抗菌藥物敏感性試驗(yàn)

曹志誠

抗菌藥物敏感性試驗(yàn)

    （一）藥敏試驗(yàn)的目的
測(cè)定病原微生物對(duì)化學(xué)治療藥物敏感性的試驗(yàn)稱為化療藥物敏感性試驗(yàn)（Drug sensitivity test），簡(jiǎn)稱藥敏試驗(yàn)。藥敏試驗(yàn)的主要目的是：①
用于測(cè)定新的抗菌藥物或制劑的抗菌譜；②
對(duì)病灶分離菌進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，主要應(yīng)用于測(cè)定細(xì)菌經(jīng)過多年后敏感性的變化情況和地區(qū)特異性；③ 在臨床治療感染性疾病時(shí)，針對(duì)病原菌選擇合適的首選藥物品種。
    （二）藥敏試驗(yàn)的原理及種類
藥敏試驗(yàn)是通過培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)菌確定細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性方法。將被檢菌接種在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上，然后加上不同種類或不同濃度的抗菌藥物（或制劑），觀察細(xì)菌生長(zhǎng)發(fā)育的速度和程度。用藥后，細(xì)菌在培養(yǎng)基上停止生長(zhǎng)并且死亡，抑菌圈清晰，說明細(xì)菌對(duì)藥物敏感，藥物表現(xiàn)有較強(qiáng)的殺菌作用；用藥后，細(xì)菌停止生長(zhǎng)，但液體培養(yǎng)基經(jīng)過一定時(shí)間后還可能出現(xiàn)渾濁或固體培養(yǎng)基上的抑菌圈不清晰，說明細(xì)菌對(duì)藥物比較敏感，預(yù)示藥物對(duì)被檢細(xì)菌只是起抑菌作用。通常判定一種藥物對(duì)細(xì)菌的殺菌或抑菌作用的強(qiáng)度指標(biāo)是固體培養(yǎng)基中抑菌圈的大小，但這也不是絕對(duì)的，因?yàn)橐志Φ拇笮∨c藥物對(duì)培養(yǎng)基的滲透性是密切相關(guān)的。
藥敏試驗(yàn)方法較多，但在原理上不外乎是稀釋法和擴(kuò)散法兩大類。而擴(kuò)散法（包括紙片法、管碟法）通常適用于臨床治療選擇藥物。
    （三）常用培養(yǎng)基制作法
1．普通肉湯培養(yǎng)基
牛肉浸膏     3.0克
蛋白胨       10.0克
氯化鈉       5.0克
蒸餾水       1000毫升
放在三角燒瓶中，微溫溶解后，調(diào)節(jié)pH值至7.4~7.6，煮沸10分鐘，冷卻后的pH值為7.2±0.2。15磅壓力下滅菌15分鐘（115℃滅菌30分鐘）即得。
本培養(yǎng)基可用作為固體、鑒別、選擇等培養(yǎng)基制造的基礎(chǔ)原料，大部分細(xì)菌都能在其中生長(zhǎng)。
1． 普通肉湯瓊脂培養(yǎng)基
    照上述普通肉湯培養(yǎng)基的配方及制法，加入15~20克瓊脂，加熱溶解后，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.2±0.2，分裝，115℃滅菌30分鐘，即得。
3．0.5%葡萄糖肉湯培養(yǎng)基
蛋白胨       10克
氯化鈉       5克
葡萄糖       5克
牛肉浸膏     3克
蒸餾水       1000毫升
微溫溶解后，調(diào)節(jié)pH值至弱堿性，煮沸后，加葡萄糖溶解，搖勻，濾清，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.2±0.2，分裝，115℃滅菌30分鐘，即得。
    4．馬丁氏（Martin’s）肉湯培養(yǎng)基
         蛋白胨液         500毫升
         肉浸液           500毫升
         冰醋酸           1毫升
         醋酸鈉           6克
         葡萄糖           10克
     將蛋白胨與肉浸液混合，加熱至80℃，加冰醋酸1毫升，攪拌均勻，再煮沸5分鐘，加15%氫氧化鈉20毫升，調(diào)整pH至7.2。加醋酸鈉6克，再調(diào)整pH至7.2。繼續(xù)煮沸10 分鐘，用濾紙過濾，每1000毫升濾液加葡萄糖10克，分裝于500毫升三角燒瓶，高壓蒸汽滅菌（15磅）15 分鐘。
本培養(yǎng)基可用作傳染性胸膜肺炎病原體等的分離與培養(yǎng)。
5．革蘭氏陰性菌（G-N）增菌培養(yǎng)基
