三聚氰胺的各種檢測方法

ykou001

采用酶標(biāo)法（ELISA）進(jìn)行三聚氰胺檢測

本實驗方案采用Thermo Scientific的Multiskan MK3型酶標(biāo)儀和Wellwash 4MK2型洗板機(jī)，結(jié)合Abraxis三聚氰胺檢測試劑盒（由北京測迪科技有限公司提供），以競爭法測抗原的原理對液態(tài)奶或奶粉中的三聚氰胺進(jìn)行檢測分析。

一、樣品準(zhǔn)備

巴氏消毒全脂奶（液體）：
1）用稀釋液以1:10的比例稀釋牛奶樣品，如在900 μl的稀釋液中加入100 μl牛奶。
嬰幼兒配方奶粉：
1）按照配方奶粉的說明，以稀釋液溶解奶粉，如用60 ml稀釋液溶解8.6克奶粉。
2）用稀釋液以1:5的比例稀釋奶粉溶液

二、樣品檢測

1）試劑使用前，應(yīng)使其溫度恢復(fù)至室溫（25±2℃）
2）吸取100 μl標(biāo)準(zhǔn)品（0, 20, 50, 100, 200和500 ppb）和準(zhǔn)備好的樣品加入相應(yīng)的微孔中。然后，每孔再加入50 μl的三聚氰胺HRP酶標(biāo)記物。
3）利用MK3酶標(biāo)儀的振蕩功能，振板60秒，并在室溫下孵育30分鐘。
4）孵育完后，將微孔板轉(zhuǎn)移到Wellwash 4MK2洗板機(jī)上進(jìn)行洗板，每孔加250 μl洗液，洗板四次。
5）每孔加入100 μl顯色底物溶液，避光孵育20分鐘。
6）每孔加入100 μl終止液，終止顯色反應(yīng)。
7）在MK3酶標(biāo)儀上讀板，測量波長450nm。

三、結(jié)果分析

1）以濃度為0 ppb標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值為基準(zhǔn)（B0），歸一化標(biāo)準(zhǔn)品的檢測吸光值B/B0（B指除B0以外的標(biāo)準(zhǔn)品吸光值）。
2）繪制以標(biāo)準(zhǔn)品的B/B0為Y軸坐標(biāo)、對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為X軸坐標(biāo)的散點圖。
3）對該散點圖進(jìn)行直線擬合。以該擬合曲線的直線方程對待測樣品濃度進(jìn)行計算。
4）如果樣品吸光值大于最小標(biāo)樣的吸光值，則該樣品的濃度＜20 ppb；如果樣品吸光值小于最大標(biāo)樣的吸光值，則樣品的濃度＞500 ppb。
5）結(jié)合稀釋倍數(shù)，計算最終液態(tài)奶或奶粉中的三聚氰胺濃度，如液態(tài)奶稀釋倍數(shù)是10倍。

