新 型 鴨 肝 炎 病 毒 的 分 離 及 初 步 鑒 定

peteryuanfeng

新 型 鴨 肝 炎 病 毒 的 分 離 及 初 步 鑒 定
蘇敬良1  , 黃 　瑜2  , 賀榮蓮3  , 趙繼勛1  , 郭玉璞1
(1.  中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 , 北京 　100094 ; 2. 福建農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所 , 福建 福州 　350013 ;
3. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院 獸醫(yī)研究所 , 廣西 南寧 　530001)
　　摘要: 從北京和廣西發(fā)病鴨群中分離到 2 株病毒 ,分別編號(hào)為B 株和 G株 ,病毒大小約 40 nm ,無囊膜。血清中和試驗(yàn)
表明 ,2 株病毒為同一血清型 ,與 1 、3 型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒無血清學(xué)相關(guān)性。人工感染試驗(yàn)表明 , G株對(duì)雛鴨具有很強(qiáng)
的致病性 ,可引起典型的鴨肝炎病變 ,但死亡率隨雛鴨日齡的增長(zhǎng)而明顯下降;B 株病毒不能致死正常雛鴨 ,但雛鴨經(jīng)過環(huán)
磷酰胺處理后 ,感染B 株病毒可引起雛鴨死亡 ,死亡鴨肝腫脹、出血。
　　關(guān)鍵詞: 新型鴨肝炎病毒; 鴨; 分離
中圖分類號(hào): S 852. 659. 6 　　　文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: B 　　　文章編號(hào): 1000    6419 (2002) 01    0015    02
　　1999 年 5 月北京、廣西等地 3～13 日齡北京鴨和櫻桃谷鴨
發(fā)生一種類似于 1 型鴨病毒性肝炎的疾病 ,死亡率 20 %～80 % ;
病鴨表現(xiàn)為突然發(fā)病、抽搐并很快死亡;剖檢可見肝腫脹 ,其表
面呈樹枝狀充血或有出血點(diǎn)、出血斑 ,膽囊充盈 ,腎輕度淤血。
取病死鴨肝做細(xì)菌分離培養(yǎng) ,結(jié)果為陰性;經(jīng)病毒分離分別從北
京和廣西的病料中各分離到 1 株病毒(編號(hào)為 B 株和 G 株)  ,經(jīng)
過鴨胚血清中和試驗(yàn)表明兩者為同一血清型 ,但與 1 、3 型鴨肝
炎病毒陽(yáng)性血清無交叉中和反應(yīng)[1～3 ] 。
1 　材料與方法
1. 1 　試驗(yàn)材料 　1 型鴨肝炎病毒: 雞胚適應(yīng)毒 65 代 , ELD50 為
10 - 6. 12/ 0. 1 mL ,由本室保存;鴨抗 1 型肝炎病毒陽(yáng)性血清:雞胚
中和效價(jià) ≥1∶64 ;抗 3 型鴨肝炎病毒陽(yáng)性血清:由美國(guó)康乃爾大
學(xué)B.  W.  Calnek 教授惠贈(zèng);鴨抗鴨瘟病毒陽(yáng)性血清:本室制備。
北京鴨胚及 1 日齡雛鴨:購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所; SPF
雞胚:山東家禽研究所秦卓明研究員提供;環(huán)磷酰胺:上海華聯(lián)
制藥有限公司生產(chǎn) ,批號(hào) 991109。
1. 2 　材料處理 　無菌取病死鴨肝按 1∶5 加入滅菌 PBS 后研磨 ,
-  20  ℃凍融 1 次 , 10 000 r/ min 離心 30 min ,取上清用 220 nm 針
頭式濾器過濾除菌。
1. 3 　病毒分離 　將上述處理材料經(jīng)尿囊腔途徑接種 9 日齡北
京鴨胚 ,0. 2 mL/ 胚 ,觀察鴨胚病變和死亡情況 ,收獲尿囊液并傳
代。
1. 4 　陽(yáng)性血清制備 　取 B 株第 4 代鴨胚尿囊液人工感染 7 日
齡雛鴨 ,接種 7 d 后仍存活 ,對(duì)存活的雛鴨于 10 d 后再用滅活的
