細(xì)胞ELISA實(shí)驗(yàn)手冊(cè)

bluewing2003

一、福爾馬林固定細(xì)胞
1、用胰蛋白酶消化細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞；
2、收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)；
3、離心，1500rpm，10min；
4、用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞于適當(dāng)?shù)臐舛龋?/font>
上皮細(xì)胞4×105個(gè)細(xì)胞/ml，
纖維細(xì)胞2×105個(gè)細(xì)胞/ml；
5、滴加到96孔培養(yǎng)板中，100ul/孔；
6、37C環(huán)境孵育過夜；
7、用PBS洗板兩次；
8、每孔加125ul 10％福爾馬林緩沖液；
9、于室溫環(huán)境下固定15min；
10、用雙蒸水洗滌三次；
11、晾干；

12、貯存于2-8 C.

二、試劑：
1、PBS：1％ BSA
2、PBS：2％BSA
3、碳酸鹽緩沖液：
1.59g Na2CO3
2.93g NaHCO3
溶解于900ml雙蒸水中，檢測(cè)并調(diào)整pH至9.6，定容至1L；
4、10×底物液，pH6.0
36.6g一水合檸檬酸
113.5g
磷酸氫二鉀
溶解于900mL雙蒸水中，調(diào)pH至6.0，定容至1L；
5、0.3％H2O2：用雙蒸水按1：100稀釋30％的雙氧水
6、OPD貯存液，4.0％：4g OPD溶解于100ml雙蒸水，分裝后保存到-20 C,注意避光。
7、4.5N H2SO4
12.0mL濃硫酸
88.0ml雙蒸水混合

三、實(shí)驗(yàn)步驟：
1、用雙蒸水洗滌ELISA板兩次；
2、每孔加250ul含2％BSA的PBS；
3、37C孵育1h；
4、雙蒸水洗板三次；
5、每孔加50ul腹水，上清，或用含1％BSA的PBS稀釋后的稀釋品；
6、37C孵育2h；
7、雙蒸水洗板五次；
8、每孔加50ul用含1％BSA的PBS稀釋的HRP酶標(biāo)抗鼠IgG；
9、37C孵育1h；
10、用雙蒸水洗板5次。用碳酸鹽緩沖液洗兩次；
11、加工作濃度底物液50ul/孔，配方如下：

0.5ml 4.0％ OPD

5ul
30％H2O2

1.0 ml 10× 底物緩沖液

8.5ml 雙蒸水
12、在室溫下孵育20min；
13、加4.5N 硫酸溶液 25ul/孔；
14、在酶標(biāo)儀上測(cè)OD490波長的值。

注意：
1、檢測(cè)上清按1：5稀釋；
2、檢測(cè)腹水可按1：100稀釋