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高效液相色譜- 二極管陣列法測定
高蛋白食品中的三聚氰胺
Determination of melamine in high p rotein food by high
performance liquid chromatography2photodiode array detector
汪　輝   曹小彥   彭新凱 陳利國 黃　輝   譚　舸
(長沙市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測中心,湖南長沙　410013)
(Changsha Center of Supervision & Inspection on Food Quality Safety, Changsha, Hunan 410012, China)
摘要:建立用高效液相色譜- 二極管陣列法測定高蛋白食品
中的三聚氰胺的檢測方法。對不同樣品采用不同的前處理
方法,然后用Agilent TC2C18 4. 6 ×250 mm色譜柱,柱溫為
40 ℃,流動相為0. 02 mol/L硫酸銨∶甲醇= 94 ∶6 (V ∶V) ,
流速0. 8 mL /min,二極管陣列檢測器于235 nm 波長下進(jìn)行
檢測,并以保留時間和三維光譜圖相似性系數(shù)進(jìn)行定性,外
標(biāo)法定量。不同樣品的加標(biāo)回收率為98. 8% ～101. 5% ,
RSD小于1. 2%。方法線性范圍為0. 1～150μg/mL,檢測限
為0. 01μg/mL,相關(guān)系數(shù)R = 0. 999 9。
關(guān)鍵詞:高效液相色譜;二極管陣列檢測器;三聚氰胺;高蛋
白食品
Abstract:A high performance liquid chromatography2 photodiode array
detector for determining the content of melamine in high p rotein food was
studied. In this paper, different p re2treatments were used in different
samp les. A Agilent TC2C18 column was used with methanol and
0. 02 mol/L ammonium sulfate (94 ∶6, V ∶V) asmobile phase. The flow
rate was 0. 8 mL /min. A diode array detectorwas used and the detection
wavelength was 235 nm. Qualitative analysiswas performed with retention
time and DAD spectrum similarity index value and quantitative analysis
was performed with external standard method. The calibration curve was
linear over a range from 0. 1μg/mL to 150. 0μg/mL. The lowest detected
limit was 0. 01mg/kg. The recoveries of different samp les were from
98. 8% to 101. 5% and relative standard deviationswere less than 1. 0%
( n = 10) . The linearity was 0. 1 to 150μg/mL, detection limit of mela2
mine was 0. 01μg/mL and related coefficient was 0. 999 9.
Keywords:High performance liquid chromatogra phy; Photodiode array
detector;Melamine; High p rotein food
最近美國發(fā)生了許多貓狗寵物非正常死亡事件。美國
FDA經(jīng)過調(diào)查確認(rèn)是寵物食品的原料受非法添加的三聚氰
胺污染。含三聚氰胺的食物被動物食用后,可以使動物發(fā)生
腎衰竭并導(dǎo)致死亡。三聚氰胺(Melamine)即蜜胺,又稱氰尿
酰胺,是一種白色晶體,熔點354 ℃,難溶于水、乙二醇、甘油
和吡啶,略溶于乙醇,不溶于乙醚、苯和四氯化碳[ 1 ] 。按常規(guī)
三聚氰胺不可能通過環(huán)境污染的方式進(jìn)入食品原料中。通
常三聚氰胺只作為生產(chǎn)塑料樹脂的原料,其分子中含有大量
氮元素(見圖1) ,
不法分子在植物蛋白添加三聚氰胺,是因
為其分子中含氮量高達(dá)66. 7%。非法添加化工原料三聚氰
胺可以提高含氮量,冒充成高蛋白食品,從而大幅度降低成
本。用“凱氏定氮法”測飼料和食品中的粗蛋白質(zhì)的含
量[ 2 ] ,其實只是測氮的含量,再根據(jù)蛋白質(zhì)的含氮量(15% ～
17% )折算成蛋白質(zhì)。因此,通常情況下根本不能區(qū)分這種
“偽蛋白氮”。三聚氰胺在高溫下可能分解產(chǎn)生氰化物(有
較大毒性) ,故應(yīng)避免高溫。