尿囊液加強(qiáng)免疫 1 次 ,采血 ,分離血清。
1. 5 　病毒對(duì)鴨胚成纖維細(xì)胞適應(yīng)試驗(yàn) 　將分離的2 株病毒第4
代鴨胚尿囊液分別接種鴨胚成纖維細(xì)胞單層 ,盲傳 5 代后取細(xì)
胞培養(yǎng)液接種 9 日齡鴨胚 ,檢查病毒是否能夠在成纖維細(xì)胞中
增殖。
1. 6 　病毒對(duì) SPF 雞胚適應(yīng)試驗(yàn) 　取分離的 2 株病毒第 4 代鴨
胚尿囊液經(jīng)尿囊腔接種 SPF 雞胚 ,0. 2 mL/ 枚 ,盲傳 6 代后收獲
收稿日期: 2001    07    23
作者簡(jiǎn)介: 蘇敬良(1967   )  ,男 ,江西省金溪縣人 ,副教授 ,博士。
尿囊液返傳鴨胚 ,檢查分離株是否適應(yīng)雞胚。
1. 7 　分離毒株鑒定[2 ,3 ]
1. 7. 1 　乙醚敏感性試驗(yàn)  取第 4 代鴨胚尿囊液病毒 0. 8 mL 加
0. 2 mL 乙醚于滅菌離心管中 ,振蕩 10 min ,于 4   ℃放置24 h ,3
000 r/ min 離心 20 min ,吸取病毒液并反復(fù)吹打幾次使殘留乙醚
揮發(fā)后分別作 10 - 1～10 - 6稀釋 ,每個(gè)稀釋度接種 5 枚 9 日齡鴨
胚 ,設(shè)未加乙醚處理的病毒液作對(duì)照。觀察 7 d ,記錄鴨胚死亡
情況。
1. 7. 2 　鴨胚 ELD50測(cè)定  取B 株第 5 代及 G株第 4 代鴨胚尿囊
液毒分別作 10 - 1～10 - 6稀釋 ,接種 5 枚 9 日齡鴨胚 ,0. 1 mL/ 枚 ,
觀察 7 d ,記錄鴨胚死亡情況。
1. 7. 3 　血清中和試驗(yàn) 　分別將 56 ℃滅活的 1 型、3 型鴨肝炎病
毒性血清和鴨瘟病毒陽(yáng)性血清作1∶5 、1∶10 和1∶40 稀釋 ,并與分
離得到的病毒第 5 代尿囊液(100ELD50 ) 等量混合 ,4  ℃過夜 ,每
個(gè)稀釋度接種 5 枚鴨胚 ,0. 2  mL/ 枚 ,同時(shí)設(shè)病毒液對(duì)照 ,0. 1
mL/ 枚 ,觀察 7 d ,記錄鴨胚死亡情況。抗B 株病毒陽(yáng)性血清與 1
型肝炎病毒及 G株病毒交叉中和試驗(yàn) ,操作步驟與上述相同。
1. 7. 4 　電鏡觀察  取死亡鴨胚肝經(jīng)戊二醛固定后做超薄切片 ,
觀察細(xì)胞中病毒粒子。另取鴨胚尿囊液經(jīng) 10 000 r/ min 離心 60
min 后取上清 ,經(jīng) 40 000 r/ min 離心 2 h ,棄上清并用少量蒸餾水
懸浮沉淀 ,再將懸液滴加至250 g/ L 的蔗糖墊上重新超離1 次除
去部分雜質(zhì) ,取沉淀并去除蔗糖后用 20 mL/ L 磷鎢酸負(fù)染 ,透射
電鏡觀察病毒的形態(tài)。
1. 8 　攻毒試驗(yàn)
1. 8. 1 　B 株
1. 8. 1. 1 　取B 株第 5 代鴨胚尿囊液分別經(jīng)腿部注射 2 日齡和 7
日齡鴨各 10 只 ,0. 5 mL/ 只 ,觀察 7 d。
1. 8. 1. 2 　將飼養(yǎng)于正壓隔離器中的 16 只 1 日齡雛鴨 ,于 2 、3 日
齡 2 次腿肌注射環(huán)磷酰胺 ,4 mg/ 只;4 日齡時(shí)經(jīng)腿內(nèi)側(cè)注射第 5
代鴨胚尿囊液毒 ,0. 5 mL/ 只 ,共 11 只;另 5 只作對(duì)照 ,攻毒后于
隔離器中飼養(yǎng)觀察 7 d。飼料和飲水均經(jīng)過無菌處理。
1. 8. 2     G株 　取 G株第 4 代尿囊液毒腿部注射感染 3 批雛鴨 ,
分別為 2 、7 和 13 日齡雛鴨各 10 只 ,0. 2 mL/ 只 ,每批設(shè) 6 只空白
對(duì)照 ,攻毒后觀察 7 d。2 　結(jié)果
2. 1 　病毒分離 　將處理的病料接種鴨胚后 96 h 內(nèi)可 100 %致
死鴨胚 ,可見胚體水腫、出血 ,肝出血或有白色壞死點(diǎn)。鴨胚尿
囊液傳代毒接種鴨胚成纖維細(xì)胞連續(xù) 5 代均不產(chǎn)生細(xì)胞病變;