    胰蛋白胨      20克          去氧膽酸鈉            0.5克
    葡萄糖         1克          無水磷酸二氫鉀          4克
    甘露醇         2克          無水磷酸氫二鉀        1.5克
    枸櫞酸鈉       5克          氯化鈉                  5克
                                 水                  1000毫升
將各組分加熱溶化，調(diào)整pH值至7.0，用濾紙過濾；分裝于18×100毫米小試管中，每管約1.5毫升，高壓蒸汽滅菌（15磅）15 分鐘，置冰箱備用。
用于糞便選擇性疾病桿菌，樣本接種后，最初6小時(shí)無論在室溫還是在37℃都有增菌作用。而在這一時(shí)期中，大腸桿菌和變形桿菌等生長(zhǎng)很少，故在6小時(shí)后，再作用平板分離。
    （四）臨床用藥選擇藥敏試驗(yàn)法——擴(kuò)散法（Diffusion method）
擴(kuò)散法是在瓊脂培養(yǎng)基（多采用平板培養(yǎng)基）上接種被檢菌，將藥物（藥劑）配成一定濃度加在培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一定時(shí)間后觀察接種菌是增殖還是抑制.這是測(cè)定藥物（藥劑）對(duì)被檢菌抗菌力強(qiáng)度的方法，本法可用于多種藥物（藥劑）對(duì)一種細(xì)菌的抗菌作用進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，有利于為臨床選擇藥物。
首先把可流動(dòng)的固體培養(yǎng)基（加熱后的固體培養(yǎng)基）平鋪在平皿內(nèi)冷卻使其凝固，在其表面上將菌液（被檢菌）均勻地涂抹開（也可將培養(yǎng)基溶解后在其凝固前將菌液與之稀釋制成雙碟，見后）。然后在其中以適當(dāng)?shù)拈g隔放置已知濃度的藥物（藥劑）（例如含有藥劑的紙片、片劑、濾紙、小鋼管等），藥液（藥物）向培養(yǎng)基內(nèi)及其周圍滲透擴(kuò)散。將上述的平皿放在一定的條件下（通常為37℃）的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時(shí)間（通常為16~24h）。以是否形成抑菌圈或抑菌帶及其抑菌圈大小來判定被檢菌對(duì)藥物的敏感性，測(cè)定藥物（藥劑）的抗菌強(qiáng)度。
1．敏感性圓片法（Sensitivity disc method）
本法所使用的圓片即含有一定量的抗菌藥物的干燥圓形濾紙（或片劑）。使用這些圓片檢查病料中細(xì)菌的敏感性的方法有間接法和直接法兩種。間接法是將膿汁、血清、糞便濾液等臨床材料在不含藥物的分離培養(yǎng)基中進(jìn)行分離培養(yǎng)后，采取分離培養(yǎng)的典型菌落進(jìn)行敏感性試驗(yàn)。直接法是將病料直接涂抹在瓊脂培養(yǎng)基上，在其上放置含藥紙片進(jìn)行培養(yǎng)觀察細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性方法。在接種有病原菌的瓊脂培養(yǎng)基上，放置含有藥劑的紙片的地方，如果其藥物對(duì)病菌有抑制作用，則在其紙片的周圍會(huì)出現(xiàn)抑菌圈或抑菌帶，測(cè)量其抑菌圈（帶）的有無及其大小就可能判定菌株對(duì)藥物的敏感性。
直接法以非混合感染只含有某一種細(xì)菌的膿汁、血清、糞便濾液等作為被檢材料時(shí)，其優(yōu)點(diǎn)是它比間接法能更快地得到結(jié)果，縮短藥敏試驗(yàn)的時(shí)間。但若在被檢材料中除目的病原菌以外，還混有其他細(xì)菌則會(huì)給結(jié)果判定帶來困難。間接法雖然需要時(shí)間，但能從臨床病料中較準(zhǔn)確地測(cè)定目的病原菌對(duì)藥物的敏感性。
（1）單一藥物濃度圓片法
即采用含有一種藥物濃度的圓片所進(jìn)行的藥敏試驗(yàn)法。其操作過程如下：
    瓊脂平板用培養(yǎng)基制備  要求培養(yǎng)基中不含使藥物抗菌力降低的成分，而且應(yīng)選擇對(duì)多種細(xì)菌都能生長(zhǎng)發(fā)育良好的培養(yǎng)基（見普通肉湯 培養(yǎng)基）。
平板的制備  將融化的瓊脂培養(yǎng)基約20毫升倒入內(nèi)徑為85~90毫米的玻璃或塑料平皿中制成平板，操作應(yīng)在水平的平面上進(jìn)行，使培養(yǎng)基均勻水平地分布在平皿內(nèi)（有要求血液的被檢菌時(shí)，如鏈球菌、肺炎球菌、白喉菌、巴氏桿菌等）應(yīng)在普通肉湯瓊脂培養(yǎng)基中加5%的血液。瓊脂平板凝固后，在接種前應(yīng)放在孵化器中30 分鐘使瓊脂表面水汽干燥。
