常規(guī)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目操作規(guī)程

曹志誠(chéng)

常規(guī)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目操作規(guī)程

一、細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定

（一）細(xì)菌的分離接種

1、平板劃線(xiàn)分離法：

以滅菌接種環(huán)取待檢材料少許，左手打開(kāi)平皿蓋，使蓋與底成30度角，將材料先涂于培養(yǎng)基平板上的一邊，作為第一段的劃線(xiàn)，然后將接種環(huán)置于火焰上滅菌，再以該接種環(huán)的第一段劃線(xiàn)處相交接依次劃線(xiàn)數(shù)次為第二段劃線(xiàn)，再如上法滅菌，接種劃線(xiàn)，依次劃至最后一段，滅菌接種環(huán)。這樣每一段劃線(xiàn)內(nèi)的細(xì)菌逐漸減少，即能獲得單個(gè)菌落，劃線(xiàn)時(shí)接種環(huán)應(yīng)與培養(yǎng)基面平行，并應(yīng)盡量將接種環(huán)放平，可以減少劃破培養(yǎng)基的現(xiàn)象。劃線(xiàn)間的距離寬窄要適宜，一般以相距0.5厘米左右為宜。最后一段劃線(xiàn)不要與第一段劃線(xiàn)相交。接種材料后肉湯培養(yǎng)基中含菌數(shù)量不太多時(shí)，可用滅菌接種環(huán)取待檢材料，在平板表面的一角涂布后，由左右兩邊向下移動(dòng)連續(xù)平行線(xiàn)，直至劃滿(mǎn)整個(gè)平板表面。接種材料后，蓋好平皿蓋倒置于37℃溫箱中培養(yǎng)。

2、斜面分離法；

每份待檢材料用三支斜面培養(yǎng)基，以滅菌接種環(huán)沾取少許病料，放在第一管斜面培養(yǎng)基底部的凝結(jié)水中，共移三接種環(huán)，輕輕混合，依次由第一管向第三管移三接種環(huán)混合液，將斜面稍平放，使凝結(jié)水由底部向斜面流動(dòng)，左右傾斜，讓凝結(jié)水布滿(mǎn)斜面表面，然后將培養(yǎng)基直立，置于37℃培養(yǎng)，由于病料的遞次稀釋?zhuān)诙?、三斜面上?？沙霈F(xiàn)單個(gè)菌落。

3、平板傾注法：

取數(shù)管已溶化的深層瓊脂或含有特殊物質(zhì)的瓊脂，用記號(hào)筆標(biāo)記順序后，置于50℃恒溫水箱中，以滅菌接種環(huán)或毛細(xì)吸管取材料少許加入第一管中，將試管放于兩手掌中搓轉(zhuǎn)片刻使材料在培養(yǎng)基中混合均勻，從第一管中取材料1-3接種環(huán)，加入第二管中，混勻后，取材料加入第三管中，如此將全部培養(yǎng)基接種完畢。取相同數(shù)量的滅菌平皿，標(biāo)記后，將各管中的材料分別傾于相應(yīng)的平皿中，并使之均勻分布，待凝固后，將平皿倒置于溫箱中培養(yǎng)，此法不僅用于分離培養(yǎng)，而且可用作材料中活菌的記數(shù)。

（二）細(xì)菌的純培養(yǎng)

待檢材料中的細(xì)菌經(jīng)上述方法分離培養(yǎng)后，取出加以檢查。先用肉眼觀察長(zhǎng)出的菌落是純一的，還是混雜的。多數(shù)情況下，沿涂布劃線(xiàn)處長(zhǎng)出較多的一種菌落，是材料中的病原菌的可能性較大，少數(shù)零散的菌落多為在操作過(guò)程中由外界進(jìn)入的雜菌。為慎重，可挑取一部分菌落，制成革蘭氏染色片，置于鏡下檢查，如片中的細(xì)菌的形態(tài)和染色性統(tǒng)一，則用滅菌接種環(huán)仔細(xì)挑取該菌落的剩余部分，接種在適當(dāng)培養(yǎng)基上，置溫箱中培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)出后，再經(jīng)肉眼及染色片的鏡檢證明統(tǒng)一后，即成為該菌的純培養(yǎng)。