圖1　三聚氰胺的結(jié)構(gòu)式
目前國內(nèi)外測定食品中三聚氰胺含量的方法很少,一般
采用氣相- 質(zhì)譜法[ 3 ]、液相- 質(zhì)譜法、液相色譜法[ 4, 5 ]等。本
試驗避開毒性大的乙腈,以甲醇和0. 02 mol/L硫酸銨作為流
動相,甲醇提取樣品,吹干后20%的甲醇水溶解并定容,進(jìn)
樣,用二極管陣列檢測器檢測,結(jié)果令人滿意。
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1　試驗材料與方法
1. 1　儀器與試劑
Waters1525高液相色譜儀:配2996二極管陣列檢測器、
717Plus自動進(jìn)樣器、Epower工作站;
超純水處理器:北京東西電子有限公司;
超聲清洗器:天津奧特賽恩斯儀器有限公司;
氮吹儀:天津市恒皇科技發(fā)展有限公司;
三聚氰胺(99 + % ) : SINGMA2ALDR ICH. INC;
硫酸銨(分析純) :上海試劑四廠;
甲醇(色譜純) :國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
1. 2　色譜條件
色譜柱為Agilent TC2C18 色譜柱( 250 mm ×4. 6 mm,
5μm i. d. ) ;柱溫為40 ℃;流速為0. 8 mL /min;流動相為硫
酸銨(0. 02 mol/L ) ∶甲醇= 94 ∶6 (V ∶V) ; 檢測波長為
235 nm;進(jìn)樣量10 mL[ 6 ]。
1. 3　標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備
精密稱取三聚氰胺對照品25. 0 mg 于100 mL 容量瓶
中,加20%的甲醇水溶解并稀釋至刻度, 搖勻, 使成為
250μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。精密吸取三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液
0. 5, 1. 0, 2. 0, 5. 0, 10. 0 mL,分別置于25 mL 容量瓶中,加
20%的甲醇水稀釋至刻度,搖勻,使成為濃度為5, 10, 20, 50,
100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)使用液,經(jīng)0. 45μm的濾膜過濾,按色譜條件
進(jìn)行分析測試(見圖2) 。以組分峰面積為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度
為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖2　標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖
1. 4　樣品處理
1. 4. 1　固體樣品　準(zhǔn)確稱取2. 0～5. 0 g固體樣品于50 mL
的比色管,超聲波提取30 min,放置冷卻后,用甲醇稀釋至刻
度,搖勻。靜置30 min后取上清液10 mL 氮吹至近干,用
20%甲醇水定容至10 mL,經(jīng)0. 45μm的濾膜過濾,待測。
1. 4. 2　液體樣品　準(zhǔn)確吸取5～10 mL液體樣品置于50 mL
比色管中,加入20%甲醇水40 mL,加入5%三氯乙酸5 mL,
用20%甲醇水稀釋至刻度,搖勻, 4 000～8 000 r/min離心
5 min,取上清液,經(jīng)0. 45μm的濾膜過濾,待測(見圖3) 。
2　結(jié)果與討論
2. 1　檢測波長的選擇與定性
取濃度為50μg/mL的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)使用液及某待檢樣
品,在200 ～400 nm波長處掃描, 發(fā)現(xiàn)三聚氰胺在200 ～