菌量及接種法  被檢菌液，用滅菌生理鹽水等制備成5×108個(gè)/毫升的菌液，用1白金耳（約0.05毫升）在瓊脂培養(yǎng)基表面上接種，接種采用直徑為4~6毫米的滅菌玻璃球20個(gè)滾動(dòng)使菌液均勻涂布在整個(gè)平皿瓊脂平板的表面（約使瓊脂表面的菌數(shù)為1~10×104/cm2）。
圓片的放置與培養(yǎng)  用滅菌鑷子輕輕地夾起含藥圓片，放置在培養(yǎng)基的表面，使圓片與瓊脂面緊密相貼，通?？稍谝粋€(gè)平板培養(yǎng)基上等間隔放置3~6個(gè)圓片，放置圓片后立即放到37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（16~24小時(shí)，平皿應(yīng)蓋上陶瓷蓋）。
結(jié)果判定
培養(yǎng)后，測(cè)定圓片周圍抑菌圈的直徑，將該藥劑對(duì)被檢菌敏感性的抑菌圈直徑與敏感標(biāo)準(zhǔn)的抑菌圈相比較，判定結(jié)果分為4級(jí)：最敏感（+++）；相當(dāng)敏感（++），稍敏感（+）；耐藥（-）。另外，用本法，根據(jù)其抑菌圈的出現(xiàn)可求出最小抑菌濃度（MIC）。由于各種因素如培養(yǎng)基種類、平板培養(yǎng)基厚度、接種的菌量、藥物在培養(yǎng)基中的擴(kuò)散能力、培養(yǎng)時(shí)間，均能影響試驗(yàn)結(jié)果。因此測(cè)定時(shí)應(yīng)盡可能將試驗(yàn)條件保持一致，降低測(cè)定誤差。
（2）三種濃度圓片法
本法是采用一種藥物（藥劑）含有高、中、低3個(gè)等級(jí)藥物濃度的圓片組成的藥敏試驗(yàn)法。操作過程與上述一種濃度法基本相同，但在判定時(shí)不需再測(cè)定抑菌圈直徑，因此，培養(yǎng)基的種類、培養(yǎng)基量、接種菌量對(duì)結(jié)果的判定影響不是十分明顯，且在一個(gè)平板上可放置3種（9片）紙片。
判定方法  根據(jù)含藥圓片周圍有無抑菌圈來確定其敏感性。具體地說，從圓片周邊算起有1毫米以上的抑菌圈時(shí)均為陽性，1毫米以下為陰性。高中低三種濃度圓片都有抑菌圈時(shí)為（+++）極敏感；僅中高濃度有抑菌圈時(shí)為較敏感（++）；僅高濃度有抑菌圈時(shí)為比較有耐藥性；高濃度圓片也無抑菌圈時(shí)為有耐藥性。

2．管碟法
（1）器械  瓊脂平皿、無菌吸管、無菌小鋼管（牛津杯）、無菌鑷子、無菌滴管、游標(biāo)卡尺。
（2）分離并培養(yǎng)被檢菌種  將病料如膿汁、血液、糞便濾液、組織放在分離選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑起典型目的菌落，增殖培養(yǎng)制取菌液并對(duì)被檢菌液進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。
（3）雙碟制備  肉湯瓊脂培養(yǎng)基底層：將肉湯瓊脂培養(yǎng)基液化，取10毫升倒入滅菌玻璃平皿內(nèi)，放在水平平面上，使培養(yǎng)基水平均勻地鋪在平皿內(nèi)；肉湯瓊脂培養(yǎng)基菌層：吸取被檢菌液（106~108個(gè)/毫升）0.1~1毫升分別與100毫升冷至45—50℃的肉瓊脂培養(yǎng)基混勻，取5毫升均勻攤布在底層培養(yǎng)基上。即得雙碟。
（4）待雙碟中培養(yǎng)基凝固后，在每碟中均勻放置小鋼管（即牛津杯，內(nèi)徑6.0±0.1毫米，高10.0±0.1毫米，外徑7.8±0.1毫米）4~6個(gè)，用陶瓦蓋復(fù)蓋。
（5）然后將不同種類不同濃度的藥液用無菌滴管加入小鋼管中（不同濃度的藥液以100微克/毫升為起點(diǎn)，用2倍稀釋法，使其藥液效價(jià)為100、50、25、12.5……0.025微克/毫升）。用蒸餾水作對(duì)照。
（6）置37℃恒溫箱中培養(yǎng)16~24小時(shí)，用游標(biāo)卡尺量取抑菌圈的大小，判定其結(jié)果：
① 如果抑菌圈清晰，即表示為殺菌作用；
② 如果有抑菌圈，但不清晰，即表示為抑菌作用；
③ 在一定的范圍，抑菌圈的大小一般與藥物作用（抗菌）成正比例；
④ 如果抑菌圈比小鋼管（牛津杯）的外徑7.8毫米大1毫米，即表示有抑菌作用，因此可根據(jù)這一標(biāo)準(zhǔn)，通過試驗(yàn)找出某一藥物對(duì)某一病菌的最小抑菌濃度（MIC）；
⑤ 如果沒有抑菌圈即表示耐藥。                          (操繼躍)