（三）細(xì)菌的生化鑒定

細(xì)菌在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，由于它的分解代謝和合成代謝作用，可使培養(yǎng)基中的某些物質(zhì)轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)，由于細(xì)菌的種類(lèi)不同，它們的代謝產(chǎn)物也不同。細(xì)菌的代謝活動(dòng)是受細(xì)菌本身所具有的酶控制的，細(xì)菌的種類(lèi)不同，它們所具有酶也不同。這些代謝產(chǎn)物和酶，可以利用化學(xué)方法檢查出來(lái)，這種方法可以叫生化實(shí)驗(yàn)，生化實(shí)驗(yàn)在鑒定細(xì)菌種類(lèi)上有十分重要的作用。

1、大腸桿菌生化特性：葡萄糖○乳糖○甘露醇○阿拉伯糖+吲哚+甲基紅+VP-尿素酶-明膠液化-硫化氫-動(dòng)力+/-檸檬酸鹽利用-

2、沙門(mén)氏菌生化特性：葡萄糖產(chǎn)氣+乳糖-蔗糖-水楊素-側(cè)金盞花醇-靛基質(zhì)-甲基紅+VP-硫化氫+/尿素-明膠-丙二酸鈉-氫化鉀-動(dòng)力+賴(lài)氨酸脫羧酶+苯丙氨酸脫氨酶-檸檬酸鹽+

3、巴氏桿菌生化特性；葡萄糖+果糖+半乳糖+蔗糖+肌醇-菊糖-麥芽糖-水楊素-鼠李糖-吲哚+尿素醇-氧化酶+接觸酶+筋膠液化-硝酸鹽還原+動(dòng)力-溶血-麥康上生長(zhǎng)-

二、藥敏試紙片的制備

（一）配制試劑：

1、PH6.0    磷酸鹽緩沖液

磷酸氫二鉀  0.2克  磷酸二氫鉀   0.8克  蒸餾水 加至100毫升  

15磅高壓20分鐘備用

2、PH3.0  枸櫞酸緩沖液

枸櫞酸   0.7克   磷酸氫二鈉   0.3克   蒸餾水 加至100毫升

15磅高壓20分鐘備用

3、PH7.8～8.0  磷酸鹽緩沖液

磷酸二氫鉀 0.0523克  磷酸氫二鉀1.672克  蒸餾水 加至100毫升

15磅高壓20分鐘備用

4、1N鹽酸

鹽酸     0.9毫升     蒸餾水  加至10毫升搖勻

5、蒸餾水若干滅菌備用。

（二）藥敏片的制備：

1、藥物與溶劑使用量

藥名	藥量(mg)	溶液	溶液量(ml)	代 號(hào)	藥名	藥量(mg)	溶 液	溶液量（ml）	代 號(hào)
青霉素	10	PH6.0	4	1	痢菌凈	10	水	10	18
新霉素	20	PH6.0	10	2	諾美殺星	20	水	5	15
氨芐青霉素	10	PH6.0	2.5	3	百病消	0.2	水	50	16
慶大霉素	0.5	PH6.0	5	4	先鋒6	20	水	15.5	21
土霉素	20	PH3.0	5	5	阿莫西林	30	水	25	22
鏈霉素	40	PH7.8	13.1	6	力克霉素	40	水	5	23
紅霉素	10	水	4	7	環(huán)丙殺星	20	水	10	24
氯霉素	40	水	10	8	強(qiáng)力霉素	30	水	15	30
痢特靈	40	水	10	9	喹乙醇	20	水	10	11
氟派酸	20	水	10	10	恩諾殺星	20	水	50	12

