最多可獲70～80ml，一般只有50ml左右）。用頸靜脈采集綿羊血，一次可放300ml，放血后立即回輸10％葡萄糖鹽水，三天后仍可采血200～300ml。動(dòng)物休息一周，再加強(qiáng)免疫一次，又可采血二次。如此，一只羊可獲1500～2000ml血液。小鼠取血往往采取斷尾或摘除眼球法，每鼠得血一般不超過(guò)2ml。

　　抗血清的分離多采用室溫自然凝固，然后放置37℃或4℃待凝塊收縮。前者迅速，但得血清較少；后者時(shí)間長(zhǎng)，有時(shí)還會(huì)出現(xiàn)溶血，但獲得血清多，而且效價(jià)不會(huì)下跌。

　　抗血清分出后是否要經(jīng)56℃30min滅活有兩種不同意見。一種認(rèn)為血清中有許多活性酶，特別是球蛋白的降解酶，如不清除，血清存放過(guò)程中將導(dǎo)致抗體效價(jià)下降。另外的意見認(rèn)為，這種自然降解是微不足道的，56加溫后，有些球蛋白會(huì)發(fā)生熱變性或者熱聚合。含這種聚合大分子蛋白的抗血清用于免疫濁度試驗(yàn)時(shí)，可因沉淀劑（如PEG）的加入而發(fā)生假性混濁。

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