220 nm處有強(qiáng)烈的吸收,在234. 1 nm處有吸收峰(見圖4) ,
在235. 0處的吸收峰峰型對稱,存在的干擾少,且流動相在
低于210 nm的波長下背景吸收較高,故選用235. 0 nm為檢
測波長。樣品中成分復(fù)雜,可采用二極管陣列檢測器對其進(jìn)
行光譜掃描,并以保留時間和三維光譜圖相似性系數(shù)進(jìn)行定
性。
圖3　樣品的色譜圖
圖4　標(biāo)準(zhǔn)溶液的3D圖
2. 2　流動相的優(yōu)化
對不同流動相以及不同比例進(jìn)行了多次試驗。結(jié)果發(fā)
現(xiàn)用乙腈為流動相時,乙腈正好在三聚氰胺出峰處有背景吸
收,很難分離,且乙腈毒性大。采用硫酸銨( 0. 02 mol/L ) ∶
甲醇= 94 ∶6 (V /V) , 三聚氰胺與流動相甲醇的背景吸收完
全分開,且峰型對稱,出峰時間比較理想。
2. 3　沉淀劑的選擇
因為三聚氰胺有三個胺基,易與金屬離子絡(luò)合,采用
106 g/L亞鐵氰化鉀2 mL和219 g/L醋酸鋅沉淀蛋白質(zhì)2 mL
時,三聚氰胺會有損失,回收率僅為55%。三聚氰胺是酰胺
類物質(zhì),是可溶于三氯乙酸溶液的小分子。采用5%三氯乙
酸沉淀蛋白質(zhì)5 mL,效果非常理想,但時間不宜過長,避免三
聚氰胺包合于沉淀中,降低提取率。
2. 4　線性范圍與檢出限
在試驗條件下,用峰面積比對濃度繪制曲線,三聚氰胺
在0. 1～150μg/mL之間均具有良好的線性關(guān)系, 以基線噪
聲三倍峰面積對應(yīng)的三聚氰胺最低檢測限為0. 01 μg/mL,
回歸方程式為:
y = 2. 99 ×104x - 4. 00 ×103
相關(guān)系數(shù)R = 0. 999 9。
2. 5　精密度試驗
取三聚氰胺樣品加標(biāo)溶液做精密度試驗,按上述色譜條
件及試驗方法分別對50μg/mL和100μg/mL兩個不同濃度
的樣品加標(biāo)溶液進(jìn)行測定,重復(fù)進(jìn)樣10次, RSD小于1. 2% ,
說明該方法具有較高的精密度。
2. 6　回收率試驗
采用加標(biāo)測定回收率。取3種樣品各3份,分別加入一
定量的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。測定結(jié)果(見表1,已去本底值) 表
明:平均回收率基本在98. 8%～101. 5%之間,完全可以滿足
日常分析的要求。
3　結(jié)論
此方法樣品處理簡便易行、快速。同時利用二極管陣列
檢測器定性,成本低于質(zhì)譜,所測結(jié)果準(zhǔn)確度高,易于推廣,
適于測定高蛋白食品中的三聚氰胺。
參考文獻(xiàn)
1　王箴. 化工辭典(第四版) [M ]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2003, 3.
2　張亞飛,樂國偉,施用暉,等. 小麥蛋白Alcalase水解物免疫活性
肽的研究[ J ]. 食品與機(jī)械, 2006, 22 (3) : 44～46.
3　GC2MS Scerrn for the Presence ofMelamine and Cyanuric Acid [ S].
FDA /ORA Forensic Chemistry Center SOP T015, 2007.
4　Update FCC DevelopmentalMelamine Quantitation (HPLC2UV) [ S ].
FDA /ORA Forensic Chemistry Center SOP, 2007.
5　吳明禮,陳彩虹. 高效液相色譜法(HPLC)測定單氰胺中中三聚
氰胺的含量[ J ]. 寧夏石油化工, 2005 (2) : 24～26.
6　施奈德L R,格萊吉克J L,柯克蘭J J. 實用高效液相色譜法的建
立(第一版) [M ]. 北京:科學(xué)出版社, 2000, 5.