2、制備過(guò)程：

（1）新華濾紙打出直徑6mm的紙片，打上代號(hào)，裝入青霉素小瓶?jī)?nèi)，每瓶100片15磅高壓滅菌20分鐘，取出后烘干備用。

（2）按要求配制藥液，然后取藥液1ml加入有紙片的小瓶?jī)?nèi)，使紙片完全浸透藥液，4℃冰箱放置1～2小時(shí)，取出用無(wú)菌鑷子將紙片一張張平鋪在無(wú)菌平皿內(nèi)，置37℃溫箱，將平皿蓋開(kāi)一小縫，以便放出蒸汽，約2～3小時(shí)，待干燥后裝入無(wú)菌青霉素小瓶?jī)?nèi)，加塞，放入有干燥劑的容器內(nèi)，冷暗處保存?zhèn)溆谩?/font>

3、說(shuō)明：

（1） 金霉素、土霉素、四環(huán)素等通常用PH3.0枸櫞酸緩沖液稀釋。

（2） 青霉素、慶大霉素、卡挪霉素等用PH6.0磷酸緩沖注液稀釋。

（3） 對(duì)PH要求不嚴(yán)格的藥物，如磺胺類(lèi)藥物可用蒸餾水稀釋。

（4） 有些不溶于水的藥物，可選擇可溶解它的溶劑先溶解后再稀釋?zhuān)缢沫h(huán)素用HCL溶解，氯霉素、紅霉素等用95%乙醇溶解。

三、染液的配制

（一）改良的革蘭氏染色法

1、染液的配制

（1）結(jié)晶紫染液   結(jié)晶紫1克，蒸餾水100毫升。

（2）革蘭氏碘液  碘片10克，碘化鉀20克，蒸餾水1000毫升。

（3）脫色劑   95%乙醇2份，丙酮（化學(xué)純）1份。

（5） 復(fù)染劑  沙黃1克，蒸餾水100毫升。

2、染色法

（1）抹片，空氣干燥，緩慢通過(guò)火焰2-3次固定。

（2）用結(jié)晶紫染液染色約1分鐘。

（3）直接加革蘭氏碘液于抹片上（不同法去結(jié)晶紫）助染約1分鐘。

（4）水洗后，加脫色劑，反復(fù)沖洗。

（5）水洗后，用沙黃液復(fù)染約30秒鐘。

（6）水洗后，用濾紙吸干、鏡檢。

（二）瑞氏染色法

1、染液配制：瑞氏染色劑粉0.1克，純粹白甘油1.0毫升，中性甲醇60.0毫升。

置染料于一個(gè)干凈的乳缽中，加甘油后研磨至完全細(xì)末，再加入甲醇使其溶解，溶解后盛于棕色瓶中經(jīng)一星期，過(guò)濾于中性的棕色瓶中，保存于暗處，該染色劑保存時(shí)間越久，染色的色澤愈鮮。

2、染色法

（1） 涂片任其自然干燥。

（2）加染色液約1毫升于涂片上，染色1分鐘，使標(biāo)本被染液中的甲醇所固定。

（3）再加上與染液等量的磷酸鹽緩沖液（或自來(lái)水）用口吹氣，使染液與蒸餾水充分混合，并防止染液的沉淀，經(jīng)5分鐘左右，使表面顯金屬的閃光。

（4）蒸餾水沖洗后，用濾紙吸干、鏡檢。

四、玻璃器皿的準(zhǔn)備

（一）處理

1、新購(gòu)入玻璃器皿的準(zhǔn)備：新購(gòu)玻璃器皿常附著有游離的堿質(zhì)，不可直接使用，用前必須先用洗衣粉水或清水洗凈，然后在1%～2%鹽酸溶液中浸泡24小時(shí)，以中和其堿質(zhì)，最后用清水洗凈鹽酸，干燥后備用。