細(xì)胞培養(yǎng)液毒接種鴨胚不能致死鴨胚。經(jīng) SPF 雞胚中連續(xù)傳 5
代 ,雞胚發(fā)育正常 ,試驗(yàn)表明分離的 2 株病毒不能在鴨胚成纖維
細(xì)胞和雞胚中增殖。
2. 2     乙醚敏感性試驗(yàn)  將 2 株病毒經(jīng)過乙醚處理后接種鴨
胚 ,鴨胚死亡和病變情況與未經(jīng)乙醚處理的對(duì)照組無差異 ,證明
所分離的病毒為無囊膜病毒。
2. 3     鴨胚 ELD50測(cè)定  B 株第 5 代鴨胚尿囊液 ELD50  = 10 - 4. 23/
0. 1 mL ;  G株第 4 代尿囊液 ELD50  = 10 - 4. 12/ 0. 1 mL 。
2. 4     中和試驗(yàn) 　1 、3 型鴨肝炎病毒陽(yáng)性血清及鴨瘟病毒陽(yáng)性
血清對(duì) 2 株分離病毒均無中和作用 ,抗 B 株病毒陽(yáng)性血清對(duì) 1
型鴨肝炎病毒 65 代雞胚適應(yīng)毒無中和作用 ,而對(duì) G株病毒的中
和效價(jià) ≥1∶40 ,說明B 株病毒和 G株病毒為同一血清型 ,但與目
前所報(bào)道的 1 、3 型鴨肝炎病毒不同。
2. 5 　病毒形態(tài)觀察  電鏡下 ,鴨胚的肝超薄切片細(xì)胞質(zhì)和超離
沉淀負(fù)染樣本中可見到少量 40 nm 左右的無囊膜病毒;切片中
未發(fā)現(xiàn)有晶格狀排列的病毒粒子。
2. 6 　動(dòng)物感染試驗(yàn)
2. 6. 1 　B 株病毒人工感染雛鴨不能引起發(fā)病和死亡;經(jīng)過環(huán)磷
酰胺處理的雛鴨攻毒后 72  h 開始死亡 ,至觀察結(jié)束共死亡 8
只(8/ 11)  ,剖檢可見肝腫脹、充血 ,少數(shù)有出血斑和條狀出血。
2. 6. 2 　G株病毒人工感染雛鴨可引起明顯的發(fā)病和死亡 ,但隨
著雛鴨日齡增大 ,死亡率明顯下降。2 日齡感染鴨死亡率為
80 %(8/ 10)  ,7 日齡為 40 %(4/ 10)  ,13 日齡組未表現(xiàn)發(fā)病癥狀和
死亡(0/ 10) 。大多數(shù)雛鴨在感染后 24～48 h 死亡 ,雛鴨臨死前
出現(xiàn)明顯的神經(jīng)癥狀、抽搐 ,并很快死亡。剖檢可見肝明顯腫
脹 ,肝表面有大量的出血點(diǎn)、出血斑 ,死亡時(shí)間越短的病鴨其肝
表面出血越嚴(yán)重 ,96 h 左右死亡鴨肝表面出血點(diǎn)明顯減少。
3 　小結(jié)和討論
3. 1 　從北京和廣西兩地區(qū)發(fā)病鴨中分離到 2 株病毒 ,經(jīng)過中和
試驗(yàn)表明兩者為同一血清型 ,與 1 、3 型鴨肝炎病毒無血清學(xué)相
關(guān)性。此結(jié)果與臨床上對(duì)發(fā)病鴨群使用 1 型鴨肝炎弱毒疫苗或
高免卵黃抗體進(jìn)行預(yù)防或治療無效相一致 ,另外從病理組織學(xué)
觀察發(fā)現(xiàn)(另文報(bào)道)  , G 株病毒人工感染鴨引起的病變與 1 型
肝炎病毒有所不同。因此 ,本研究將分離到的病毒暫時(shí)定為新
型鴨肝炎病毒 ,對(duì)其理化及分子生物學(xué)特性有待于進(jìn)一步研究 ,
從而確定其分類地位。
3. 2 　對(duì)分離株人工感染試驗(yàn)表明 ,2 株病毒對(duì)雛鴨的致病力有
很大的差異 ,在臨床上由 B 株引起雛鴨的死亡率約為 20 % ,連
續(xù)感染的 5 批鴨雛均在 6 日齡開始出現(xiàn)死亡 ,12 日齡左右停止;
剖檢死亡鴨可見肝腫脹、邊緣樹枝狀充血 ,未見典型的肝出血變
化。由 G株感染雛鴨則表現(xiàn)為急性發(fā)病和大量死亡 ,與 1 型鴨
肝炎病毒感染極為相似。調(diào)查發(fā)現(xiàn) ,由 B 株鴨肝炎病毒在臨床
上引起的雛鴨發(fā)病 ,可能與鴨場(chǎng)的飼養(yǎng)管理?xiàng)l件差有一定的關(guān)
系。
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