yxy0725

不實用，這些設(shè)備有幾個飼料廠有？普通的檢驗中心都未必有

銀狐

上傳一些可定性的檢測方法，經(jīng)濟(jì)適用

今宵酒醒何處

就是啊，普通的飼料企業(yè)根本不可能配有這些設(shè)備的，要控制原料質(zhì)量真有點紙上談兵的感覺。

jcq2008

還有沒有更實用的辦法啊。比如說，聞一下就知道了，:tiaotiao:

行者說飼

這就是中小企業(yè)的軟肋！

蛋白飼料原料的市場形勢是這樣的，

生產(chǎn)蛋白飼料的企業(yè)規(guī)模越大知名度越高產(chǎn)品越是供不應(yīng)求，

大型飼料企業(yè)本身有足夠的資金實力購置高檔的檢測設(shè)備，

同時對于原料采購有足夠的話語權(quán)，

這些優(yōu)質(zhì)的原料都自然而然的流入大企業(yè)，

所以大企業(yè)即便是沒有檢測設(shè)備，

只要他選擇和這些名牌蛋白飼料企業(yè)合作就沒有問題，

因為這些名牌企業(yè)的蛋白飼料產(chǎn)品供不應(yīng)求，

所以他沒有必要摻假可以保真。

而哪些中小企業(yè)最后的采購渠道就被壓縮，

被迫和一些經(jīng)銷商或小規(guī)模的蛋白飼料生產(chǎn)企業(yè)合作，

無疑增加了自己的風(fēng)險。

因為檢測設(shè)備的高昂價格，

小企業(yè)又不能去買，

因此就存在風(fēng)險。

molyzsl

聽說現(xiàn)在有一種快速檢測的方法，不知哪位可以提供？

王立水

最好有根簡便地方法。

ykou001

世衛(wèi)制定三聚氰胺攝入限額 每公斤體重0.2毫克
文章來源：東方早報     發(fā)表時間：2008-12-08 08:10:17
關(guān)鍵字：  三聚氰胺
　　世界衛(wèi)生組織日前制定了三聚氰胺每日攝取量最高標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為每公斤體重每日0.2毫克應(yīng)無危險。這就是說，一個體重50公斤的成年人每天如果攝取10毫克以下三聚氰胺，應(yīng)該不會有健康危險。

　　綜合新華社電等 世界衛(wèi)生組織(WHO)5日說，由于食品在生產(chǎn)、加工、包裝及運輸?shù)拳h(huán)節(jié)有時會被三聚氰胺污染，食品中含有微量三聚氰胺是不可避免的，因此該組織將這一化學(xué)物質(zhì)每日可容忍攝入量設(shè)定為每公斤體重0.2毫克（0.2mg/kg）。

　　微量三聚氰胺“不可避免”

　　據(jù)世界衛(wèi)生組織官方網(wǎng)站報道，該組織日前在加拿大渥太華就三聚氰胺問題舉辦了一個由食品安全專家參加的會議，與會的21位專家沒有確定三聚氰胺的“安全”攝入量，只是設(shè)定了一個“可容忍”攝入量，如果按照這一標(biāo)準(zhǔn)計算，一個體重為50公斤的成年人每天的三聚氰胺可容忍攝入量不應(yīng)超過10毫克。

　　不過專家們同時強(qiáng)調(diào)，三聚氰胺是工業(yè)用化學(xué)品，根本不應(yīng)該出現(xiàn)在食品之內(nèi)。他們還表示，從醫(yī)學(xué)角度而言，無法為食品制定三聚氰胺安全含量標(biāo)準(zhǔn)。

　　三聚氰胺無味低毒，常用于制造日用器皿、裝飾材料以及織物整理劑等。如果三聚氰胺加入兌水牛奶后可以提高其蛋白質(zhì)讀數(shù)以及濃稠度，掩蓋牛奶兌水的事實。

　　防止人為添加

　　世界衛(wèi)生組織糧食安全負(fù)責(zé)人約爾根·施倫德表示，希望這一標(biāo)準(zhǔn)能更好地指導(dǎo)各國衛(wèi)生部門采取有效措施，防止人為在食品中添加三聚氰胺的事件發(fā)生，以確保公眾健康。

　　被大量添加三聚氰胺的三鹿奶粉事件曝光后，三聚氰胺添加物丑聞席卷了中國整個乳品行業(yè)。根據(jù)中國衛(wèi)生部12月1日最新通報指出，截至11月27日8時，全國累計報告因食用三鹿牌奶粉和其他個別問題奶粉導(dǎo)致泌尿系統(tǒng)出現(xiàn)異常的患兒29萬余人。

　　10月初，衛(wèi)生部、工業(yè)和信息化部、農(nóng)業(yè)部、國家工商行政管理總局、國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局發(fā)布公告，公布了乳制品及含乳食品中三聚氰胺臨時管理限量值：嬰幼兒配方乳粉中三聚氰胺的限量值為1mg/kg；液態(tài)奶（包括原料乳）、奶粉、其他配方乳粉中三聚氰胺的限量值為2.5mg/kg；含乳15％以上的其他食品中三聚氰胺的限量值為2.5mg/kg。