2、用后玻璃器皿的處理：凡被病原微生物污染過(guò)的玻璃器皿，在洗滌前必須先進(jìn)行嚴(yán)格消毒。

（1）一般玻璃器皿（如平皿、試管、燒杯、三角瓶等）均可放在高壓消毒器內(nèi)在15磅壓力下滅菌20～30分鐘。

（2）吸管、玻片、蓋玻片等可浸泡于5%石炭酸或其他的消毒劑溶液中48小時(shí)。浸泡吸管的玻璃筒底部應(yīng)鋪以紗布棉墊，以防投入吸管時(shí)管尖破裂。吸過(guò)血清、血液的吸管，若無(wú)病菌污染，可立即用清水沖洗。

（3）盛有固體培養(yǎng)基（如瓊脂）或油脂（如液體石蠟、凡士林）的玻璃器皿，應(yīng)于消毒后趁熱將其中的培養(yǎng)基或油脂倒凈，并單獨(dú)用溫水洗凈，以免污染其他玻璃器皿。

（4）凡盛有血液或血清的試管或玻璃瓶等，在高壓滅菌之前，必須將其中血清或血液倒入一燒杯中（無(wú)病菌污染的血清和血液可直接用清水洗凈），然后洗凈再進(jìn)行滅菌。

（5）凡曾吸取瓊脂的吸管，不論是否需要消毒，均應(yīng)于用后立即用熱水沖洗干凈，然后再進(jìn)行消毒，否則瓊脂凝固，不易沖洗。

（二）洗滌

1、一般玻璃器皿的洗滌

（1）將消毒處理過(guò)的玻璃器皿浸泡于清水中，用毛刷或試管刷沾洗衣粉，若器皿上有油污或記號(hào)筆標(biāo)記，用熱水刷洗。最后用清水沖洗2～3次。

（2）經(jīng)清水沖洗后，如仍有污跡，可用清潔液浸泡24小時(shí)，取出用清水沖洗干凈。如不能立刻刷洗，也應(yīng)用清水浸泡，以免干燥后不易洗刷。

2、吸管的洗滌

（1）將吸管從消毒劑中取出后，先用細(xì)鐵絲取出管口的棉塞，若棉塞太緊不易取出時(shí)，可將鐵絲尖端壓扁，插入棉塞與管壁之間，輕輕一轉(zhuǎn)即可將棉塞拉出。

（2）將吸管浸泡于洗衣粉水中，以特制的毛刷或尖端纏有少許棉花的細(xì)鐵絲洗刷吸管內(nèi)部，鐵絲尖端的棉花應(yīng)隨時(shí)更換。

（3）以膠皮管一根，一端接沖洗球，另一端接吸管的尖端，在清水中反復(fù)沖洗數(shù)次。若仍有污跡，再按（2）處理或置于清潔液缸內(nèi)浸泡24小時(shí)，取出后充分水洗。

（4）洗凈的吸管最后再用蒸餾水沖洗一遍，倒立于底部墊有棉花的鐵絲筐中晾干。

3、玻片的洗滌  取出經(jīng)過(guò)消毒的玻片放入洗衣粉水中煮沸10分鐘，然后用紗布沾洗衣粉擦洗，再經(jīng)清水沖洗，放入清潔液中過(guò)夜，取出后用水洗去清潔液。

4、云霧狀玻璃器皿的洗滌：凡玻璃器皿上有云霧狀而不能用普通方法洗凈時(shí)，可用清潔液浸泡24小時(shí)，再以清水洗去清潔液。然后用洗衣粉水洗刷干凈為止。

（三）干燥

洗凈的玻璃器皿倒置于清潔的木架上或鋪有清潔紗布的平臺(tái)上，令其自然干燥。若急需使用，可將玻璃器皿放入50℃左右干燥箱中迅速烘干，但溫度不宜太高，以免玻皿破裂。玻皿干燥后，用干凈的綢布拭去干后的水跡，玻片干燥后，保存在清潔容器內(nèi)，或浸于95%酒精中，使用時(shí)再用軟布擦去。

（四）包裝

如玻璃器皿需要滅菌，應(yīng)于滅菌前將玻璃器皿妥善包裝，以免滅菌后被環(huán)境中的雜菌污染。

1、平皿的包裝：將平皿用紙嚴(yán)密包好，一副或數(shù)副包成一包，或放入金屬盒（筒）內(nèi)直接進(jìn)行滅菌。

2、吸管的包裝：吸管包裝前，應(yīng)先用細(xì)鐵絲塞少許棉花于吸管口端距管口約半寸處，將吸管一一分別用紙包好，然后大紙將數(shù)只吸管包成一束，也可將包好的吸管置于金屬筒中進(jìn)行滅菌。

3、試管和其他玻璃器皿的包裝：試管和其他玻璃器皿的開(kāi)口處必須包裝嚴(yán)密，加棉塞或直接用紙包扎。棉塞要松緊適度，既要易于撥出，又不能自行脫落為佳。

（五）滅菌

用于盛放無(wú)菌材料和細(xì)菌分離培養(yǎng)用的清潔玻璃器皿，使用前必須進(jìn)行滅菌。可用干熱滅菌或高壓蒸氣滅菌。

1、干熱滅菌：用干熱滅菌箱，通常在160℃溫度下處理2小時(shí)，溫度超過(guò)180℃時(shí)，棉塞和紙包易燒焦起火。器皿放入烘箱之前必須干燥，以免引起玻璃破碎，器皿在烘箱內(nèi)不宜過(guò)滿(mǎn)，應(yīng)留有一定空隙，滅菌后應(yīng)待溫度降至60℃以下時(shí)，才能開(kāi)門(mén)取器皿，否則玻璃可能因突燃遇冷而破碎。

2、高壓蒸氣滅菌：用高壓滅菌器，用15磅壓力處理20～30分鐘，壓力器指針上升至2～3磅時(shí)徐徐打開(kāi)氣門(mén)，排出滅菌器內(nèi)所存留的空氣，直至排出的蒸氣內(nèi)不夾雜空氣為止，然后關(guān)緊氣門(mén)，壓力上升至15磅時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)。高壓蒸氣滅菌后，玻璃器皿上常常有水珠，可再用烘箱（60～80℃）烘干。

五、無(wú)菌操作技術(shù)注意事項(xiàng)

1、為了避免外界環(huán)境中細(xì)菌的污染。在檢測(cè)過(guò)程中如傾注培養(yǎng)基平板、接種、移種、分離純菌、活菌記數(shù)、制備菌懸液等都要在無(wú)菌室內(nèi)進(jìn)行，如果沒(méi)有無(wú)菌室，要在酒精燈周?chē)?0厘米的無(wú)菌區(qū)內(nèi)操作。

2、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)必須保持整潔，除必要的設(shè)備和儀器外，其它物品都不應(yīng)放在室內(nèi)。每天清晨或試驗(yàn)工作結(jié)束后，均應(yīng)打掃衛(wèi)生，工作臺(tái)面，邊臺(tái)和桌椅等均用消毒溶液擦拭。

3、實(shí)驗(yàn)人員在進(jìn)入無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室前，必須穿戴整潔的工作衣帽和口罩，換鞋后才允許入內(nèi)。

4、在檢測(cè)工作中必須做到嚴(yán)格無(wú)菌操作防止污染和感染，使用的器械、容器和培養(yǎng)基等，必須要經(jīng)過(guò)滅菌。

5、在檢測(cè)工作中，不慎菌液滴在桌面或地面，或?yàn)R在其他物體上，必須立刻加以處理，污染的玻璃器皿和器械，可進(jìn)行高壓滅菌或在消毒液中進(jìn)行消毒。

suweitong

支持！希望能多發(fā)點(diǎn)東西上來(lái)，呵呵